BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Trần Thị Nga

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VILDAGLIPTIN

TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG SẮC KÝ LỎNG

KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Hà Nội – 2021

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Trần Thị Nga

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VILDAGLIPTIN

TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG SẮC KÝ LỎNG

KHỐI PHỔ

Chuyên ngành: Hoá phân tích

Mã số: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: TS. Dương Tuấn Hưng

Hướng dẫn 2: TS. Tạ Mạnh Hùng

Hà Nội – 2021

i

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,

kết quả trong luận văn là trung thực. Những kết luận của luận văn chưa công

bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2021

Tác giả

Trần Thị Nga

ii

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ sự kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Dương Tuấn Hưng

và TS. Tạ Mạnh Hùng đã tận tình hướng dẫn và quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt

quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô công tác tại Học Viện Khoa Học

và Công Nghệ đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường.

Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu tại Viện.

Tôi xin chân thành cảm ơn tới toàn thể cán bộ của Trung tâm đánh giá

Tương đương sinh học – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã chia sẻ và

giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã

giúp đỡ và động viên để tôi có đủ nghị lực, quyết tâm hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2021

Học viên

Trần Thị Nga

iii

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

Từ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng việt

AN Analyte Chất phân tích

AUC Area Under the Curve Diện tích dưới đường cong

CC Calibration Curve Đường chuẩn

CV Coefficient of Variation Hệ số biến thiên

Cmax Maximum Concentration Nồng độ đỉnh

CTPT Molecular Formula Công thức phân tử

DĐH Pharmacokinetics Dược động học

EMA European Medicines Agency Cơ quan quản lý thuốc Châu

Âu

ESI Electrospray Ionization Ion hóa kiểu phun điện

GLP Good Laboratory Practices Thực hành tốt phòng thí

nghiệm

HD Hạn dùng

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HQC High Quality Control Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao

HQCS High Quality Control

Stability

Mẫu kiểm tra độ ổn định ở

nồng độ cao

HT Plasma Huyết tương

iv

HTT Blank Plasma Huyết tương trắng

KLPT Molecular Weight Khối lượng phân tử

IS Internal Standard Chất chuẩn nội

LC-MS Liquid Chromatography –

Mass spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ

LC-MS/MS Liquid Chromatography –

Tandem Mass Spectrometry Sắc ký lỏng hai lần khối phổ

LLE Liquid – Liquid Extraction Chiết lỏng – lỏng

LLOQ Lower Limit of

Quantification Giới hạn định lượng dưới

LQC Low Quality Control Mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp

LQCS Low Quality Control

Stability

Mẫu kiểm tra độ ổn định ở

nồng độ thấp

MeCN Acetonitril

MeOH Methanol

m/z Mass to charge ratio Khối lượng/điện tích

MF Matrix Factor Hệ số nền mẫu

MQC Middle Quality Control

Samples

Mẫu kiểm tra ở nồng độ

trung bình

MRM Multiple Reaction

Monitoring Đo chọn lọc đa ion

NTN Người tình nguyện

v

NRTI Nucleoside Reverse

Transcriptase Inhibitor

Thuốc ức chế enzyme sao

chép ngược nucleosid

PPT Protein Precipitation

Technique

Kỹ thuật kết tủa protein hay

Kết tủa protein

PTHQ Regression Equation Phương trình hồi quy

QC Quality Control Mẫu kiểm tra

QCP Quality Control Plan Kế hoạch quản lý chất lượng

SĐK Số đăng kí

SKD Bioavailability Sinh khả dụng

SDS Sodium Dodecyl Sulfate Natri dodecyl sulfat

SKĐ Sắc ký đồ

SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn

SST System Suitablity Test Độ thích hợp của hệ thống

TBME Tert butyl methyl ether

TĐSH Bioequivalence Tương đương sinh học

Tmax Thời gian đạt nồng độ thuốc

tối đa trong máu

tR Retention Time Thời gian lưu

TB Mean Trung bình

ULOQ Upper Limit of

Quantification Giới hạn định lượng trên

vi

US-FDA

The United States – The

Food and Drug

Administration

Cơ quan Quản lý Thực phẩm

và Dược phẩm Hoa Kỳ

VKNTTW National Institute of Drug

Quality Control

Viện Kiểm nghiệm Thuốc

Trung Ương

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

WSS Working Standard Solutions Dung dịch chuẩn làm việc

vii

Danh mục các bảng

Bảng 1.1. Một số nghiên cứu định lượng VDG trong huyết tương người ....... 6

Bảng 2.1. Các chất chuẩn được sử dụng ....................................................... 19

Bảng 2.2. Cách chuẩn bị đường chuẩn trong huyết tương ............................. 25

Bảng 2.3. Cách chuẩn bị mẫu LLOQ trong huyết tương ............................... 25

Bảng 2.4. Cách chuẩn bị mẫu QC trong huyết tương .................................... 26

Bảng 3.1. Điều kiện nguồn ion hoá............................................................... 35

Bảng 3.2. Điều kiện sắc ký ........................................................................... 41

Bảng 3.3. Điều kiện khối phổ định lượng VDG và IS ................................... 42

Bảng 3.4. Kết quả đánh giá sự phù hợp của hệ thống ................................... 44

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng tR của VDG và IS .. 47

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát đường chuẩn theo mô hình weighting 1/x2......... 48

Bảng 3.7. Tín hiệu đo pic của mẫu LLOQ và mẫu Zero tại tR của VDG ....... 50

Bảng 3.8. Độ đúng, độ chính xác của mẫu LLOQ ........................................ 50

Bảng 3.9. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu .................................... 52

Bảng 3.10. Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo ................................................. 53

Bảng 3.11. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày......................... 54

Bảng 3.12. Độ lặp lại khi tiêm lại ................................................................. 55

Bảng 3.13. Độ đúng, độ chính xác khi pha loãng .......................................... 57

Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ thu hồi của IS ............................................. 58

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ thu hồi của VDG......................................... 59

Bảng 3.16. Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn gốc VDG theo thời gian .... 61

Bảng 3.17. Kết quả độ ổn định dung dịch nội chuẩn gốc theo thời gian........ 62

Bảng 3.18. Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn gốc trong thời gian ngắn ... 62

viii

Bảng 3.19. Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn nội gốc trong thời gian ngắn

..................................................................................................................... 63

Bảng 3.20. Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 6 chu kỳ đông – rã ............ 64

Bảng 3.21. Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương trong thời gian ngắn ... 66

Bảng 3.22. Độ ổn định của mẫu huyết tương không kiềm hoá trong thời gian

ngắn bảo quản trong thùng đá (~ 4°C) .......................................................... 68

Bảng 3.23. Độ ổn định của huyết tương trong thời gian dài (77 ngày) .......... 70

Bảng 3.24. Kết quả độ ổn định của mẫu bảo quản trong autosampler ........... 71

Bảng 3.25. Kết quả nồng độ VDG trong huyết tương 01 NTN ..................... 74

ix

Danh mục các hình

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Vildagliptin ................................................. 3

Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo của thiết bị sắc ký lỏng khối phổ ............................... 9

Hình 1.3. Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập ba............. 11

Hình 3.1. Phổ khối của dung dịch chuẩn VDG với chế độ ESI (+) ............... 32

Hình 3.2. Cơ chế phân mảnh của Vildagliptin .............................................. 32

Hình 3.3. Giản đồ tối ưu điện thế bộ phận thu mẫu ...................................... 33

Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu huyết tương có chuẩn VDG, carbamazepin,

metoprolol, diltiazem ................................................................................... 34

Hình 3.5. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động

MeCN:amoni axetat 2mM (8:2) ................................................................... 36

Hình 3.6. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động

MeCN:amoni axetat 2mM (9:1) ................................................................... 36

Hình 3.7. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động

MeCN:amoni bicacbonat 1mM (95:5) .......................................................... 37

Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động

MeCN:amoni bicacbonat 1mM (90:10) ........................................................ 37

Hình 3.9. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động

MeCN:amoni bicacbonat 2mM (85:15) ........................................................ 38

Hình 3.10. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động

MeCN:amoni bicacbonat 2mM (80:20) ........................................................ 38

Hình 3.11. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG và IS với điều kiện tối ưu . 39

Hình 3.12. Quy trình xử lý mẫu .................................................................... 40

Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu huyết tương chứa VDG và IS tại chế độ ESI (+) . 43

Hình 3.14. Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng có pha IS và chuẩn VDG ở

nồng độ 288 ng/mL ...................................................................................... 44

Hình 3.15. Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng (Blank)............................. 45

x

Hình 3.16. Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng có pha IS (Zero) ............... 46

Hình 3.17. Sắc ký đồ của mẫu HTT có pha IS và chuẩn VDG nồng độ 3 ng/mL

(LLOQ) ........................................................................................................ 46

Hình 3.18. Đồ thị phần dư của các đường chuẩn thực nghiệm theo mô hình

weighting 1/x2 .............................................................................................. 48

Hình 3.19. Sắc ký đồ mẫu huyết tương NTN trước khi uống thuốc .............. 75

Hình 3.20. Sắc ký đồ mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc 1,33 giờ ... 76

Hình 3.21. Sắc ký đồ mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc 12 giờ ...... 76

Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc 24 giờ ...... 77

Hình 3.23. Đường cong nồng độ VDG trong mẫu huyết tương của NTN theo

thời gian ....................................................................................................... 77

xi

MỤC LỤC

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt ............................................................ iii

Danh mục các bảng ...................................................................................... vii

Danh mục các hình ........................................................................................ ix

MỤC LỤC .................................................................................................... xi

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ VILDAGLIPIN ....................................................... 3

1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất hoá lý ............................................... 3

1.1.2. Dược động học ................................................................................. 3

1.1.3. Một số phương pháp định lượng Vildagliptin ...................................... 5

1.2. SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ ................................................................ 8

1.2.1. Nguyên lý hoạt động của thiết bị phân tích khối phổ ........................ 8

1.2.2. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ ............................................................ 9

1.2.2.1. Bộ phận nạp mẫu ..................................................................... 9

1.2.2.2. Nguồn ion hoá ....................................................................... 10

1.2.2.3. Bộ phận phân tích khối .......................................................... 10

1.2.2.4. Bộ phận phát hiện (detector) .................................................. 12

1.2.2.5. Bộ xử lý dữ liệu ..................................................................... 12

1.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC 12

1.3.1. Kỹ thuật xử lý mẫu ......................................................................... 12

1.3.1.1. Kỹ thuật kết kết tủa protein (PPT) ......................................... 13

1.3.1.2. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng (LLE) ........................................... 13

1.3.1.3. Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) ................................................. 14

xii

1.3.2. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích thuốc trong dịch

sinh học .................................................................................................... 15

1.3.2.1. Độ chọn lọc ........................................................................... 15

1.3.2.2. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) ......................................... 15

1.3.2.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ....................................... 16

1.3.2.4. Ảnh hưởng của nền mẫu ........................................................ 16

1.3.2.5. Độ nhiễm chéo....................................................................... 17

1.3.2.6. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày .................... 17

1.3.2.7. Độ thu hồi .............................................................................. 17

1.3.2.8. Độ ổn định của hoạt chất trong dịch sinh học ........................ 18

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 19

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................. 19

2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU ......................................................................... 19

2.2.1. Hoá chất, chất chuẩn ....................................................................... 19

2.2.2. Mẫu huyết tương trắng ................................................................... 20

2.2.3. Dung môi, hoá chất ......................................................................... 20

2.2.4. Dụng cụ, thiết bị ............................................................................. 20

2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................. 21

2.3.1. Xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích trên

hệ thống LC-MS/MS ................................................................................ 21

2.3.1.1. Xây dựng điều kiện khối phổ xác định VDG và chuẩn nội .... 21

2.3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ...................................................... 22

2.3.1.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương ............................. 22

2.3.1.4. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích ............. 23

2.3.1.5. Phương pháp tính kết quả ...................................................... 26

xiii

2.3.2. Xác định nồng độ VDG trong mẫu huyết tương người tình nguyện 28

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 31

3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ................... 31

3.1.1. Điều kiện khối phổ và lựa chọn chuẩn nội để định lượng Vildagliptin

31

3.1.1.1. Điều kiện khối phổ định lượng Vildagliptin ........................... 31

3.1.1.2. Khảo sát lựa chọn chuẩn nội .................................................. 34

3.1.1.3. Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ ......................................... 35

3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ............................................................... 35

3.1.3. Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu huyết tương.................................. 40

3.1.4. Xây dựng phương pháp định lượng VDG trong huyết tương .......... 41

3.1.4.1. Quy trình xử lý mẫu huyết tương ........................................... 41

3.1.4.2. Điều kiện khối phổ ................................................................ 41

