ANÁLISIS DE ALIMENTOSPROGRAMA - CALENDARIO

(Semestre 08 - 1)

Ju 27 Septiembre Proteína cruda.Ma 2 Octubre Proteína soluble.Ju 4 Alimentos ricos en proteínas. Leche y huevo Seminarios:

Antibióticos en leche.Ma 9 Carne y productos cárnicos.Ju 11 Seminarios Nitratos y nitritos, Trimetilamina, Anabólicos.Ma 16 OCTUBRE 3a EVALUACION PARCIAL

Ma 23 Carbohidratos. Métodos generales.Ju 25 Polisacáridos. Seminarios Almidón y Celulosa.Ma 30 Fibra.Ma 6 Noviembre Alimentos ricos en carbohidratos. Azucares y mieles.Ju 8 Cereales y sus derivados. Seminario Aflatoxinas,

Pruebas reológicas de las masasMa 13 Componentes asociados a cereales. Seminarios.

Mejoradores y blanqueadores, Vitaminas complejo B.JU 15 NOVIEMBRE 4a EVALUACION PARCIAL

ALIMENTO

VOLATIL POR SECADO(HUMEDAD) MATERIA SECA

ORGANICA INORGANICA(CENIZAS)

CON NITROGENO(PROTEINAS)

SOLUBLE EN DISOLVENTESORGANICOS

(GRASA O LIPIDOS)

NO GRASO SIN NITROGENO(CARBOHIDRATOS)

NO DIGERIBLES(FIBRA)DIGERIBLES

ANALISIS DE CARBOHIDRATOS

1. Calidad Nutricional

2. Estabilidad química

3. Verificación de la calidad

4. Control de procesos, etc.

A) Tecnólogo: Métodos rápidos, simples y reproducibles, para controlar la calidad final del producto.

B) Asesores: Rápidos, sin equipo especializado y que puedan ser aplicados en diferentes condiciones.

C) Nutricionistas: Conocimiento detallado del contenido de diferentes carbohidratos, por su efecto metabólico.

DESARROLLO DEL ANALISIS DE CARBOHIDRATOS

El análisis de cualquier constituyente esta limitado al conocimiento de su química.

�Químicos farmacólogos y médicos, en el descubrimiento de nuevos medicamentos naturales.

�Estudios de análisis elemental por técnicas de combustión, considerando al C como fuente principal de energía.

�Análisis proximal de Weende (1860), cuantificación de carbohidratos por diferencia, después de determinar humedad, proteína, grasa, cenizas y material no digerible (fibra cruda).

Las industrias de refinación del azúcar, la cervecera y la de vinos, interesadas en métodos para la cuantificación directa de azucares solubles. Métodos empíricos avalados en 1897 por la “International Commission on Uniform Methods of Sugar Analysis”(ICUMSA).

Principalmente refractometría, polarimetría, gravedad específica

y métodos para reductores.

�A principios del siglo XX se hacen intentos para medir azucares directamente, usando métodos para reductores.

�Clasificación en digeribles y no-disponibles, 1936, con problemas metodológicos que subestiman el contenido total, cuando se encuentra sacarosa.

�Ante las dificultades en la cuantificación directa, un comité sobre requerimientos energéticos de la FAO, en 1947, recomienda que se evite el uso del método “por diferencia” y solicita se realicen esfuerzos para desarrollar métodos adecuados para cuantificarlos directamente.

�El impacto de la bioquímica analítica y las aplicaciones de los sistemas de cromatografía inician una nueva era en el análisis de carbohidratos (1960).

�El desarrollo de sistemas de HPLC (1980), abre una nueva etapa en el campo.

CARBOHIDRATOS EN ALIMENTOS

•- Mezclas complejas.

•- Interacción con otros componentes.

•- Diversas características físicas y fisicoquímicas.

•- Ampliamente distribuidos.

