Analisis Protein Dan Lemak 2013 [Compatibility Mode] (1)

ANALISIS PROTEINANALISIS PROTEIN

1Teti Estiasih-PS ITP-THP-FTP-UB

TUJUAN ANALISIS

• Menera jumlah protein dalam suatu bahan pangan

• Sifat protein yang diukur adalah kuantitas bukan kualitasbukan kualitas

• Pengukuran kualitas protein biasanya diawali dengan pengukuran kuantitas


PRINSIP ANALISIS PROTEIN

Analisis protein didasarkan pada:

• Pengukuran jumlah atau kadar N, karena komponen bahan pangan lain spt lemak dan KH tidak mengandung N, dan hanya sedikit komponen yang mengandung N dan dalam kadar rendahyang mengandung N dan dalam kadar rendah

• Reaksi spesifik suatu senyawa/reagen dengan ikatan peptida

• Reaksi spesifik asam amino tertentu dengan suatu reagen (misal metode Lowry: reaksi tirosin dan triptofan dengan fosfotsungtat-fosfomolibdat)


• Reaksi antara protein dengan suatu senyawa seperti metode fenol (protein bereaksi dengan fenol)

• Metode spektrofotometri: absorbsi spesifik protein pada panjang gelombang uv misal protein pada panjang gelombang uv misal 280 nm

• Turbidimetri: berdasarkan kekeruhan

• dll


1. METODE KJEDAHL

• Dikembangkan oleh Kjeldahl

• Peneraan empiris (tidak langsung)

• Yang diukur: kadar N• Yang diukur: kadar N

• Umumnya kadar N dalam protein adalah 16% sehingga kadar protein dalam suatu bahan=kadar NX100/16

• Nilai 100/16=6.25 adalah faktor konversi yang umum digunakan


FAKTOR KONVERSI

Persen N dalamProtein

FK

Telur atau daging 16,0 6.25

Susu 15,7 6,38Susu 15,7 6,38

Gandum 18,76 5,33

Jagung 17,70 5,65

Oat 18,66 5,36

Kedelai 18,12 5,52

Beras 19,34 5,17


KELEMAHAN

• Senyawa lain selain protein yang mengandung N terukur sebagai protein

• Misal senyawa bernitrogen: asam amino bebas, urea, amonia, asam nukleat, nitrit, bebas, urea, amonia, asam nukleat, nitrit, nitrat, amida, purin, pirimidin

• Oleh karena itu analisis dengan metode Kjeldahl disebut analisis protein kasar (crude protein)


TAHAPAN METODE KJELDAHL

Destruksi Destilasi Titrasi


TAHAP DESTRUKSI

• Tujuan melepaskan nitrogen dari protein

• Cara:

• Sampel dipanaskan dalam larutan asam sulfat pekat• Sampel dipanaskan dalam larutan asam sulfat pekat

• Unsur C dan H teroksidasi menjadi H2O, CO2, CO

• Unsur N berubah menjadi amonium sulfat (NH4)2SO4

• Asam sulfat juga mendestruksi KH dan lemak yang

mempengaruhi jumlah asam sulfat yang dibutuhkan


Destruksi

Asam sulfat

Protein (NH4)2SO4

panas, katalispanas, katalis


Katalisator

• Diperlukan untuk mempercepat proses destruksi

• Mempertinggi titik didih asam sulfat

• Suhu destruksi lebih tinggi (370-410 C)

• Jenis:• Jenis:

• Campuran Na2SO4 dan HgO (20:1)

• K2SO4

• CuSO4


Akhir destruksi

• Diakhiri ketika larutan menjadi jernih dan tidak berwarna

• Supaya analisis lebih akurat dibuat blanko • Supaya analisis lebih akurat dibuat blanko dengan menggunakan reagen tanpa sampel

• Dilanjutkan tahap distilasi


TAHAP DISTILASI

• Dilakukan dengan menambahkan NaOH

• Pada tahap ini amonium sulfat dipecah menjadi amonia

• Amonia yang dibebaskan ditampung dalam larutan asam standar biasanya HCl atau asam larutan asam standar biasanya HCl atau asam borat 4% yang jumlahnya berlebihan

• Untuk mengetahui jumlah asam berlebihan biasa ditambahkan indikator seperti BCG+MR (asam borat) atau PP (HCl)

• Akhir destilasi diketahui setelah cairan yang ditampung dalam larutan asam bersifat asam