3.1.5. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp ..................................... 43

3.1.5.1. Sự phù hợp của hệ thống LC-MS/MS .................................... 43

3.1.5.2. Độ chọn lọc của phương pháp ............................................... 45

3.1.5.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ....................................... 48

3.1.5.4. Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ) .......................... 49

3.1.5.5. Ảnh hưởng của nền mẫu ........................................................ 51

3.1.5.6. Độ nhiễm chéo....................................................................... 52

3.1.5.7. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày .................... 53

3.1.5.8. Độ lặp lại khi tiêm lại ............................................................ 54

3.1.5.9. Độ đúng, độ chính xác khác khi pha loãng mẫu 2 lần ............ 56

3.1.5.10. Xác định độ thu hồi của chất phân tích và chuẩn nội ........... 57

3.1.5.11. Nghiên cứu độ ổn định......................................................... 60

xiv

3.2. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG VDG TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI

TÌNH NGUYỆN ........................................................................................ 73

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 79

4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................ 79

4.2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 81

PHỤ LỤC .................................................................................................... 85

1

MỞ ĐẦU

Vildagliptin, một chất thuộc nhóm thuốc tăng cường chức năng tiểu đảo

tụy, là chất ức chế dipeptidyl-peptidase-4(DPP-4) mạnh và chọn lọc nên cải

thiện được sự kiểm soát đường huyết [1-3]. Sự ức chế DPP-4 của vildagliptin

làm tăng nồng độ các hormone incretin GLP-1 (glucagon-like peptide 1) và

GIP (glucose-dependent insulinotropic polypeptide) nội sinh lúc đói và sau bữa

ăn. Thuốc được chỉ định như một thuốc hô trợ cho chế độ ăn và luyện tập để

cải thiện sự kiểm soát đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 (T2DM),

đơn trị liệu hoặc phối hợp với thuốc điều trị đái tháo đường khác [4].

Hiện nay, một số doanh nghiệp dược trong nước đã và đang nghiên cứu

sản xuất các chế phẩm chứa vildagliptin. Tuy nhiên, việc kiểm soát chất lượng

của các thuốc này thông qua đánh giá tương đương sinh học chưa được thực

hiện đầy đủ. Để xác định được chính xác nồng VDG trong máu, đánh giá chất

lượng của thuốc cũng như hiệu quả điều trị trong lâm sàng của thuốc, cần thiết

phải thực hiện các nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) và đánh giá tương đương

sinh học (TĐSH). Kết quả đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học

giúp các bác sĩ có thêm cơ sở để lựa chọn thuốc thay thế hiệu quả hay hiệu

chỉnh liều dùng cho phù hợp với từng bệnh nhân. Một trong những nội dung

quan trọng của nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH là xây dựng quy trình chiết

tách, xử lý mẫu và phân tích định lượng nồng độ thuốc trong dịch sinh học.

Quá trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn

do nồng độ thuốc trong mẫu thấp, nền mẫu có nhiều thành phần tạp chất gây

ảnh hưởng đến quá trình phân tích. Hơn nữa khi vào cơ thể dưới sự tác động

của rất nhiều loại enzym thì thuốc có thể bị chuyển hóa thành nhiều chất khác

nhau nhưng có cấu trúc và tính chất tương tự như hoạt chất cần phân tích. Vì

vậy, cần phải xây dựng được một phương pháp thích hợp có đủ độ nhạy và độ

tin cậy theo quy định về xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích

trong dịch sinh học.

Do có độ nhạy và độ chọn lọc cao nên kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ ngày

càng được ứng dụng nhiều trong phân tích thuốc trong dịch sinh học [5].

2

Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp

định lượng Vildagliptin trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ”

với mục đích xây dựng được một phương pháp phân tích phù hợp, để định

lượng vildagliptin trong huyết tương người. Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần

nâng cao chất lượng thuốc trên thị trường cũng như đáp ứng yêu cầu điều trị

trong lâm sàng.

Mục tiêu cụ thể của đề tài là:

1. Xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng pháp định lượng vildagliptin

trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ.

2. Ứng dụng định lượng vildagliptin trong huyết tương người tình

nguyện bằng phương pháp vừa xác nhận giá trị sử dụng phục vụ đánh giá tương

đương sinh học.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ VILDAGLIPIN

1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất hoá lý

Công thức phân tử, công thức cấu tạo và tính chất hoá lý cơ bản của

Vildagliptin được trình bày dưới đây [6]:

Tên khoa học:

(2S)-1-[2-[(3-hydroxy-1-adamantyl)amino]acetyl]pyrrolidine-2-carbonitrile.

Công thức phân tử: C17H25N3O2

Khối lượng phân tử: 303,4 g/mol

pKa = 9,03

LogP = 1,12

Tính tan trong nước: 1,75mg/mL

Hình 1.1. Công thức cấu tạo cua Vildagliptin

1.1.2. Dược động học

Một số tính chất dược động học cơ bản của vildagliptin được đề cập trên

nhiều tài liệu chuyên khảo [7], được trình bày tóm tắt như sau:

- Hấp thu: Sau khi uống lúc đói, vildagliptin được hấp thu nhanh với

nồng độ đỉnh trong huyết tương được quan sát thấy sau 1,75 giờ. Dùng cùng

với thức ăn làm giảm nồng độ Cmax (19%) và có sự chậm lại về thời gian đạt

đến nồng độ đỉnh trong huyết tương đến 2,5 giờ. Tuy nhiên mức độ thay đổi

không có ý nghĩa lâm sàng.

4

- Phân bố: Vildagliptin gắn kết kém với protein huyết tương (9,3%) và

phân bố bằng nhau giữa huyết tương và hồng cầu.

- Chuyển hóa: Khoảng 69% liều uống của vildagliptin bị chuyển hóa.

Chất chuyển hóa chính LAY151 không có hoạt tính dược lý và là sản phẩm

thủy phân của nhóm chức cyano chiếm 57% liều dùng, tiếp theo là sản phẩm

thủy phân nhóm chức amid (4% liều dùng). Vildagliptin không bị chuyển hóa

bởi các enzym CYP P450. Các nghiên cứu in vitro cho thấy vildagliptin không

ức chế hoặc gây cảm ứng các enzyme CYP P450.

- Thải trừ: Sau khi uống vildagliptin, khoảng 85% liều dùng được bài tiết

vào nước tiểu và 15% được tìm thấy ở phân. Vildagliptin dạng không đổi bài

tiết qua thận chiếm 23% liều dùng sau khi uống. Thời gian bán thải sau khi

uống khoảng 3 giờ và không phụ thuộc vào liều dùng.

- Sự tuyến tính: Sinh khả dụng tuyệt đối đường uống của thuốc là 85%.

Cmax và diện tích dưới đường cong (AUC) của vildagliptin gần như tăng tỉ lệ

với liều dùng trong phạm vi liều điều trị.

- Chi đinh: Thuốc được chỉ định như một thuốc hô trợ cho chế độ ăn và

luyện tập để cải thiện sự kiểm soát đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường

type 2 (T2DM), đơn trị liệu hoặc phối hợp với thuốc điều trị đái tháo đường

khác.

- Chống chi đinh: Chống chỉ định dùng bệnh nhân đã biết bị quá mẫn

cảm với vildagliptin hoặc với bất cứ tá dược nào của thuốc.

- Tác dụng không mong muốn: Đa số các phản ứng bất lợi trong những

thử nghiệm này là nhẹ và thoáng qua, không cần phải ngừng điều trị. Không có

sự liên quan giữa những phản ứng bất lợi này với tuổi, chủng tộc, thời gian

dùng thuốc hoặc liều lượng hàng ngày.

+ Các trường hợp hiếm gặp về rối loạn chức năng gan (kể cả viêm gan)

đã được báo cáo. Trong những trường hợp này, bệnh nhân thường không có

triệu chứng hay di chứng lâm sàng; các xét nghiệm chức năng gan trở về bình

thường sau khi ngừng điều trị.

5

+ Các tác dụng phụ sau có thể gặp phải khi dùng thuốc dưới dạng đơn trị

liệu như sau:

+ Thường gặp (tần suất >1/100): chóng mặt.

+ Ít gặp (tần suất >=1/1000 và <1/100): đau đầu, táo bón, phù nề (bàn

tay, bàn chân hay mắt cá chân), đau khớp, hạ đường huyết.

+ Rất hiếm gặp (tần suất <1/10.000): nhiễm trùng đường hô hấp trên.

- Tương tác thuốc: Vildagliptin có khả năng tương tác thuốc yếu. Vì

vildagliptin không phải là một cơ chất của enzyme CYP 450, không ức chế và

cũng không gây cảm ứng các enzyme CYP 450 nên không có khả năng tương

tác với các thuốc dùng đồng thời là cơ chất, chất ức chế hoặc chất gây cảm ứng

các enzyme này.

Hơn nữa, vildagliptin không ảnh hưởng đến độ thanh thải chuyển hóa

của các thuốc dùng đồng thời được chuyển hóa bởi CYP 1A2, CYP 2C8, CYP

2C9, CYP 2C19, CYP 2D6, CYP 2E1 và CYP 3A4/5. Các nghiên cứu về tương

tác thuốc-thuốc đã được tiến hành với các thuốc thường được kê đơn đồng thời

cho bệnh nhân đái tháo đường type 2 hoặc những thuốc có cửa sổ điều trị hẹp.

Kết quả của những nghiên cứu này cho thấy không có tương tác nào có ý nghĩa

lâm sàng với các thuốc điều trị đái tháo đường dạng uống khác (glibenclamid,

pioglitazone, metformin), amlodipin, digoxin, ramipril, simvastatin, valsartan

hoặc warfarin sau khi dùng đồng thời với vildagliptin. Thuốc có thể tăng nguy

cơ phù mạch ở bệnh nhân dùng kết hợp với chất ức chế ACE [6].

1.1.3. Một số phương pháp định lượng Vildagliptin

Trong phân tích thuốc trong dịch sinh học, mẫu máu thường được sử

dụng phổ biến hơn so với các mẫu khác như nước tiểu, nước bọt, dịch não

tủy...do thao tác lấy mẫu thường dễ dàng và chủ động hơn. Các mẫu máu sau

khi lấy được chuyển vào các ống nghiệm có chứa chất chống đông Na2–EDTA,

ly tâm tách lấy phần huyết tương và bảo quản ở nhiệt độ quy định cho đến khi

được phân tích.

6

Với các thuốc chứa VDG, khoảng 85% liều dùng được bài tiết vào nước

tiểu và 15% được tìm thấy ở phân. Vildagliptin dạng không đổi bài tiết qua thận

chiếm 23% liều dùng sau khi uống. Thời gian bán thải sau khi uống khoảng 3

giờ và không phụ thuộc vào liều dùng. Do đó, nồng độ VDG trong nước tiểu

thường thấp hơn nhiều so với nồng độ VDG trong huyết tương. Chính vì vậy

đa số các nghiên cứu định lượng VDG trong dịch sinh học được tiến hành trên

mẫu huyết tương.

Trên thế giới đã có nhiều tác giả công bố phương pháp định lượng VDG

trong huyết tương người bằng HPLC hoặc LC/MS được thể hiện trong Bảng

1.1.

Bảng 1.1. Một số nghiên cứu đinh lượng VDG trong huyết tương người

TT Xử lý

mẫu Điều kiện sắc ký LLOQ

Tài liệu

tham khảo

1 LLE

- Cột C18, 250mm x 4,6; 5µm

- Pha động: MeOH: MeCN: Đêm

phosphat pH 3,5 (5: 30: 65 v/v)

- Detector: UV, 212 mm

- Thời gian phân tích: 7,0 phút

1 mcg [8]

2 PPT

- Cột C18, 150mm x 4,6; 5µm

- Pha động: Amoni bicacbonat

50mM pH 7,8: MeCN

- Detector: UV, 210 mm

- Thời gian phân tích: 11,2 phút

10 mcg [9]

3 LLE

- Cột C8, 150 x 2mm; 3µm

- Pha động: MeCN: Amoni format

pH: 3,0 (90:10)

- Detector: MS/MS

- Thời gian phân tích mẫu: 7,5

phút

1 ng [10]

7

4 PPT

- Cột C18, 50mm x 4,6; 5µm

- Pha động: MeCN: NaH2PO4

10Mm (3:7) và SDS (10mm) ở pH

4,5

- Detector: UV, 208 mm

- Thời gian phân tích mẫu: 5 phút

0,1 mcg [11]

5 PPT

- Cột C18 (50 × 2,1 mm, 1,7 μm)

- Pha động: Axit acetic 0,5%/

MeOH: Amoni axetat 0,02M

(10:90).