CLASIFICACION DE CARBOHIDRATOS EN ALIMENTOS

a) Carbohidratos Disponibles o Digeribles

Azúcares (solubles)

Dextrinas y Almidones

b) Carbohidratos No-disponibles o No-digeribles

(Fibra, Fibra Dietética).

Celulosa

Hemicelulosa

Pectinas

+ Lignina (NO ES CARBOHIDRATO)

METODOS GENERALES

1. Los más desarrollados son para los azucares, principalmente monosacáridos

2. En principio los polisacáridos podrían ser analizados con los mismos métodos, una vez hidrolizados totalmente

Si solo se desea conocer la presencia o no de carbohidratos se puede realiza una detección cualitativa

Prueba de Molish.

- Hidrólisis y deshidratación con H2SO4

- Condensación con a-naftol. Coloración púrpura.

ANALISIS DE CARBOHIDRATOS SOLUBLES (AZUCARES)

DETECCION DE AZUCARES SOLUBLES

1. Prueba de Benedict.- Azúcares reductores.- Cobre en medio alcalino.- Formación de óxido cúprico.- Precipitado color ladrillo.

2. Prueba de Barfoed.

- Monosacáridos reductores.

- Acetato de cobre en medio ácido.- Precipitado rojo de óxido cuproso.

3. Prueba de Saliwanoff.- Ceto-azúcares (Fructosa)- Resorcinol en HCl- Deshidratación y condensación.- Coloración rojo-púrpura.

4. Prueba de Bial.- Pentosas- Orcinol con cloruro férrico en HCl.- Deshidratación y condensación.- Coloración verde.

PREPARACION DE LA MUESTRA- Azucares en solución.- Extracción de azucares.

AZUCARES EN SOLUCION Remoción de interferencias:a) Gases disueltos.b) Pigmentos y compuestos coloridos

. Carbón activado.

. Clarificación (sales de plomo).c) Proteínas:

. Solventes orgánicos.

. Arrastre con un precipitado inorgánicod) Sustancias reductoras

. Intercambio iónico.

EXTRACCION DE AZUCARES

-Soluciones acuosas. Muchas interferenciasSalesÁcidosProteínas y aminoácidos

- Soluciones alcohólicas:. Etanol 70 - 75%.. Etanol en dos pasos:

1) 50% en un baño de agua a ebullición.2) Precipitación de proteínas y polisacáridos ⇑ al 95%.

. Metanol 85% en reflujo.

. Isopropanol 40% TA (alimentos preparados).

CUANTIFICACION DE AZUCARES LIBRES

A. METODOS FISICOS1. Solubilidad.2. Gravedad específica.3. Indice de refracción.4. Rotación óptica. Polarimetría.

B. METODOS QUIMICOS1. Propiedades Reductoras.2. Reacciones de Condensación.3. Reacciones de Substitución.

C. METODOS BIOQUIMICOS1. Enzimáticos2. Microbiológicos

A. METODOS FISICOS

SOLUBILIDAD- Alta solubilidad en agua.Sol. alcohol 80% calientes.

- Estimación gravimétrica ú otro método físico.- Poco específico (azúcares solubles totales).

GRAVEDAD ESPECIFICA- Utiliza higrometros calibrados en °Bx (w/w en %)- Método estandarizado para sol. puras de sacarosa.- Da resultados aproximados para otros azúcares.- Rápido.

INDICE DE REFRACCIÓN- Estandarizado para sol. puras de azúcares.- Azúcares solubles totales.- Poco específico.

ROTACION OPTICA (POLARIMETRIA)- Utilizando luz de longitud de onda fija. - Actividad óptica de los azúcares libres.- Cuidado con la mutarotación- Interferencias por subs. ópticamente activas.

TODAS:- Altamente dependientes de la temperatura.IR Y POLARIMETRIA:- Requieren de soluciones clarificadas.

La desviación de la luz polarizada puede ser hacia la derecha (substancias dextrógiras) o hacia la izquierda (levógiras) y se indica con + o – respectivamente.