Distilasi


TAHAP TITRASI-Larutan Penampung HCl

• Jika larutan asam penampung yang digunakan HCl, sisa asam klorida yang tidak bereaksi dengan amonia (membentuk NH4Cl) dititrasi dengan NaOH

• Jika digunakan indikator PP akhir titrasi adalah perubahan larutan menjadi merah muda permanen (dari asam ke basa) atau jika digunakan MR larutan berubah menjadi kuning

• Dibuat titrasi untuk blanko (tanpa sampel)


Perhitungan

%N = ml NaOH (blanko-sampel) X N NaOH X 14.008 X 100%

berat sampel (g) X 1000


TAHAP TITRASI-Larutan Penampung Asam Borat

� Jika larutan penampung adalah asam borat/HBO3

(asam lemah), banyaknya asam borat yang

bereaksi dengan amonia dapat diketahui dengan

titrasi dengan HCl 0.1 N dengan indikator MR+BCG

� HCl akan mentitrasi amonium-borat menjadi

amonium klorida sehingga pada akhir titrasi

terjadi kelebihan HCl/asam kuat

� Akhir titrasi ditandai dengan perubahan larutan

dari biru/hijau menjadi merah muda

Teti Estiasih-PS ITP-THP-FTP-UB 17

Perhitungan

%N = ml HCl (sampel-blanko) X N HCl X 14.008 X 100%

berat sampel (g) X 1000berat sampel (g) X 1000


PERHITUNGAN KADAR PROTEIN

• Dengan mengalikan kadar N dengan faktor konversi (FK), yaitu

Kadar protein (%) = Kadar N X FK


Keuntungan

Bisa digunakan untuk semua jenis sampel

Sederhana

Murah

Akurat: official method untuk protein kasar

Dimodifikasi menjadi Kjedahl Mikro untukjumlah sampel yang kecil


Kerugian

Mengukursemua N, tidakhanya N protein

Waktu lama (min 2 jam)

Presisi lebihrendah

dibandingkanmetode biuret

Reagen korosif


2. METODE BIURET

Pengukuran jumlah ikatan peptidadalam protein

Semakin tinggi kadar protein bahan, jumlah ikatan peptida semakin banyak

Dasar analisis: bahan yang mengandung ikatan peptidadua atau lebih membentuk kompleks berwarna ungudengan ion Cu2+/kupri pada kondisi alkali

Untuk analisis protein larut air (protein terlarut)


Senyawa Biuret


Reaksi Biuret


Reaksi Protein dengan Ion Kupri

(Reagen Biuret)


Senyawa yang Bereaksi dengan Ion Kupri

• Urea OC-NH-CO

• -CO-NH2

• -CH2-NH2• -CH2-NH2

• -CHN-NH2

• -CS-NH2


Keunggulan metode Biuret

Mengukur kadar protein sesungguhnya

Sederhana, cepat, dan murahSederhana, cepat, dan murah

Hanya sedikit senyawa lain yang mengganggu

Tidak mendeteksi nitrogen darisenyawa non peptida


Kekurangan

Kadar garamamonium yang tinggidapat menggangguanalisisanalisis

Warna bervariasitergantung jenisprotein, misal gelatin: merah muda-ungu


Preparasi sampel cair

• Sampel cair yang jernih: bisa langsung digunakan atau dilakukan pengenceran terlebih dahulu

• Sampel cair yang keruh atau mengandung • Sampel cair yang keruh atau mengandung senyawa pengganggu seperti glukosa:

�Protein diendapkan dengan TCA

� Endapan dicuci dengan eter dan eter dibuang

� Endapan dilarutkan dalam 4 ml air


Preparasi sampel padat

Sampel padat:

• Sampel dihancurkan

• Disaring• Disaring

• Disentrifusa

• Supernatan dianalisis

• Protein yang tertera adalah protein larut air


Cara analisis

Pembuatankurva standar

Penetapansampel

Peneraandengan

spektrofotometriPerhitungan


3. KADAR N-AMINO

(METODE TITRASI FORMOL)

Digunakan untu mengukur kadar N-amino

Dapat digunakan untuk mengukur tingkathidrolisis protein

Reaksi antara formol dengan gugus amino tetapi tidak dapat membedakan antaragugus amino dengan gugus amin yang lain


Prinsip analisis

• Larutan protein dinetralkan dengan basa NaOH

kemudian ditambah formalin

• Formalin akan bereaksi dengan gugus amino dari

protein atau asam amino membentuk dimethilolprotein atau asam amino membentuk dimethilol