- Detector: MS/MS

- Thời gian phân tích mẫu: 7,1

phút

5 ng [12]

6 PPT

- Cột Atlantis HILIC Silica (150

mm × 2,1 mm, 3 μm)

- Pha động: H2O: MeCN (80: 20)

- Detector: MS/MS

- Thời gian phân tích mẫu: 3,5

phút

5 ng [4]

7 SPE

- Cột C18 (150 mm x 2,1mm; 5μm)

- Cột Pha động: 40% A (Amoni

axetat 10mM-MeOH [95:5] và

60% B (MeCN: MeOH [10/90])

- Thời gian phân tích: 25 phút

2 ng [13]

Các kết quả nghiên cứu định lượng VDG trong huyết tương được tổng

hợp trong Bảng 1.1, cho thấy những ưu, nhược điểm còn tồn tại như sau:

Phương pháp [8] và [10] sử dụng phương pháp chiết lỏng lỏng (LLE),

[8] có LLOQ cao (1mcg/mL và thời gian phân tích dài (7,0 phút), [10] thời gian

phân tích mẫu dài (7,5 phút).

8

Phương pháp [4], [9], [11], [12] sử dụng phương pháp kết tủa protein

nhưng [9], [11] có LLOQ cao (10 mcg/mL và 0,1 mcg/mL); [12] có thời gian

phân tích dài (7,1 phút). Phương pháp [4] cột phân tích giá thành cao không

phù hợp.

Phương pháp [13] sử dụng kỹ thuật xử lý mẫu là SPE nên tốn kém chi

phí thí nghiệm, chưa thực sự phù hợp với điều kiện kinh tế của Việt Nam.

1.2. SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

1.2.1. Nguyên lý hoạt động của thiết bị phân tích khối phổ

Sắc ký lỏng khối phổ là một kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp giữa

khả năng phân tách các chất của hệ thống sắc ký lỏng và khả năng phân tích

khối của detector khối phổ. Chất phân tích ở pha lỏng sau khi ra khỏi cột sắc

ký được chuyển thành pha khí để ion hoá. Sự kết hợp này tạo nên một hệ thống

có những ứng dụng rộng lớn trong phân tích [5].

Trong kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ, sắc ký lỏng hiệu năng cao có vai

trò phân tách (một phần hoặc hoàn toàn) hoạt chất cần phân tích khỏi các thành

phần tạp chất có trong nền mẫu, hạn chế số lượng các chất đồng rửa giải cùng

với hoạt chất đi vào nguồn ion. Do vậy, hiệu suất ion hóa được cải thiện góp

phần làm tăng độ nhạy của phương pháp phân tích [14].

Tùy thuộc vào cấu tạo của chất phân tích và kỹ thuật ion hóa được sử

dụng mà chất phân tích có thể bị nhiễm điện bề mặt tạo ra các tiểu phân tích

điện hoặc bị phân mảnh, bẻ gẫy cấu trúc phân tử để hình thành các ion hoặc

các tiểu phân mang điện có khối lượng nhỏ hơn. Hôn hợp các ion, tiểu phân

mang điện hình thành ở nguồn ion, được gia tốc và chuyển đến bộ phận phân

tích khối. Dưới tác động của điện trường, các ion có khối lượng, điện tích khác

nhau sẽ chuyển động với tốc độ và quỹ đạo khác nhau. Do vậy, sau khi đi qua

bộ phận phân tích khối, các ion trong hôn hợp sẽ được phân tách riêng thành

từng loại. Bộ phận phát hiện sẽ ghi nhận loại ion được lựa chọn thành từng vạch

phổ tương ứng trên phổ đồ [15].

9

Năng lượng phân mảnh ion là một yếu tố quyết định sự phân mảnh của

các hợp chất. Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của môi phân tử và

là cơ sở để nhận dạng, định danh, định tính và định lượng chất phân tích [15].

1.2.2. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ

Sơ đồ cấu tạo của HPLC – MS như trong Hình 1.2.

Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo cua thiết bi sắc ký lỏng khối phổ

Trong số các kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ, kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu

năng cao ghép nối với đầu dò khối phổ kiểu tứ cực chập ba với nguồn ion hóa

kiểu phun điện (ESI) có độ đặc hiệu - chọn lọc tốt và độ nhạy cao, giới hạn phát

hiện có thể đến 10-14 g nên thường được sử dụng để phân tích thuốc trong dịch

sinh học [16-18].

1.2.2.1. Bộ phận nạp mẫu

Bộ phận nạp mẫu sẽ chuyển mẫu phân tích vào nguồn ion hóa của thiết

bị khối phổ. Tùy thuộc vào trạng thái vật lý của mẫu phân tích mà có thể nạp

mẫu trực tiếp hoặc nạp mẫu gián tiếp thông qua các thiết bị phân tích kết hợp

ghép nối như GC, HPLC hoặc CE. Căn cứ vào thiết bị phân tích ghép nối, mà

Áp suất giảm (10-5 – 10-6)

Bộ phận

nạp mẫu

Nguồn

ion hóa

Bộ phân

tích khối

Detector Ghi/ xử

lý số liệu

10

người ta chia thành các phương pháp như GC-MS, LC-MS hay CE-MS [5, 15,

19].

Một ghép nối LC-MS cho phép chuyển mẫu hiệu quả và chính xác từ LC

sang MS mà không làm phá hủy hay mất chất phân tích, loại bớt dung môi rửa

giải, giảm pha loãng mẫu.

1.2.2.2. Nguồn ion hoá

Nguồn ion hóa là nơi diễn ra quá trình chuyển các hoạt chất cần phân

tích thành các ion/tiểu phân mang điện ở pha khí bằng các kỹ thuật ion hóa

khác nhau.

Trong thiết bị LC-MS, nguồn ion hóa hoạt động ở áp suất khí quyển,

đóng vai trò chuyển các phân tử chất phân tích trong dòng sắc ký từ pha lỏng

thành các ion/tiểu phân mang điện ở pha khí. Có nhiều loại nguồn ion hóa

khác nhau, trong đó nguồn ion sử dụng kỹ thuật ion hóa kiểu phun điện (ESI)

là phổ biến nhất, phù hợp với đa số các loại dược chất. Trong nguồn ESI, tại

đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao áp và dòng khí đồng

trục, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích ở bề mặt.

Dưới tác động của dòng khí và nhiệt độ cao trong nguồn làm bay hơi dung

môi ra khỏi giọt sương, cuối cùng chuyển chất phân tích thành các ion ở pha

khí. Các ion dưới tác động của điện trường trong đường dẫn ion được đi vào

bộ phận phân tích khối. Những tiểu phân không bị ion hóa không chịu tác

động của điện trường sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân không của

thiết bị khối phổ [16-18].

1.2.2.3. Bộ phận phân tích khối

Các ion được tách theo tỷ số m/z. Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ

tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector. Có thể phân bộ phân

tích khối thành 4 loại [5]:

- Bộ phân tích từ

- Bộ phân tích tứ cực

- Bộ phân tích thời gian bay

11

- Bộ phân tích cộng hưởng Obitrap MS

Trong luận văn này, chúng tôi sử dụng máy khối phổ có bộ phân tích

khối là bộ phân tích tứ cực chập ba.

Bộ phân tích tứ cực chập ba (Triple Quadrupole Mass Analyser): Bộ

phận phân tích khối gồm ba tứ cực Q1, Q2 và Q3 nối tiếp nhau. Môi tứ cực

này được cấu tạo gồm có 4 thanh kim loại đặt song song và sát nhau tạo thành

hai cặp điện cực (Hình 1.3).

Hình 1.3. Cấu tạo và cơ chế hoạt động cua phổ khối tứ cực chập ba

Dòng điện một chiều và điện thế xoay chiều cao tần được đặt vào từng

cặp đối diện của tứ cực. Dưới tác động của điện trường trong lòng ống điện

cực, các ion có số khối khác nhau di chuyển với tốc độ và quỹ đạo khác nhau.

Ion có số khối càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh và ngược lại.

Tại Q1 sẽ lựa chọn các ion có tỷ số m/z xác định và được đưa đi thẳng

đến Q2, những ion khác sẽ bị loại đi do bị va đập vào các bản điện cực trái dấu.

Quá trình phân mảnh ion mẹ thành các ion nhỏ hơn (ion con) diễn ra tại Q2.

Trong buồng Q2, ion mẹ chuyển động Brown, va chạm với các phân tử khí trơ

có mặt trong buồng (khí argon). Nhờ va chạm này năng lượng động học của

các ion chuyển thành nội năng nên chúng phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ

hơn (ion con). Các ion con mới hình thành được phân tích khối tách riêng tại

Q3 và cuối cùng được đưa đến detector.

Bộ phân tích tứ cực chập ba là kỹ thuật khối phổ 2 lần (MS/MS). Các

hợp chất với cấu tạo khác nhau sẽ có tỷ số m/z của ion mẹ cũng như cơ chế

phân mảnh và hình thành nên các ion con có số khối khác nhau. Vì vậy, có thể

12

định tính, định lượng các hoạt chất cần phân tích bằng phương pháp LC-

MS/MS [16].

1.2.2.4. Bộ phận phát hiện (detector)

Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối

của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion [5].

1.2.2.5. Bộ xử lý dữ liệu

Bộ phận này cho phép phát hiện và khuếch đại tín hiệu của các ion tương

ứng về số lượng. Tín hiệu tạo ra sẽ được chuyển đến máy tính và thu được hệ

thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ [5].

1.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC

Các nghiên cứu về phân tích thuốc trong dịch sinh học phải tuân thủ các

quy định theo tiêu chuẩn Thực hành tốt phòng thí nghiệm (GLP), Kế hoạch

quản lý chất lượng (GCP) và phải đảm bảo về vấn đề đạo đức khi tiến hành.

Nghiên cứu chỉ được bắt đầu khi có sự chấp thuận của Hội đồng đạo đức.

Phương pháp định lượng hoạt chất và chất chuyển hóa trong dịch sinh

học đóng một vai trò quan trọng, quyết định đến khả năng thành công của các

nghiên cứu. Tuy nhiên, có nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến độ đặc hiệu chọn

lọc và độ nhạy của phương pháp như: khoảng nồng độ biến thiên rộng, nồng

độ hoạt chất thấp có thể đến cỡ ng/mL, nền mẫu phức tạp (thường chứa muối,

lipid, protein…).

Vì vậy, khi tiến hành xây dựng phương pháp phân tích thuốc trong dịch

sinh học cần chú trọng ba vấn đề cơ bản: kỹ thuật xử lý mẫu, điều kiện phân

tích và cách tiến hành xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích nhằm

đảm bảo độ tin cậy của phương pháp [20].

1.3.1. Ky thuât xử ly mẫu

Các mẫu dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu…) thường chứa một

tỷ lệ lớn các protein làm cản trở khả năng phát hiện và định lượng dược chất.

Vì vậy, mẫu phải được xử lý để loại tạp chất và có thể làm giàu mẫu trước khi

tiến hành phân tích. Hiện nay, để xử lý mẫu huyết tương người ta hay áp dụng

13

ba kỹ thuật cơ bản sau: kết tủa protein, chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn [15,

21]. Ngoài ra, trong một số trường hợp, có thể sử dụng đồng thời hai hoặc cả

ba kỹ thuật xử lý mẫu cơ bản đã nêu để tăng độ thu hồi hoạt chất cũng như loại

bỏ ảnh hưởng của nền mẫu.

1.3.1.1. Ky thuật kết kết tua protein (PPT)

Nguyên tắc của kỹ thuật này là sử dụng tác nhân gây kết tủa để loại đi

phần lớn lượng protein có trong nền mẫu. Tác nhân gây kết tủa protein trong

dịch sinh học thường dùng là axit hữu cơ (như acid tricloroacetic, acid

percloric…), dung môi hữu cơ (như methanol, acetonitril…), muối vô cơ (như

(NH4)2SO4, NaCl…) [22-26].

Kỹ thuật kết kết tủa protein có ưu điểm nhanh, đơn giản, dễ thực hiện,

sử dụng lượng dung môi ít, các dung môi ít ảnh hưởng tới môi trường, có thể

dễ dàng triển khai áp dụng tự động hóa để nâng cao năng suất và vì vậy là

phương pháp kinh tế. Trên thực tế, để xử lý mẫu huyết tương dùng cho phân

tích định lượng, người ta hay dùng kỹ thuật kết tủa protein bằng dung môi hữu

cơ hoặc axit.