ROTACIÓN OPTICA DE ALGUNOS AZUCARES

Glucosa o DEXTROSA +52.7

Fructosa o LEVULOSA -92.4

Sacarosa +66.5

Al hidrolizarse la sacarosa, la mezcla (Glu + Fru) desvía la luz polarizada hacia la izquierda (-20): AZUCAR INVERTIDA y la enzima que cataliza la reacción es conocida como INVERTASA.

B. METODOS QUIMICOS

PROPIEDADES REDUCTORASEn medio alcalino reducen rápidamente a iones oxidantes como Ag+, Hg2+, Cu2+ y Fe(CN)6 debido a que la molécula se deshidrata y se produce enolización.

H-C=0 OH | |

H-C-OH NaOH H-C-O-Na+| → |

HO-C-H -2H2O C-OH| ||

H-C-OH C-H| |

H-C-OH C-OH| ||

CH2-OH H-C|CH2-OH

ENEDIOL O REDUCTONA

AZUCAR ENEDIOLES-OH Cu+ + AZUCARES ACIDOS

Cu2+ Cu(OH)2

H2O

Cu2O pp rojo ladrillo

METODOS QUE UTILIZAN SALES DE COBRE

- Lane-Eynon (Método de Fehling) Volumétrico. 1-5 mg/ml.La solución de azúcar se coloca en la bureta y “titula” al cobre con calentamiento continuo y azúl de metileno como indicador.Para el cálculo se requiere “calibrar” al reactivo con una solución de concentración conocida, para generar “un factor” expresado en peso.

factor (mg)C (mg/mL) =

volumen (mL)

- Munson & Walker. Gravimétrico. 0.1-5 mg/ml

- Nelson-Somogyi. Colorimétrico (arsenomolibdato).50-300 mg/ml.

OTROS METODOS REDUCTORES (Colorimétricos):

a) Ferrocianuro alcalino → Azul de Prusia1-10 mg/ml.

b) Trifenil tetrazolio → Trifenil formazan10-100 mg/ml.

c) Acido dinitro salicílico (DNS) → Compuesto colorido0.2-2 mg/ml.

Los métodos de reductores requieren del grupo carbonilo libre para la formación del enediol.

TODOS los monosacáridos son reductores

Los oligo y polisacáridos generalmente tienen UN grupo reductor, al quedar libre el carbono 1 del monosacárido de uno de los extremos.

Maltosa

Glucosa

Glucosa

Lactosa

α

H

OH

Almidón (amilosa)

La SACAROSA NO TIENE EXTREMO REDUCTOR ya que los dos carbonos que soportan al grupo carbonilo estaninvolucrados en el enlace glucosídico.

Sacarosa

Para determinar sacarosa con los métodos de reductores se requiere la hidrólisis ácida o enzimática.

Acida:- baño maría a 60°C, 10 min y reposo 30 min a 35°C- 16 - 18 hs a t.a. - 30 seg en ebullición

Enizimática:- Invertasa

Si sólo hay sacarosa en la muestra el resultado es directo.

Si hay mezclas de sacarosa y otros azúcares se debe realizar unadeterminación ANTES de hidrolizar (reductores directos).

Sacarosa = Reductores después – Reductores antes

1. Si la calibración se hace con sacarosa hidrolizada en las mismas condiciones el resultado es directo

2. Si la calibración se hace con una mezcla equimolecular de glucosa y fructosa, el valor debe ser corregido:

H2O

SACAROSA GLUCOSA + FRUCTOSA

PM 342 PM 180 PM 180

342g sacarosa= 0.95

380g glu+fru

REACCIONES DE CONDENSACIONEn medios fuertemente ácidos los monosacáridos se deshidratan y forman derivados del furfural que pueden condensarse con compuestos fenólicos.