• Gugus karboksil tetap bebas (COOH)

• Gugus karboksil bebas ditentukan jumlahnya

dengan titrasi menggunakan larutan NaOH


Soal

1. Metode analisis protein mana yang tepat untuk mengukur protein pada sampel berikut:

a. Kecapa. Kecap

b. Yoghurt

c. Tempe

d. Kedelai

e. Susu cair

f. Susu bubuk34Teti Estiasih-PS ITP-THP-FTP-UB

2. Apa fungsi dari tahapan berikur pada analisis protein dengan metode Kjedahl:

a. Destruksi

b. Destilasi

c. Titrasi

3. Sampel susu bubuk dianalisis dengan metode Kjedahldengan titrasi menggunakan HCl. Jika normalitas HCl yang digunakan untuk titrasi adalah 0,1142 N, berat sampel yang digunakan 1,015 g, serta volumeHCl setelah dikurangivolume HCl untuk blanko adalah 22,5 ml. Berapa kadarprotein berat basah dan berat kering jika kadar airnya 8%?


ANALISIS LEMAKANALISIS LEMAK


Ekstraksipelarut

PENENTUAN KADAR LEMAK

pelarut

Ekstraksi non pelarut


Bahan basah perludikeringkan terlebih

dahulu pada suhu rendahuntuk menghindarioksidasi lemak

Dipengaruhi ukuranpartikel, perlupenggilingan/penghancuran

EKSTRALSI PELARUT-Preparasi sampel

Bahan yang lunak sepertikelapa perlu diparut

Bahan dapatdihancurkan dengan

mortar yang diberi pasir


Lemak dapatEkstraksi Biasa diberi

SAMPEL DENGAN LEMAK BERIKATAN DENGAN

KOMPONEN LAIN

Lemak dapatberikatan

dengan KH atauprotein

Ekstraksidengan pelarut

non polar menjadi tidak

efisien

Biasa diberiperlakuan

hidrolisis asamkemudiandikeringkan


Pelarut yang umum digunakanpetroleum eter atau etil eter

PE lebih disukai karena bersifat

PELARUT

PE lebih disukai karena bersifatselektif

Etil eter merupakan pelarut yang lebih baik untuk lemak tetapieksplosif, mahal, mudah terbakar


1. Sampel dibungkus dengan kertas saring dengan cara tertentu

2. Sampel dapat dicampur dengan pasir yang tidak berlemak untuk mencegah penggumpalan sampel

Ekstraksi Pelarut – Metode Soxhlet

mencegah penggumpalan sampel atau meningkatkan efisiensi ekstraksi

3. Sampel diletakkan dalam flask/labu soxhlet kemudian diisi dengan pelarut

4. Labu soxhlet dipasang dalam alat pemanas yang dilengkapi dengan kondensor


5. Labu penampung dipasang

6. Dilakukan pemanasan

7. Lemak akan larut dalam pelarut dan menuju labu penampung

8. Pelarut akan diuapkan dan berkondensasi kemudian mengekstrak sisa lemak dalam kemudian mengekstrak sisa lemak dalam labu soxhlet

9. Ekstraksi dilakukan berulang-ulang sampai pelarut berwarna jernih

10. Jumlah lemak dalam labu penampung ditera setelah sisa pelarut diuapkan



1. Berapa kadar lemak sampel, jika berat sampel

yang digunakan untuk analisis lemak metode

soxhlet adalah 6,46 g dan setelah lemak diekstraksi,

berat sampel dengan labu soxhlet adalah 17,84 g.

Berat labu soxhlet saja adalah 16,80 g.

Soal

2. Untuk menentukan kadar lemak dari pangan semi

basah, sampel pertama kali di oven vakum. Kadar

air produk adalah 25%. Kadar lemak dalam

sampel kering yang ditentukan dengan metode

soxhlet adalah 13,5%. Hitung kadar lemak dari

sampel semi basah!