Nhược điểm của kỹ thuật này là mẫu bị pha loãng khi tủa bằng dung môi

hữu cơ, mẫu được xử lý chủ yếu chỉ loại được thành phần protein, các thành

phần hòa tan khác (muối, phospholipid) vẫn được giữ lại, do đó có thể làm

giảm tuổi thọ của cột sắc ký, gây nhiễu đường nền và hiệu ứng nền mẫu, ảnh

hưởng đến độ chính xác của kết quả khi phân tích bằng các phương pháp sắc

ký, đặc biệt là phương pháp sắc ký lỏng khối phổ.

1.3.1.2. Ky thuật chiết lỏng – lỏng (LLE)

Nguyên lý của kỹ thuật này là chuyển chất phân tích được hoà tan trong

dung môi này sang dung môi khác không đồng tan. Tỉ lệ thu hồi hoạt chất phụ

thuộc vào độ tan của hoạt chất trong dung môi chiết, tính phân cực của dung

môi chiết, pH của pha nước, hệ số/hằng số phân bố của hoạt chất trong hai pha

lỏng không trộn lẫn với nhau.

Trong thực nghiệm, các dung môi hay được lựa chọn là dietyleter, tert-

butyl methyl eter, cloroform, dicloromethan, n-hexan... Các dung môi này có

14

thể dùng đơn thành phần hoặc dùng phối hợp với tỷ lệ thích hợp tuỳ theo từng

hoạt chất phân tích.

Ưu điểm của kỹ thuật chiết lỏng – lỏng là mẫu thu được thu được tương

đối sạch và có thể làm giàu mẫu, áp dụng được với nhiều dược chất có hệ số

logP > 0, phù hợp với điều kiện và thiết bị của nhiều phòng thí nghiệm. Nhược

điểm của kỹ thuật này sử dụng nhiều dung môi ảnh hưởng tới sức khỏe người

phân tích và môi trường, trải qua nhiều bước, thời gian xử lý mẫu dài hơn so

với kỹ thuật kết tủa protein, có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất chiết như

hình thành nhũ tương, cân bằng pha, pH... từ đó ảnh hưởng đến kết quả phân

tích và khó áp dụng tự động hóa [20, 27].

1.3.1.3. Ky thuật chiết pha rắn (SPE)

Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) được phát triển dựa trên nguyên tắc của

các kỹ thuật tách sắc ký (chất phân tích được lưu giữ trên cột và sau đó được

rửa giải nhờ một hệ dung môi thích hợp). Các giai đoạn chính của kỹ thuật SPE

gồm các giai đoạn: hoạt hóa cột, nạp mẫu, rửa và rửa giải. Ưu điểm của kỹ

thuật này là nền mẫu sạch, tỷ lệ thu hồi cao, độ lặp lại tốt, có thể áp dụng với

hầu hết các chất phân tích bằng việc lựa chọn cột chiết và dung môi rửa giải

phù hợp, có thể dễ dàng áp dụng tự động hóa để nâng cao năng suất. Nhược

điểm của kỹ thuật này chủ yếu đến từ chi phí cao của cột chiết pha rắn nên

chưa phổ biến trong các phòng thí nghiệm của Việt Nam, ngoài ra việc lựa

chọn quy trình phù hợp đòi hỏi cán bộ phân tích phải được đào tạo và có kĩ

năng tốt, thời gian xử lý mẫu tương đối dài so với kỹ thuật kết tủa protein [20,

27].

Ngoài ba kỹ thuật xử lý mẫu cơ bản ở trên, còn có một số kỹ thuật khác

được áp dụng trong xử lý mẫu dịch sinh học. Có thể kết hợp kỹ thuật kết tủa

protein sau đó sử dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng, chiết pha rắn để làm sạch

mẫu, kỹ thuật chiết lỏng lỏng giữa hai dung môi đồng tan có sử dụng nồng độ

muối cao (Salting-out assisted liquid – liquid extraction – SALLE) [26, 28,

29], kỹ thuật kết tủa protein kết hợp sử dụng chất hấp thụ phospholipid để giảm

ảnh hưởng của nền mẫu.

15

1.3.2. Xác nhân giá trị sử dụng của phương pháp phân tích thuốc

trong dịch sinh học

Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng dược chất trong

dịch sinh học nhằm mục đích là chứng minh phương pháp có đủ độ đặc hiệu,

độ nhạy, độ tin cậy và lặp lại để phân tích các mẫu thực.

Hiện nay ở Việt Nam, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân

tích thuốc trong dịch sinh học được tiến hành theo US-FDA [30, 31], EMA

[32]… gồm những chỉ tiêu sau:

1.3.2.1. Độ chon loc

Độ chọn lọc là khả năng nhận diện và phân biệt rõ ràng chất phân tích

với các thành phần khác có trong mẫu. Tiến hành phân tích trên 06 mẫu huyết

tương trắng (HTT) có nguồn gốc khác nhau và 06 mẫu tự tạo có chứa chuẩn

nội và chất phân tích ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (nồng độ LLOQ dự

kiến) trong từng nền HTT tương ứng. Ghi lại sắc đồ, tín hiệu đo của pic và các

thông số pic của các mẫu trắng và mẫu chuẩn.

Phương pháp LC-MS/MS được coi là chọn lọc đối với chất phân tích và

chuẩn nội (IS) khi:

- Trên SKĐ mẫu chuẩn, các pic của chất phân tích và IS phải được nhận diện

rõ ràng.

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, tín hiệu đo của

pic của từng mẫu trắng và mẫu Zero phải không được lớn hơn 20% tín hiệu đo

của pic của mẫu LLOQ tương ứng.

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, tín hiệu đo của pic của

từng mẫu trắng phải không lớn hơn 5% tín hiệu đo trung bình của mẫu đường

chuẩn (CC), QC và LLOQ.

1.3.2.2. Giới hạn đinh lượng dưới (LLOQ)

Tiến hành phân tích trên 06 mẫu HTT, 06 mẫu tự tạo có chứa IS và chất

phân tích ở nồng độ LLOQ dự kiến. Ghi lại sắc đồ và so sánh tỷ lệ tín hiệu đo

của pic mẫu trắng và mẫu chuẩn.

16

Mẫu tự tạo được coi là LLOQ khi:

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, tín hiệu đo

trung bình mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần tín hiệu đo của mẫu Zero.

- Độ đúng trung bình từng lô và độ đúng trung bình của ít nhất 3 lô phải

đạt từ 80% – 120% so với nồng độ thực.

- Độ chính xác của từng lô và của ít nhất 3 lô phải ≤ 20%.

1.3.2.3. Đường chuân và khoảng tuyến tinh

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu đo của thiết bị và nồng

độ của chất phân tích có trong mẫu.

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ của chất phân tích, trong đó có sự

tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích với tỷ lệ tín hiệu đo của pic

AN/IS.

Đường chuẩn phải có tối thiểu 6 giá trị nồng độ, bao phủ toàn bộ khoảng

tuyến tính, có hệ số tương quan r ≥ 0,98 và phải đáp ứng các điều kiện sau:

- Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải từ 85 – 115%, trừ tại

điểm LLOQ được chấp nhận 80 – 120%.

- Có ít nhất 75% và 6 điểm chuẩn trong số điểm trong dãy chuẩn đạt

được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêu chuẩn.

- Khoảng tuyến tính: có hệ số r ≥ 0,95.

1.3.2.4. Ảnh hưởng cua nền mẫu

Tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp đã xây dựng trên 6 mẫu HTT có

nguồn gốc khác nhau thu được dung dịch nền mẫu. Thêm chuẩn nội và chất phân

tích ở nồng độ LQC và HQC vào từng dung dịch nền mẫu trên. Song song chuẩn

bị các mẫu chuẩn trong pha động chứa chuẩn nội và chất phân tích ở nồng độ

tương ứng với nồng độ của các mẫu chuẩn trong nền mẫu. Phân tích sắc ký các

mẫu trên. Xác định giá trị MFAN, MFIS của AN và IS bằng cách so sánh diện tích

pic AN và IS giữa các mẫu pha trong nền mẫu với các mẫu pha trong pha động.

Phương pháp LC-MS/MS không bị ảnh hưởng bởi nền mẫu khi giá trị hệ số

17

biến thiên (CV) của tỷ số MFAN/MFIS trên ít nhất 6 nền mẫu trắng có nguồn gốc

khác nhau phải ≤ 15%.

1.3.2.5. Độ nhiễm chéo

Tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp đã xây dựng trên 6 mẫu HTT, 6

mẫu chuẩn pha trong huyết tương (HT) ở nồng độ LLOQ và 6 mẫu chuẩn pha

trong HT ở nồng độ cao nhất của đường chuẩn.

Mẫu được coi là không bị nhiễm chéo trong quá trình tiêm mẫu khi tiêm

mẫu trắng ngay sau mẫu có nồng độ cao nhất của đường chuẩn thì tại thời điểm

trùng với thời gian lưu của chất phân tích, tín hiệu đo của pic trung bình của

mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần tín hiệu đo của pic của từng mẫu trắng, tại

thời gian lưu của IS phải gấp ít nhất 20 lần.

1.3.2.6. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của nồng độ chất phân tích định

lượng được so với nồng độ lý thuyết.

Độ chính xác phản ánh độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại

quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị

bằng giá trị CV (%). Độ chính xác bao gồm độ chính xác trong ngày và độ

chính xác khác ngày.

Độ đúng và độ chính xác được thực hiện trên 04 mức nồng độ khác nhau

(LLOQ, LQC, MQC, HQC), môi nồng độ tiến hành ít nhất 5 mẫu.

Độ đúng trong ngày và khác ngày phải đạt trong khoảng 85 – 115%; độ

chính xác trong ngày và giữa các ngày với giá trị CV ≤ 15%. Riêng nồng độ

LLOQ cho phép độ đúng nằm trong khoảng 80 – 120% và giá trị CV ≤ 20%.

1.3.2.7. Độ thu hồi

Độ thu hồi là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của chất phân tích và

chuẩn nội sau quá trình chiết tách xử lý mẫu. Độ thu hồi được xác định bằng

cách so sánh kết quả tín hiệu đo của các mẫu QC có qua chiết tách với tín hiệu

đo của các mẫu chuẩn không được xử lý qua chiết tách (mẫu pha trong pha

động).

18

Độ thu hồi của chất phân tích và chuẩn nội phải ổn định và độ thu hồi

của chất phân tích tại các mức nồng độ khác nhau không được quá 15%.

1.3.2.8. Độ ổn đinh cua hoạt chất trong dich sinh hoc

Trong các nghiên cứu SKD, TĐSH… quá trình phân tích thường kéo dài

vì số lượng mẫu lớn. Vì vậy, cần tiến hành nghiên cứu độ ổn định hoạt chất sau

các quá trình bảo quản và phân tích. Hoạt chất phải ổn định trong quá trình xử

lý, phân tích và bảo quản mẫu đông lạnh với thời gian phù hợp đủ để phân tích

toàn bộ số mẫu huyết tương.

Trong xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp cần đánh giá các loại

độ ổn định sau:

- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, dung dịch chuẩn làm việc thời

gian dài và/hoặc thời gian ngắn.

- Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm:

+ Độ ổn định sau 6 chu kỳ để đông đá – rã đông (đông – rã).

+ Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng.

+ Độ ổn định thời gian dài ở nhiệt độ bảo quản.

+ Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong autosampler).

Các mẫu huyết tương được coi là ổn định ở điều kiện nghiên cứu nếu các

nồng độ trong mẫu độ ổn định sai khác so với nồng độ lý thuyết đều nhỏ hơn

15%.

19

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Phương pháp nghiên cứu tiến hành trên các mẫu HT bao gồm: mẫu HT

trắng, mẫu HT tự tạo chứa chuẩn VDG và mẫu HT của người tình nguyện

(NTN) đã được uống 01 viên nén bao phim USABETIC®-VG 50 (vildagliptin

50 mg) được sản xuất bởi: Công ty CPDP AMPHARCO U.S.A, địa chỉ: KCN

Nhơn Trạch 3, xã Hiệp Phước, huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai.

2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU

2.2.1. Hoá chất, chất chuẩn

Các chất chuẩn phục vụ cho nghiên cứu được tổng hợp trình bày trong

Bảng 2.1.