Furfural y derivadosCH2OH

C O

C HHO

C OHH

C OHH

CH2OH

CHO

C

C HHO

C OHH

C OHH

CH2OH

OHH

5-(hidroximetil)-2-furaldehido

AldohexosaO

C CH2OHOH

-H2O-H2O

HMF

- Deshidratación con H2SO4 conc.- Condensación con fenol

- Producto color amarillo- Pentosas 480 nm.- Hexosas 490 nm.

- 10-100 µg/ml

Las mismas condiciones ácidas producen la hidrólisis de TODOS los enlaces glucosídicos, por lo que puede ser usado para carbohidratos totales.

REACCIONES DE SUSTITUCION

Grupos hidroxilo involucradosEspecialmente importantes para conocer estucturas y formar derivados que son utilizados para otras determinaciones.

a) Formación de éteres. Eteres metílicos y Trimetilsilanos para CFV

b) Formación de ésteres. Derivados acetilados.

C. METODOS BIOQUIMICOS

a) Reacciones enzimáticasb) Fermentación diferencial con levaduras.

REACCIONES ENZIMATICAS- Son muy específicas- No requieren la separación de los azúcares- Generalmente son reacciones acopladas.

GLUCOSA

1. Glucosa oxidasa/peroxidasa (Glucostat). 10-100 mg/ml

G.O.Glu + O2 → Ac. glucónico + H2O2

P.O.H2O2 + o-dianisidina → Color (540 nm)

2. Hexoquinasa/glucosa-6-P deshidro. 0.1-1.0 mg/ml

HKGlu + ATP → G-6-P + ADP

GPDG-6-P → 6-P-Gnato

NADP NADPH(340 nm)

También se puede cuantificar fructosa, adicionando fosfogluconato isomerasa (FGI)

HKFru + ATP → F-6-P + ADP

FGIF-6-P → G-6-P

GPDG-6-P → 6-P-Gnato

NADP NADPH(340 nm)

SACAROSA1.Hidrólisis con b-fuctosidasa (invertasa).

InvertasaSac → Glu + Fru

2. Cuantificación de glucosa y/o fructosa o midiendo aumento del poder reductor.

MALTOSA1. Hidrólisis con α-glucosidasa (maltasa)

αααα-gluMal → 2 Glu

2. Cuantificación de glucosa o aumento del poder reductor.

LACTOSA

1. Hidrólisis con β-galactosidasa (lactasa).

β-galLac → Glu + Gal

2. Cuantificación de glucosa o galactosa con galactosa oxidasa, o galactosa deshidrogenasa (GalDH).

GalDHGal → Galactolactona

NAD+ NADH

FERMENTACION DIFERENCIAL

- Diferenciación de isómeros D- y L- (Los microorganismos sólo utilizan D-azúcares como fuente de carbono.)

- Diferenciación de azúcares. Cepas con requerimientos específicos de fuentes de carbono.

ANÁLISIS DE ALIMENTOSPROGRAMA - CALENDARIO

(Semestre 08 - 1)

Ju 27 Septiembre Proteína cruda.Ma 2 Octubre Proteína soluble.Ju 4 Alimentos ricos en proteínas. Leche y huevo Seminarios:

Antibióticos en leche.Ma 9 Carne y productos cárnicos.Ju 11 Seminarios Nitratos y nitritos, Trimetilamina, Anabólicos.Ma 16 OCTUBRE 3a EVALUACION PARCIAL

Ma 23 Carbohidratos. Métodos generales.Ju 25 Polisacáridos. Seminarios Almidón y Celulosa.Ma 30 Fibra.Ma 6 Noviembre Alimentos ricos en carbohidratos. Azucares y mieles.Ju 8 Cereales y sus derivados. Seminario Aflatoxinas,

Pruebas reológicas de las masasMa 13 Componentes asociados a cereales. Seminarios.

Mejoradores y blanqueadores, Vitaminas complejo B.JU 15 NOVIEMBRE 4a EVALUACION PARCIAL