Digunakan untuk menentukan kadarlemak susu

Asam sulfat ditambahkan pada susudalam botol Babcock

Asam sulfat menghidrolisis protein,

Ekstraksi Non Pelarut - Metode Babcock

Asam sulfat menghidrolisis protein, menghasilkan panas dan melepaskanlemak

Sentrifugasi dan penambahan air menyebabkan lemak terpisah

Lemak diukur secara volumetrik, akantetapi hasilnya dinyatakan sebagaipersentase berat



KARAKTERISASI LEMAK/MINYAKKARAKTERISASI LEMAK/MINYAK


Merupaka perbandingan kecepatan cahayadiudara dengankecepatan cahaya dalamminyak

Sampel diukur pda suhu 20-25C untuk minyakatau 40C untuk lemak

1. INDEKS REFRAKSI

Minyak tertentu mempunyai indeks refraksitertentu

Digunakan untuk mengontrol hidrogenasi, identifikasi (karena minyak/lemak tertentumempunyai indeks refraksi tertentu), dankemurnian minyak/lemak


• Mengukur warna lemak/minyak

• Metode: Lovibond atau spektrofotometri

• Lovibond: minyak ditempatkan dalamtabung uji dan dibandingkan dnegan warna

2. Warna

kuning-merah

• Spektrofotometri• Sampel suhu 25-30C dimasukkan kuvet

• Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 460, 550, 620, dan 670 nm

• Dinyatakan sebagai indeks warna fotometrik =

1,29(A460)+69,7(A550)+41,2(A620)-56,4(A670) 49

Teti Estiasih-PS ITP-THP-FTP-UB



3. Bilangan iodin

Menunjukkan ketidakjenuhanminyak/lemak

Prinsip: iodin bereaksi dengan ikatanrangkap pada minyak/lemak

Bilangan iodin: gram iodin yang diabsorpsi per gram minyak/lemak

Semakin tinggi bilangan iodin, minyak/lemak semakin tidak jenuh

Prosedur dengan titrasi52Teti Estiasih-PS ITP-THP-FTP-UB

4. Bilangan penyabunan

53


Bilangan penyabunanmenunjukkan jumlah alkali yang dibutuhkan untuk

menyabunkan lemak/minyak

Dinyatakan sebagai jumlahKOH (mg) yang dibutuhkanuntuk menyabunkan 1 g

KOH (mg) yang dibutuhkanuntuk menyabunkan 1 g sampel minyak/lemak

Merupakan indeks yang menunjukkan berat molekulrata-rata dari trigliserida

54


• KOH berlebih dalam alkohol ditambahkan pada

lemak/minyak

• Kelebihan KOH dititrasi dengan HCl

Bilangan penyabunan:

(B-S) X N X 56,1

Prosedur

(B-S) X N X 56,1--------------Berat sampel

B = titrasi blanko (ml)

S = titrasi sampel (ml)

N = normalitas HCl

56,1 = BM KOH55Teti Estiasih-PS ITP-THP-FTP-UB

Kadar asam lemak bebas menunjukkan asam lemak yang terbentuk akibat hidrolisis

Kadar asam lemak bebas merupakan persentase berat asamlemak (dinyatakan dengan asam lemak tertentu)

5. KADAR ASAM LEMAK BEBAS

lemak (dinyatakan dengan asam lemak tertentu)

Bilangan asam dinyatakan sebagai mg KOH yang dibutuhkanuntuk menetralkan asam lemak bebas yang ada dalam 1 g sampel

Kadar asam lemak bebas: persentase (b/b) asam lemak bebasyang ada dalam sampel


Reaksi hidrolisis lemak/minyak


• Merupakan metode yang umum digunakan untuk mengukur tingkat oksidasi lemak/bahan berlemak

• Menunjukkan produk oksidasi primer

• Didasarkan pada metode iodometri

• PV ditentukan dengan mengukur jumlah iodin yang

6. BILANGAN PEROKSIDA

• PV ditentukan dengan mengukur jumlah iodin yang dibebaskan dari larutan KI jenuh oleh lemak/minyak yang dilarutkan dalam campuran asam asetat glasial:kloroform (2:1)

• Iodin yang dibebaskan dititrasi dengan natrium tiosulfat

• Bilangan peroksida dinyatakan sebagai miliekuivalen peroksida-oksigen per kg lemak


• Merupakan metode untuk mengukur tingkat oksidasi yang menunjukkan produk oksidasi sekunder

• Produk oksidasi bereaksi dengan asam tiobarbiturat membentuk warna

7. BILANGAN TBA

tiobarbiturat membentuk warna

• Bilangan TBA menunjukkan produk oksidasi dari asam lemak tidak jenuh terutama asam linolenat

• Warna yang terbentuk hasil reaksi antara 2 molekul TBA dengan satu molekul malonal dialdehida


Documents

Analisis Protein Dan Lemak 2013 [Compatibility Mode] (1)