Bảng 2.1. Các chất chuân được sử dụng

Tên Mục đích

sử dụng Nơi sản xuất Số kiểm soát

Hàm lượng

(%)

Vildagliptin Chuẩn TRC, Canada 1-MLM-173-1

99,19

(nguyên

trạng)

Carbamazepin Chuẩn nội VKNTTW WS.0115318.01

99,78

(nguyên

trạng)

Diltiazem Chuẩn nội VKNTTW WS. 0108218 99,9%

(chất khan)

Metoprolol Chuẩn nội VKNTTW WS. 0107228

100%

(nguyên

trạng)

20

2.2.2. Mẫu huyết tương trắng

- Huyết tương trắng được cung cấp bởi Bệnh viện Trung ương quân đội

108 gồm các lô: N1533; N1544; N1574; N1572; N1559; N1578; 19.01299;

19.01303 được bảo quản ở nhiệt độ -35°C.

- HTT sử dụng trong quá trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

được chuẩn bị như sau: thêm 2 mL dung dịch NH4OH 2,5 M vào 100 mL mẫu

huyết tương trắng, trộn đều.

2.2.3. Dung môi, hoá chất

- Acetonitril; axit formic, nước loại ion đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng

cho HPLC và LC – MS.

- Các dung môi, hóa chất khác như: Methanol; amoni bicacbonat; amino

acetat… đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích

2.2.4. Dụng cụ, thiết bị

- Thiết bị phân tích chính là hệ thống sắc ký lỏng khối phổ của hãng

Sciex (Mỹ) với detector QTrap 6500+, lắp đặt tại Trung tâm Đánh giá Tương

đương sinh học – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương.

- Cân phân tích Mettler Toledo (d=0,01 mg).

- Máy ly tâm lạnh Sigma 4-16KS.

- Máy lắc xoáy (vortex) Benchmark, USA.

- Tủ lạnh sâu -70°C Panasonic, Nhật Bản.

- Micropipet Eppendorf: 0,5 – 10 µL; 10 – 100 µL; 100 – 1000 µL; 500

– 5000 µL.

- Cột sắc ký: Hypersil Gold C8; 50*2,1 mm; 1,9 µm.

- Bình định mức, bình thủy tinh class A: Prolabo-Pháp; Ống falcon 15

mL.

21

2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được tiến hành thực hiện dựa trên việc tham khảo các tài liệu

về định lượng VDG trong dịch sinh học [4, 8-13] với điều kiện trang thiết bị

hiện có tại Trung tâm đánh giá tương đương sinh học (Viện kiểm nghiệm thuốc

trung ương).

2.3.1. Xây dựng và xác nhân giá trị sử dụng của phương pháp phân

tích trên hệ thống LC-MS/MS

2.3.1.1. Xây dựng điều kiện khối phổ xác đinh VDG và chuân nội

Sử dụng hệ thống LC-MS/MS, QTrap 6500+ với nguồn ion hóa kiểu

ESI, tiến hành thực nghiệm như sau:

- Tối ưu hoa điều kiện khối phổ VDG:

Tiêm dung dịch chuẩn VDG nồng độ 200 ng/mL với tốc độ 5 µL/phút

vào trong hệ thống khối phổ thông qua nguồn ion hóa ESI để xác định:

+ Ion mẹ cho VDG.

+ Tối ưu các điều kiện ở nguồn ion hóa và bộ phận thấu kính hội tụ ion

để lượng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối là nhiều và ổn định nhất.

+ Xác định mảnh ion con của VDG có cường độ tín hiệu cao và ổn định.

+ Tối ưu năng lượng phân mảnh ion mẹ thành ion con đã xác định ở trên

để lượng ion con tạo thành nhiều và ổn định nhất.

- Khảo sát lựa chon chuân nội:

Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý của các chất để tiến hành

lựa chọn chuẩn nội cho phương pháp. Chuẩn nội được lựa chọn phải đảm bảo

bền vững, có thể tham gia quá trình chiết tách và phân tích sắc ký cùng chuẩn.

Một số chất chuẩn nội được lựa chọn khảo sát bao gồm: diltiazem, metoprolol,

carbamazepin. Tiến hành tối ưu hóa điều kiện khối phổ của chuẩn nội tương tự

như với chất chuẩn VDG để thu được cường độ tín hiệu cao và ổn định.

22

2.3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ky

Chuẩn bị dung dịch chuẩn hôn hợp chứa VDG và IS trong pha động có

nồng độ khoảng 200 ng/mL. Tiến hành khảo sát với các điều kiện sắc ký khác

nhau bao gồm: sử dụng cột Hypersil Gold C18 50 x 2,1 mm; 1,9 µm, cột

Hypersil Gold C8 50 x 2,1 mm; 1,9 µm, Cột Luna C18(2)-HST 50 x 3 mm; 2,5

µm, cùng các hệ pha động khác nhau MeOH-dung dịch axit formic 0,1%,

MeOH-dung dịch amoni axetat 2 – 10 mM, MeOH-dung dịch amoni bicacbonat

1 – 10 mM, MeCN-dung dịch axit formic 0,1%, MeCN-dung dịch amoni axetat

2 – 10 mM, MeCN-dung dịch amoni bicacbonat 1 – 10 mM theo các tỷ lệ khác

nhau.

2.3.1.3. Khảo sát quy trinh xử ly mẫu huyết tương

Nguồn ion hóa ESI của thiết bị LC-MS/MS, với cơ chế nhiễm điện bề

mặt thích hợp để ion hóa VDG. Quá trình ion hóa VDG ở nguồn ESI bị ảnh

hưởng bởi các chất rửa giải trong dòng pha động sắc ký. Do vậy phương pháp

xử lý mẫu huyết tương loại bỏ tạp chất, loại bỏ các tác nhân ảnh hưởng đến quá

trình ion hóa VDG ở nguồn ESI và thu hồi các chất phân tích với tỷ lệ cao, lặp

lại có vai trò quan trọng trong khi phân tích bằng LC-MS/MS.

Kỹ thuật xử lý mẫu huyết tương có 3 phương pháp chính: Kết tủa protein

(PPT), chiết lỏng – lỏng (LLE), chiết pha rắn (SPE). Do VDG và IS là những

chất thân dầu (Log P > 0), trong khi đó yêu cầu về độ nhạy với VDG khá cao

(3 ng/mL). Vì vậy trong nghiên cứu này, phương pháp kết tủa protein được lựa

chọn áp dụng do có ưu điểm thực hiện nhanh, đơn giản và chi phí thấp với các

tác nhân tủa là các axit hữu cơ như: axit percloric, TCA…hoặc các dung môi

hữu cơ như: MeOH, MeCN…

Các axit hữu cơ có khả năng tủa mạnh, thể tích cần dùng nhỏ nên ít làm

pha loãng mẫu. Tuy vậy, mẫu sau xử lý có chứa lượng lớn axit của Clo nên

không phù hợp cho thiết bị khối phổ, có thể gây ăn mòn các bộ phận thiết bị.

Ngoài ra, nồng độ các phospholipid không được pha loãng nên gây ra ảnh

hưởng nền mẫu nhiều khi phân tích khối phổ. Với tác nhân kết tủa là dung môi

hữu cơ như MeOH và MeCN, tỷ lệ sử dụng là 1/3 hoặc nhiều dung môi hơn,

23

lượng protein bị loại bỏ > 99%, mẫu sẽ bị pha loãng nhiều; tuy nhiên, nồng độ

phospholipid sẽ bị pha loãng nên giảm ảnh hưởng nền mẫu, mẫu sau xử lý

tương thích với thiết bị khối phổ. Phương pháp xử lý mẫu được nghiên cứu đã

sử dụng tác nhân tạo kết tủa MeCN. Sau khi mẫu huyết tương được tạo kết tủa

với MeCN, MeCN gây kết tủa protein mạnh hơn, mẫu sau kết tủa dễ dàng ly

tâm lấy dịch trong hơn khi kết tủa bằng MeOH. Vì vậy, MeCN được lựa chọn

làm tác nhân kết tủa protein trong nghiên cứu này.

Tiến hành khảo sát các phương pháp xử lý mẫu trên mẫu HTT và các

mẫu tự tạo chứa chuẩn VDG với nồng độ thích hợp (không qua chiết tách) để

so sánh tín hiệu đo của pic với các mẫu có nồng độ tương ứng trong huyết

tương.

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu đơn giản, hiệu quả

có thể chiết tách VDG với độ thu hồi cao, ổn định và không gây ra ảnh hưởng

của nền mẫu khi phân tích bằng MS, đồng thời đảm bảo độ ổn định của chất

phân tích trong suốt quá trình xử lý.

2.3.1.4. Xác nhận giá tri sử dụng cua phương pháp phân tich

Tiến hành xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng VDG

trong HT người bằng kỹ thuật LC-MS/MS theo quy định của US-FDA [30, 31]

và EMA (2012) [32] về xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích

trong dịch sinh học. Các chỉ tiêu cần xác nhận giá trị sử dụng bao gồm: độ đặc

hiệu – chọn lọc của phương pháp; giới hạn định lượng dưới; đường chuẩn –

khoảng tuyến tính; ảnh hưởng của nền mẫu; độ nhiễm chéo; độ đúng – độ chính

xác trong ngày; độ đúng – độ chính xác khác ngày; tỉ lệ thu hồi; độ mở rộng

batch; độ đúng – độ chính xác khi tiêm lại; độ ổn định auto sampler… và độ ổn

định của hoạt chất trong quá trình xử lý.

- Chuân bi mẫu chuân:

Các dung dịch chuẩn trong dung môi trong dung môi được chuẩn bị như

sau:

24

+ Dung dịch chuẩn gốc để pha đường chuẩn (CCA): Cân chính xác lượng

chất chuẩn vildagliptin, hòa tan trong methanol để thu được dung dịch chuẩn

gốc có nồng độ vildagliptin khoảng 240 µg/mL.

+ Dung dịch chuẩn gốc để pha mẫu kiểm tra (QCA): Cân chính xác lượng

chất chuẩn vildagliptin, hòa tan trong methanol để thu được dung dịch chuẩn

gốc có nồng độ vildagliptin khoảng 240 µg/mL.

+ Dung dịch chuẩn gốc làm việc (CCB, QCB): Từ dung dịch chuẩn gốc

CCA, QCA, tiến hành pha loãng trong methanol – nước (1:1) để thu được dung

dịch chuẩn làm việc CCB, QCB có nồng độ vildagliptin khoảng 24 µg/mL.

+ Dung dịch chuẩn nội gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg chất nội chuẩn,

hòa tan trong methanol thu được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ khoảng

500 µg/mL.

+ Dung dịch chuẩn nội làm việc: Từ dung dịch chuẩn nội gốc, tiến hành

pha loãng trong methanol – nước (1:1) để thu được dung dịch chuẩn nội làm

việc có nồng độ khoảng 2,5 µg/mL.

- Cách chuân bi dung dich xây dựng đường chuân và mẫu LLOQ trong

huyết tương

+ Từ dung dịch CCB, pha dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương

WSS-CC1 và WSS-CC2 có nồng độ VDG tương ứng khoảng 600 ng/mL và 30

ng/mL.

+ Môi đường chuẩn (CC) bao gồm: 01 mẫu huyết tương trắng (blank),

01 mẫu huyết tương trắng có pha IS (zero) và 08 mẫu huyết tương có pha chuẩn

VDG và IS.

+ Nồng độ và cách chuẩn bị các mẫu của đường chuẩn (CC) và mẫu giới

hạn định lượng dưới (LLOQ) trong huyết tương được trình bày ở

Bảng 2.2 và Bảng 2.3.

25

Bảng 2.2. Cách chuân bi đường chuân trong huyết tương

Mẫu Blank Zero S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8

Nồng độ

(ng/mL) 3 6 15 30 60 180 420 600

Vhuyết tương

trắng (µL) 250 250 225 200 125 0 225 175 75 0

VWSS-CC1

(µL) - - - - 25 75 175 250

VWSS-CC2

(µL) 25 50 125 250 - - - -

Bảng 2.3. Cách chuân bi mẫu LLOQ trong huyết tương

Mẫu Nồng độ (ng/mL) Vhuyết tương trắng (µL) VWSS-CC2 (µL)

LLOQ 3 225 25

- Xây dựng đường chuân

- Tiến hành pha các mẫu huyết tương chứa chuẩn VDG với 8 mẫu chuẩn

trong huyết tương.

- Chuẩn bị 05 đường chuẩn riêng biệt chứa VDG ở khoảng nồng độ như

trên. Xử lý và phân tích theo quy trình xác nhận giá trị sử dụng của phương

pháp. Ghi lại sắc ký đồ và tín hiệu đo pic.

- Khảo sát trên các mô hình weighting: 1, 1/x, 1/x2, 1/x1/2 để lựa chọn mô

hình phù hợp nhất.

Từ dữ liệu thực nghiệm, xác định được hệ số tỷ trọng (1/x2) và xây dựng

đồ thị phần dư của các đường chuẩn thực nghiệm theo mô hình weighting 1/x2.

- Xác định độ đúng của từng mẫu chuẩn.

26

- Chuân bi các mẫu kiểm tra trong huyết tương:

Mẫu kiểm tra được chuẩn bị từ dung dịch gốc độc lập với mẫu chuẩn.

Tiến hành tương tự như mẫu chuẩn làm việc WSS-CC1 và WSS-CC2 để thu

được dung dịch WSS-QC1 và WSS-QC2 có nồng độ VDG trong huyết tương

lần lượt là 600 ng/mL và 30 ng/mL.

Từ dung dịch chuẩn làm việc WSS-QC1 và WSS-QC2, phối hợp với

HTT theo

Bảng 2.4 để được các mẫu kiểm tra LQC, MQC, HQC có nồng độ dự kiến

(LQC có nồng độ VDG bằng khoảng 3 lần nồng độ thấp nhất của đường chuẩn

– LLOQ; MQC có nồng độ VDG bằng khoảng 30 – 50% nồng độ cao nhất của

đường chuẩn – ULOQ; HQC có nồng độ VDG bằng khoảng 75 – 90% ULOQ).

Bảng 2.4. Cách chuân bi mẫu QC trong huyết tương

Mẫu Nồng độ (ng/mL) VWSS-QC1 (µL) VWSS-QC2 (µL) VHTT (µL)

LQC 9 - 75 175

MQC 240 100 - 150

HQC 480 200 - 50

- Chuân bi dung dich chuân nội:

Cân chính xác khoảng 25 mg chất nội chuẩn vào bình định mức 50 mL,

hòa tan trong methanol để thu được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ khoảng

500 µg/mL.

Từ dung dịch chuẩn nội gốc, tiến hành pha loãng trong nước để thu được

dung dịch chuẩn nội làm việc có nồng độ thích hợp (tín hiệu đo của chuẩn nội

bằng khoảng 50% tín hiệu đo của VDG ở nồng độ ULOQ).

2.3.1.5. Phương pháp tinh kết quả

- Xác định nồng độ VDG có trong các mẫu thử chưa biết nồng độ dựa vào

tỷ lệ diện tích pic VDG/IS thu được từ sắc đồ của mẫu thử và đường chuẩn

tương ứng phân tích trong cùng điều kiện.

27

➢ Đường chuẩn Y = aX + b (phương pháp bình phương tối thiểu)

Trong đó:

+ Y: tỷ lệ diện tích pic VDG/IS + a: độ nhạy

+ X: nồng độ VDG + b: sai số hệ thống

➢ Nồng độ định lượng được: X = (Y - b)/a

- Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của nồng độ định lượng được

với nồng độ pha thực tế của mẫu và được xác định theo công thức:

Độ đúng (%) =Nồng độ định lượng được

Nồng độ pha thực tế× 100

- Độ chính xác là giá trị phản ánh mức độ chụm giữa các kết quả riêng

biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất,

được biểu thị bằng giá trị CV (%):

CV (%) =S

XTB

× 100

Trong đó:

S: độ lệch chuẩn giữa giá trị các lần định lượng

XTB: giá trị trung bình của các lần định lượng

- Hệ số (MF) đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu:

MFVDG hoặc MFIS =A

B

Trong đó:

A: tín hiệu đo của pic của VDG hoặc IS của mẫu pha trong nền mẫu

B: tín hiệu đo trung bình pic của VDG hoặc IS mẫu pha trong pha động

- Độ thu hồi (TLTH) được xác định bằng cách so sánh tín hiệu đo pic

của chuẩn/chuẩn nội trong các mẫu QC có qua chiết tách (mẫu huyết tương)

28

với tín hiệu đo pic của chuẩn/ chuẩn nội trong các mẫu chuẩn tương ứng không

qua chiết tách, được pha trong nền mẫu (mẫu so sánh):

TLTH (%)=Tín hiệu đo pic trong mẫu HT

Tín hiệu đo pic trong mẫu so sánh×H×100

Trong đó, H: là hệ số hiệu chỉnh

- So sánh tín hiệu đo của mẫu nghiên cứu độ ổn định bảo quản ở các

điều kiện khác nhau với tín hiệu đo mẫu mới pha:

+ Mẫu trong huyết tương:

% Độ ổn định=Trung bình nồng độ mẫu độ ổn định

Nồng độ pha thực tế×100

+ Dung dịch chuẩn:

% Độ ổn định=Trung bình tín hiệu đo mẫu độ ổn định × Nồng độ mẫu mới pha

Trung bình tín hiệu đo mẫu mới pha × Nồng độ mẫu độ ổn định×100

2.3.2. Xác định nồng độ VDG trong mẫu huyết tương người tình

nguyện

Áp dụng phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng xác định nồng độ VDG

trong huyết tương người tình nguyện (NTN) tham gia nghiên cứu đánh giá

tương đương sinh học chế phẩm vildagliptin hàm lượng 50 mg. Đề cương

nghiên cứu đã được Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học Viện Kiểm

nghiệm thuốc Trung ương phê duyệt. Thiết kế nghiên cứu là nghiên cứu chéo,

ngẫu nhiên, nhãn mở, đơn liều, 2 thuốc, 2 trình tự, 2 giai đoạn.

Người tình nguyện là nam hoặc nữ giới khỏe mạnh, tuổi 18 – 45, có chỉ

số BMI về cân nặng và chiều cao phải trong khoảng từ 18 – 30 kg/m2 theo cách

tính của Metropolitan Index 1983 cho người lớn, được kiểm tra lâm sàng và

làm các xét nghiệm cơ bản (xét nghiệm máu, sàng lọc kháng thể HIV, kháng

nguyên viêm gan B, xét nghiệm nước tiểu), xem xét tiền sử bệnh, có khả năng

hiểu các thông tin về nghiên cứu [19, 30, 33, 34].

- NTN được uống 01 viên nén chứa VDG 50 mg trong tình trạng nhịn ăn

ít nhất 10 giờ. Lấy mẫu từ tĩnh mạch cẳng tay NTN ở các thời điểm: trong vòng

29

1,5 giờ trước khi uống thuốc (thời điểm 0 giờ) và sau khi uống thuốc các khoảng

thời gian: ); 0,25; 0,50; 0,75; 1,00; 1,33; 1,67; 2,00; 2,50; 3,00; 4,00; 6,00; 8,00;

12,00; 15,00 và 24,00 giờ.

+ Các mẫu từ 0,25 – 2 giờ: ± 1 phút;

+ Các mẫu 2,5 – 3 giờ: ± 2 phút;

+ Mẫu 4 giờ: ± 3 phút.

+ Các mẫu 4 – 8 giờ: ± 6 phút;

+ Các mẫu 12 – 15 giờ: ± 9 phút.

+ Mẫu 24 giờ: ± 25 phút.

Với các điểm lấy mẫu chênh lệch quá thời gian quy định, thời gian lấy

mẫu thực tế sẽ được ghi chép lại và sử dụng khi tính thống kê.

Cách lấy mẫu:

- Điểm 0 giờ: Lấy khoảng 5 mL máu qua kim luồn đặt cố định ở cánh

tay NTN.

- Các điểm 0,25 giờ – 12 giờ: Lấy khoảng 5 mL máu qua kim luồn sau

khi đã loại bỏ khoảng 0,5 mL máu chứa dung dịch chống đông (dung dịch

NaCl 0,9% chứa Heparin 5 UI/mL).

- Với điểm 24 giờ và khi gặp sự cố tắc kim luồn: Lấy khoảng 5 mL máu

trực tiếp từ tĩnh mạch cánh tay.

Thể tích máu:

Môi NTN hoàn thành nghiên cứu sẽ lấy tất cả khoảng 179 mL máu, gồm:

- Khoảng 5 mL máu trong ngày tuyển chọn để xét nghiệm sàng lọc.

- Khoảng 14 mL máu loại bỏ do chứa dung dịch chống đông ở các điểm

từ 0,25 giờ – 15 giờ (14 điểm x 2 GĐ x 0,5 mL = 14 mL).

- Khoảng 160 mL máu cho các điểm từ 0 giờ – 24 giờ (16 điểm x 2 GĐ

x 5 mL = 160 mL).

30

Mẫu máu sau khi lấy được cho vào ống có ghi nhãn chứa chất chống

đông EDTA. Lắc ống bằng cách lật ngược ống 3 – 4 lần ngay sau khi cho máu

vào. Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút, ở 0 – 2°C. Tách lớp huyết

tương cho vào các ống polyethylen có dán nhãn, kiềm hoá bằng NH4OH 2,5M

(20 µL/mL huyết tương), trộn đều sau đó bảo quản ngay ở -70°C cho đến khi

phân tích. Nhãn trên ống đựng máu và ống đựng huyết tương ghi các thông tin:

mã số NTN, số nghiên cứu, giai đoạn, thời điểm lấy mẫu.

- Định lượng VDG trong các mẫu huyết tương NTN sau khi kết thúc lấy

mẫu bằng phương pháp phân tích đã được xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng,

thời gian từ khi lấy mẫu đầu tiên đến khi kết thúc quá trình phân tích nằm trong

khoảng thời gian độ ổn định của mẫu huyết tương. Các mẫu huyết tương của

cùng 1 NTN được phân tích trong cùng 1 ngày ở cùng điều kiện.

- Từ nồng độ thuốc đã định lượng được trong các mẫu HT biểu diễn

đường cong biến thiên nồng độ VDG theo thời gian và xác định một số thông

số dược động học (DĐH) cơ bản của VDG bằng phần mềm Excel:

+ Cmax, Tmax: xác định trực tiếp từ dữ liệu thực nghiệm.

AUClast : Diện tích dưới đường cong từ khi dùng thuốc đến thời điểm

cuối cùng định lượng được, tính theo phương pháp hình thang.

- AUCinf : Diện tích dưới đường cong được ngoại suy đến vô cùng

+ AUClast được tính theo nguyên tắc hình thang sử dụng công thức tính sau:

AUClast = ∑(𝐶𝑖 + 𝐶𝑖+1) × (𝑡𝑖+1 − 𝑡𝑖)

2

𝑛−1

𝑖=0

Trong đó: Ci, Ci+1 là nồng độ VDG trong huyết tương ở thời điểm ti và ti+1

n là thời điểm lấy mẫu cuối cùng mà nồng độ còn định lượng được.

AUCinf = AUClast + Cn/λz

Với Cn là nồng độ VDG tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng còn định lượng

được và λz là hệ số thải trừ.

31

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.1.1. Điều kiện khối phổ và lựa chọn chuẩn nội để định lượng

Vildagliptin

Nghiên cứu trong luận văn sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần

(LC-MS/MS) để phân tích định tính và định lượng VDG trong mẫu huyết

tương. So với kỹ thuật khối phổ một lần để định lượng VDG trong dịch sinh

học thì phổ khối hai lần MS/MS có ưu điểm vượt trội hơn về tính đặc hiệu, giới

hạn phát hiện, độ chọn lọc và độ nhạy khi phân tích lượng vết. Do đó, các điều

kiện về khối phổ được lựa chọn, khảo sát để xác định điều kiện tối ưu khi phân

tích VDG.

3.1.1.1. Điều kiện khối phổ đinh lượng Vildagliptin

- Ion hóa VDG và phổ khối MS:

Khảo sát chế độ ion hoá ESI (+) và ESI (-) và tiến hành phân tích khối

phổ một lần và quét toàn phổ (Full scan MS). Tại chế độ ESI (+) xác định được

mảnh ion mẹ (parent ion) của VDG là m/z 304,0. Tại chế độ ESI (-) không có

tín hiệu ứng với VDG. Vì vậy, lựa chọn phân tích VDG tại chế độ ESI (+). Phổ

khối của các chất phân tích tại chế độ ESI (+) được thể hiện ở Hình 3.1 và cơ

chế phân mảnh của VDG trong phổ khối đã được Kumar và cộng sự [35] đề

xuất như trình bày ở Hình 3.2. Trên phổ khối của VDG, mảnh mẹ [M+H]+ (m/z

304) xuất hiện rõ nét, tín hiệu lớn nhất do đó được chọn làm mảnh ion mẹ để

xác định phổ khối của các mảnh ion con. Cũng theo phổ khối từ mảnh mẹ

[M+H]+ thu được cả pic của các mảnh con tại các m/z 154, m/z 127, m/z 97, m/z

70 hoàn toàn phù hợp với cơ chế phân mảnh đã được đề xuất bởi Kumar và các

cộng sự.

32

Hình 3.1. Phổ khối cua dung dich chuân VDG với chế độ ESI (+)

Hình 3.2. Cơ chế phân mảnh cua Vildagliptin

Sau khi xác định được mảnh ion mẹ, các thông số nguồn ion với chất

phân tích được khảo sát và lựa chọn tối ưu. Tiến hành khảo sát các thông số:

điện thế ion hóa (Ion spray voltage – IS) từ 0 – 5500 V, điện thế bộ phận thu

+MS2 (304.00) CE (46): 36 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Vilda... Max. 7.9e6 cps.

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300m/z, Da

0.0

5.0e5

1.0e6

1.5e6

2.0e6

2.5e6

3.0e6

3.5e6

4.0e6

4.5e6

5.0e6

5.5e6

6.0e6

6.5e6

7.0e6

7.5e6

7.9e6In

ten

sit

y,

cp

s304.0

154.0

97.0

77.0

93.0 151.0

95.070.0 107.0

133.081.0 127.0

33

mẫu (Decluster potential) này từ 0 đến 300 V. Các thông số này được xác định

từ giản đồ tối ưu điện thế trên Hình 3.3.

Hình 3.3. Giản đồ tối ưu điện thế bộ phận thu mẫu

Để giảm độ nhiễu của nền mẫu, tăng độ đặc hiệu và độ nhạy của phương

pháp phân tích, khối phổ 2 lần (MS/MS) được lựa chọn để sử dụng năng lượng

phân mảnh ion mẹ tạo ra các mảnh ion con đặc trưng. Kết quả thực nghiệm cho

thấy khi tiến hành phân mảnh ion mẹ (mảnh ion tiền thân), lựa chọn mảnh ion

con cho tín hiệu đo cao và ổn định nhất, đồng thời có điện thế phân mảnh tối

ưu thì xác định được các mảnh ion con phù hợp để định lượng chất phân tích

là m/z 154,0 và m/z 97,0 tương ứng với điện thế phân mảnh lần lượt là 21 V và

39 V.

Như vậy các thông số khối phổ cho các chất phân tích được lựa chọn và

xác định như sau:

+ Điện thế ion hóa (IS): 5000 V

+ Điện thế bộ phận thu mẫu (DP): 142 V

+ Đo chọn lọc đa ion (MRM): 304,0 >> 154,0 >> 97,0

+ Năng lượng phân mảnh: 21V, 39 V

34

3.1.1.2. Khảo sát lựa chon chuân nội

Tiến hành khảo sát lựa chọn chuẩn nội trên các chất: Diltiazem,

metoprolol, carbamazepin. Tiến hành tối ưu hóa điều kiện khối phổ của từng

chất khảo sát tương tự như cách tiến hành với VDG. Khi sử dụng các thế phân

mảnh khác nhau tạo ra các mảnh con tương ứng như sau: Diltiazem 178 Da

(415 → 178); Metoprolol 116 Da (268,1 → 115,6); Carbamazepin 194 Da (237

→ 194).

Hình 3.4. Sắc ky đồ mẫu huyết tương co chuân VDG, carbamazepin,

metoprolol, diltiazem

Trên sắc ký đồ (Hình 3.4) của mẫu huyết tương có chứa VDG và các

chất carbamazepin, metoprolol, diltiazem có nồng độ khoảng 2 ng cho thấy

carbamazepin có hình dáng pic cân đối, thời gian lưu tương tự với VDG. Ngoài

ra, carbamazepine có tính chất lý hóa tương tự như VDG nên điều kiện sắc ký

và quy trình xử lý mẫu là tương tự nhau. Do vậy, carbamazepin (CTPT:

C15H12N2O; KLPT: 236.269 g/mol) được lựa chọn làm chất chuẩn nội.

XIC of +MRM (4 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1 (Cot luna-chuan2ng-DIL-tua... Max. 3.3e4 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8Time, min

0.0

5.0e5

I...

0.82

XIC of +MRM (4 pairs): 237.000/194.000 Da ID: Carbamazepine from Sample 1 (Cot luna-chuan2ng-DIL... Max. 5.4e5 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8Time, min

0.0

5.0e5

I...

0.75

XIC of +MRM (4 pairs): 268.100/115.600 Da ID: Metoprolol from Sample 1 (Cot luna-chuan2ng-DIL-tua9... Max. 1.2e5 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8Time, min

0.00

1.00e5

I...

0.58

XIC of +MRM (4 pairs): 415.200/178.000 Da ID: Diltiazem from Sample 1 (Cot luna-chuan2ng-DIL-tua9) ... Max. 4.8e4 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8Time, min

0.0

4.8e4

I...

1.15

35

3.1.1.3. Tối ưu hoa các điều kiện khối phổ

Từ điều kiện sắc ký xác định được, tiến hành tối ưu các thông số nguồn

ion hóa bao gồm áp suất dòng khí hóa hơi dung môi (GAS1 & GAS2), tốc độ

dòng khí thổi làm sạch. Nhiệt độ hóa hơi dung môi để tín hiệu đo thu được cao

và ổn định nhất, hạn chế tối đa nhiễm bẩn thiết bị. Kết quả khảo sát thu được

thông số áp suất dòng khí hóa hơi dung môi GAS1: 35psi; GAS2: 65psi; thông

số khí thổi làm sạch 100 psi; thông số nhiệt độ hóa hơi dung môi 65°C. Điều

kiện nguồn ion hoá tối ưu được tổng kết trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Điều kiện nguồn ion hoá

Chế độ ion hóa ESI (+)

Điện thế ion hoá (V) 5000

Khí phun sương (psi) 35

Khí tăng cường (psi) 65

Nhiệt độ hoá hơi (°C) 65

Khí thổi (psi) 100

3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ky

Khảo sát trên các cột Hypersil Gold C18 50 x 2,1 mm;, cột Hypersil Gold

C8 50 x 2,1 mm; 1,9 µm, Cột Luna C18(2)-HST 50 x 3 mm; 2,5 µm nhận thấy

cột Hypersil Gold C8 50 x 2,1 mm; 1,9 µm cho pic cân đối, tín hiệu đo của pic

cao hơn. Do đó cột Hypersil Gold C8 50 x 2,1 mm; 1,9 µm được lựa chọn để

cho các nghiên cứu khảo sát về sau.

Các hệ pha động khác nhau gồm MeOH:axit formic 0,1%, MeOH:amoni

axetat 2 – 10 mM, MeOH:amoni bicacbonat 1 – 10 mM, MeCN:axit formic

0,1%, MeCN:amoni axetat 2 – 10 mM, MeCN:amoni bicacbonat 1 – 10 mM

được lựa chọn khảo sát cho thấy hệ pha động MeCN:amoni axetat 2 mM,

36

MeCN:amoni bicacbonat 1 mM, với tỷ lệ MeCN từ 80 – 90% cho hình dáng

pic, tín hiệu đo pic tốt nhất.

Khi thay đổi tỷ lệ của pha động gồm MeCN:amoni axetat (8:2), pic VDG

có cường độ tín hiệu giảm và xuất hiện hơi nước ngưng tụ ở buồng ion hóa.

Tuy nhiên, khi tăng tỷ lệ dung dịch MeCN:amoni axetat (9:1) pic của VDG có

cường độ tín hiệu cao và ổn định, hình dáng pic cân đối hơn nhưng nền mẫu

cao (1e3). Như vậy, khi sử dụng hệ pha động MeCN:amoni axetat, chất phân

tích bị ảnh hưởng của nền mẫu, làm giảm tín hiệu đo.

Hình 3.5. Sắc ky đồ cua mẫu chuân chứa VDG khi sử dụng hệ pha động

MeCN:amoni axetat 2mM (8:2)

Hình 3.6. Sắc ky đồ cua mẫu chuân chứa VDG khi sử dụng hệ pha động

MeCN:amoni axetat 2mM (9:1)

XIC of +MRM (1 pair): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1 (Ch... Max. 1.5e5 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8Time, min

0.0

1.0e4

2.0e4

3.0e4

4.0e4

5.0e4

6.0e4

7.0e4

8.0e4

9.0e4

1.0e5

1.1e5

1.2e5

1.3e5

1.4e5

1.5e5

Inte

nsity

, cps

1.03

0.05

XIC of +MRM (1 pair): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1 (Ch... Max. 1.5e5 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8Time, min

0.0

1.0e4

2.0e4

3.0e4

4.0e4

5.0e4

6.0e4

7.0e4

8.0e4

9.0e4

1.0e5

1.1e5

1.2e5

1.3e5

1.4e5

1.5e5

Inte

nsity

, cps

1.03

0.05

37

Với hôn hợp pha động MeCN:amoni bicacbonat, khi thay đổi tỷ lệ thành

phần pha động thì thời gian lưu, hình dáng pic, tín hiệu đo của VDG thay đổi

theo nhưng chất phân tích ít bị ảnh hưởng nền mẫu hơn. Với tỷ lệ MeCN:amoni

bicacbonat 1mM (95:5) xuất hiện pic VDG khá nhiễu, đuôi pic kéo dài;

MeCN:amoni bicacbonat 1mM (90:10) và MeCN:amoni bicacbonat 2mM

(80:20) pic của VDG xấu, nền mẫu cao. Ngược lại khi thành phần pha động

MeCN:amoni bicacbonat 1mM (85:15) thì pic VDG cân đối và thời gian phân

tích phù hợp. Do đó, tỷ lệ MeCN:amoni bicacbonat 1mM (85:15) được lựa

chọn làm thành phần pha động tối ưu.

Hình 3.7. Sắc ky đồ cua mẫu chuân chứa VDG khi sử dụng hệ pha động

MeCN:amoni bicacbonat 1mM (95:5)

Hình 3.8. Sắc ky đồ cua mẫu chuân chứa VDG khi sử dụng hệ pha động

MeCN:amoni bicacbonat 1mM (90:10)

XIC of +MRM (1 pair): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1 (... Max. 2.4e4 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8Time, min

0.0

2000.0

4000.0

6000.0

8000.0

1.0e4

1.2e4

1.4e4

1.6e4

1.8e4

2.0e4

2.2e4

2.4e4

Inte

nsity

, cps

0.92

XIC of +MRM (1 pair): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1 (... Max. 2.6e4 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8Time, min

0.0

2000.0

4000.0

6000.0

8000.0

1.0e4

1.2e4

1.4e4

1.6e4

1.8e4

2.0e4

2.2e4

2.4e4

2.6e4

Inte

nsity

, cps

0.85

38

Hình 3.9. Sắc ky đồ cua mẫu chuân chứa VDG khi sử dụng hệ pha động

MeCN:amoni bicacbonat 2mM (85:15)

Hình 3.10. Sắc ky đồ cua mẫu chuân chứa VDG khi sử dụng hệ pha động

MeCN:amoni bicacbonat 2mM (80:20)

Thể tích tiêm mẫu và tốc độ dòng cũng ảnh hưởng tới pic và tín hiệu đo.

Khi thể tích tiêm là 1µL pic của các chất cân đối, tín hiệu đo pic tại nồng độ

thấp VDG và IS đạt yêu cầu. Với tốc độ dòng 0,4mL/phút, các pic VDG có

hình dáng cân đối và thời gian phân tích ngắn, đồng thời tín hiệu pic VDG cao.

XIC of +MRM (1 pair): 304.000/154.000 Da ID: Vildagliptin from Sample 1... Max. 9407.0 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8Time, min

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

9407

Inte

nsi

ty, c

ps

0.77

0.54 0.900.43

39

Từ kết quả thực nghiệm ở trên, điều kiện sắc ký để định lượng VDG và

IS trên hệ thống LC-MS/MS được lựa chọn như sau:

• Cột Hypersil Gold C8 50 x 2,1 mm; 1,9 µm

• Pha động MeCN: amoni bicacbonat 1mM (85: 15)

• Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút

• Thể tích tiêm: 1µL

Như vậy, với hệ thống sắc ký lỏng siêu năng ở các điều kiện tối ưu ở

trên, quy trình tách diễn ra tương đối nhanh và tiêu tốn ít dung môi hóa chất,

do đó ít gây ô nhiễm môi trường hơn so với các phương pháp HPLC định lượng

VDG khác [8, 9, 11]. Hơn nữa, thời gian phân tích một mẫu khoảng 2 phút nên

phương pháp LC-MS/MS đã góp phần giảm đáng kể tổng thời gian phân tích

khi số lượng mẫu huyết tương nhiều, vì vậy sẽ rất phù hợp để áp dụng phân

tích các mẫu trong các nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) và tương đương sinh

học (TĐSH) (Hình 3.11)

Hình 3.11. Sắc ky đồ cua mẫu chuân chứa VDG và IS với điều kiện tối ưu

40

3.1.3. Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu huyết tương

Tiến hành chuẩn bị các mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn VDG và IS.

Xử lý các mẫu trắng và mẫu chuẩn theo bằng phương pháp kết tủa protein.

Sử dụng điều kiện sắc ký đã khảo sát, đánh giá quy trình xử lý mẫu ở

trên với tỷ lệ dung môi khác nhau (1:3; 1:4; 1:10). Qua quá trình phân tích mẫu

thấy được xử lý mẫu với tỷ lệ dung môi 1:3 dung dịch sau ly tâm hơi vẩn đục,

tỷ lệ 1:10 mẫu sạch nhưng mẫu bị pha loãng nhiều ảnh hưởng tín hiệu đo pic.

Vì vậy đã lựa chọn tỷ lệ 1:4 cho tín hiệu đo tốt, nền mẫu sạch.

So với kỹ thuật chiết SPE [11] để định lượng VDG, phương pháp xử lý

mẫu này đơn giản, kinh tế và dễ thực hiện hơn.

So với phương pháp chiết LLE [5, 7] mẫu thu được bằng phương pháp

kết tủa protein, tác nhân tạo kết tủa là MeCN, thời gian phân tích ngắn, đơn

giản, dễ thực hiện, tiết kiệm chi phí.

Do vậy, quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp kết tủa protein được tối

ưu hoá và thể hiện trên sơ đồ như sau:

Hình 3.12. Quy trình xử lý mẫu

250 µL mẫu huyết tương

Lắc xoáy 10s

Ly tâm 6500 vòng/phút x 5 phút

Hút lớp dịch trong

Tiêm sắc ký

+25µL IS

+ 1mL MeCN

41

3.1.4. Xây dựng phương pháp định lượng VDG trong huyết tương

Từ các kết quả nêu trên, phương pháp LC-MS/MS định lượng VDG

trong huyết tương người bao gồm xử lý mẫu bằng phương pháp kết tủa protein,

sau đó phân tích định lượng bằng LC-MS/MS được xây dựng tối ưu như sau:

3.1.4.1. Quy trình xử lý mẫu huyết tương

Bảng 3.2 trình bày tổng hợp các điều kiện sắc ký áp dụng phân tích VDG

và IS. Quy trình được tiến hành như sau: Hút 250 µL HT + 25 µL dung dịch IS

làm việc. Sau đó, thêm 1 mL MeCN, lắc xoáy 10 giây, rồi tiến hành ly tâm 6500

vòng/phút x 5 phút. Hút lấy lớp dịch nổi và tiến hành tiêm sắc ký.

Bảng 3.2. Điều kiện sắc ký

Thông số Mô tả

Detector MS/MS QTrap 6500+

Cột sắc ký Hypersil Gold C8; 50 x 2,1 mm; 1,9 µm

Bảo vệ cột C18; 4 x 3 mm

Nhiệt độ cột 40°C

Pha động MeCN : Amoni bicacbonat 1 mM (85 : 15)

Tốc độ dòng 0,4 mL/phút

Thể tích tiêm 1 µL

Nhiệt độ autosampler Nhiệt độ phòng

3.1.4.2.Điều kiện khối phổ

Bảng 3.3 tổng hợp tóm tắt các thông số điều kiện của thiết bị phổ khối

MS/MS, kiểu ion hóa ESI (+) với detector: Qtrap 6500+ để phân tích VDG và

IS. Các thông số của thiết bị khối phổ để định lượng VDG và IS trong huyết

tương.

42

Bảng 3.3. Điều kiện khối phổ đinh lượng VDG và IS

Hoạt chất

Thông số Vildagliptin

Carbamazepin

(IS)

Chế độ ion hóa ESI (+) ESI (+)

Điện thế ion hoá (V) 5000 5000

Khí phun sương (psi) 35 35

Khí tăng cường (psi) 65 65

Nhiệt độ hoá hơi (°C) 65 65

Năng lượng thế chọn lọc ion (V) 500 500

Khí thổi (psi) 100 100

Năng lượng phân mảnh (V) 21 27

Điện thế đầu ra bộ phận phân mảnh (V) 20 20

Mảnh mẹ (parent ion) (m/z, Dalton) 304 237

Mảnh con (product ion) (m/z, Dalton) 154 194

Hình 3.13 cho thấy sắc ký đồ của mẫu huyết tương chứa VDG và IS khi

thực hiện phân tách và phân tích khối phổ với các điều kiện tối ưu được thiết

lập ở trên. Sắc ký đồ cho thấy sự tồn tại các pic của VDG, IS rõ ràng, phù hợp

để phân tích định lượng.

43

Hình 3.13. Sắc ky đồ mẫu huyết tương chứa VDG và IS tại chế độ ESI (+)

3.1.5. Xác nhân giá trị sử dụng của phương pháp

3.1.5.1. Sự phù hợp cua hệ thống LC-MS/MS

Chuẩn bị mẫu SST trong huyết tương theo quy trình phân tích để kiểm

tra sự phù hợp của hệ thống. Xử lý mẫu theo quy trình phân tích đã xây dựng.

Tiêm lặp lại 6 lần mẫu thu được sau xử lý. Ghi lại SKĐ và tín hiệu đo pic của

6 lần phân tích.

Kết quả được trình bày ở Hình 3.14 và Bảng 3.4.

44

Hình 3.14. Sắc ky đồ cua mẫu huyết tương trắng có pha IS và chuân VDG ở

nồng độ 288 ng/mL

Bảng 3.4. Kết quả đánh giá sự phù hợp cua hệ thống

STT

VDG IS

VDG/IS

Diện tích pic tR (min) Diện tích pic tR (min)

1 12248565 0,494 8048427 0,478 1,522

2 12299777 0,496 7973970 0,479 1,542

3 12491302 0,495 8018237 0,477 1,558

4 12367001 0,496 7896209 0,479 1,566

5 12259423 0,495 7930986 0,479 1,546

6 12093378 0,495 7948610 0,478 1,521

TB 12293241 0,495 7969407 0,478 1,543

CV (%) 1,1 0,2 0,7 0,2 1,2

45

Trên sắc ký đồ của các mẫu huyết tương có pha thêm IS và chuẩn VDG,

pic của VDG cân đối, được nhận diện rõ ràng, tách khỏi các pic tạp có trong

mẫu. Giá trị diện tích của pic chất phân tích và tỷ lệ diện tích pic giữa VDG với

IS tương ứng đều có độ lặp lại tốt (CV < 5%). Thời gian lưu (tR) của pic VDG

có độ lặp lại cao (CV <1%). Như vậy hệ thống LS-MS/MS ổn định và phù hợp

để định lượng VDG trong huyết tương.

3.1.5.2. Độ chon loc cua phương pháp

Tiến hành chuẩn bị các mẫu:

- 06 mẫu HTT có nguồn gốc khác nhau

- 6 mẫu chuẩn trong huyết tương có chuẩn VDG ở nồng độ LLOQ (3

ng/mL) trong từng nguồn mẫu huyết tương trắng trên

- 01 đường chuẩn và các mẫu QC (LQC, MQC, HQC).

Kết quả được trình bày trên Hình 3.15, Hình 3.16, Hình 3.17, Bảng 3.5.

Hình 3.15. Sắc ky đồ cua mẫu huyết tương trắng (Blank)

46

Hình 3.16. Sắc ky đồ cua mẫu huyết tương trắng có pha IS (Zero)

Hình 3.17. Sắc ky đồ cua mẫu HTT có pha IS và chuân VDG nồng độ 3 ng/mL

(LLOQ)

47

Bảng 3.5. Ảnh hưởng cua mẫu trắng tại thời điểm trùng tR cua VDG và IS

STT

VDG IS

Blank LLOQ %Blank/LLOQ Blank CC-QC* %Blank/CC-

QC*

1 10215 198287 5,2 0 11149868 0,0

2 13326 227714 5,9 0 0,0

3 8546 156029 5,5 0 0,0

4 9528 213451 4,5 0 0,0

5 0 171897 0,0 0 0,0

6 15119 181251 8,3 0 0,0

CC-QC*: Tín hiệu đo IS trung bình của các mẫu CC, QC và LLOQ

Kết quả thực nghiệm cho thấy: trên SKĐ mẫu huyết tương trắng (Hình

3.15) tại thời điểm 0,48 và 0,51 (trùng với thời gian lưu của mẫu chuẩn VDG

và IS trong mẫu chuẩn như trên Hình 3.16) không xuất hiện các pic có mảnh

phổ m/z =304 → 154 (đặc trưng cho VDG) và mảnh phổ m/z =237 → 194 (đặc

trưng cho IS). Trên SKĐ mẫu chuẩn (Hình 3.17) các pic của VDG và IS có

hình dạng cân đối, tách khỏi hoàn toàn các pic tạp có trong mẫu.

Trong Bảng 3.5 tại thời điểm trùng với thời gian lưu của VDG, tín hiệu

đo pic của từng mẫu ứng pic của từng mẫu blank đều nhỏ hơn 20% tín hiệu đo

pic của mẫu LLOQ tương ứng. Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, tín

hiệu đo pic của từng mẫu blank đều nhỏ hơn 5% tín hiệu đo trung bình pic của

mẫu CC, QC và LLOQ [5, 34].

Như vậy, phương pháp phân tích VDG đã xây dựng đáp ứng được yêu

cầu về độ chọn lọc của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.

48

3.1.5.3. Đường chuân và khoảng tuyến tính

Đồ thị phần dư của các đường chuẩn thực nghiệm theo mô hình

weighting 1/x2 được thể hiện ở Hình 3.18.

Hình 3.18. Đồ thi phần dư cua các đường chuân thực nghiệm theo mô hình

weighting 1/x2

Kết quả khảo sát đường chuẩn theo mô hình weighting 1/x2 được trình

bày trong Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát đường chuân theo mô hình weighting 1/x2

Mẫu

Nồng

độ

(ng/mL)

Độ đúng %

Đường

chuẩn 1

Đường

chuẩn 2

Đường

chuẩn 3

Đường

chuẩn 4

Đường

chuẩn 5

S1 3,0 102,0 99,3 98,4 99,7 101,7

S2 6,0 97,0 101,9 102,1 101,0 96,9

S3 15,0 97,9 98,4 103,7 97,2 99,3

S4 30,0 101,2 98,6 98,2 100,4 102,1

80

90

100

110

120

0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 700.00

Độ đ

ún

g (

%)

Nồng độ (ng/mL)

Đồ thị phần dư

CC1 CC2 CC3 CC4 CC5

49

S5 60,1 95,3 104,1 99,6 107,2 94,8

S6 180,2 103,3 99,3 100,9 99,9 103,2

S7 420,4 101,5 99,1 100,4 95,4 99,6

S8 600,6 101,9 99,3 96,7 99,1 102,4

PTHQ

y= (ax + b)*

a= 0,0056 a= 0,0059 a= 0,0061 a= 0,0062 a= 0,0059

b= 0,0049 b= 0,0045 b= 0,0047 b= 0,0054 b= 0,0049

r = 0,9995 r = 0,9997 r = 0,9997 r = 0,9992 r = 0,9994

(*) y: tỷ lệ tín hiệu đo pic VDG/IS; x: nồng độ VDG trong mẫu huyết tương

Kết quả ở Bảng 3.6 cho thấy trong khoảng nồng độ 3 – 600 ng/mL có sự

tương quan tuyến tính giữa nồng độ VDG và tỷ lệ diện tích pic VDG/IS với hệ

số tương quan r ≥ 0,9992. Độ đúng của các nồng độ đều nằm trong giới hạn

cho phép (85 – 115%), đáp ứng yêu cầu về đường chuẩn của một phương pháp

phân tích thuốc trong dịch sinh học.

Khoảng tuyến tính được đánh giá trên 5 đường chuẩn riêng biệt để lựa

chọn hệ số tỷ trọng (1/x2). Với hệ số tỷ trọng lựa chọn, cả 5 đường chuẩn đều

có hệ số tương quan tuyến tính r > 0,9992 và nồng độ tính được từ đường chuẩn

so với nồng độ lý thuyết đều nằm trong giới hạn cho phép. Điều này chứng tỏ

có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ đường chuẩn và tỉ lệ tín hiệu đo pic

của VDG/IS. Do có khoảng tuyến tính rộng (3 – 600 ng/mL), phương pháp có

thể ứng dụng để đánh giá tương đương sinh học đối với chế phẩm chứa VDG

ở nhiều hàm lượng khác nhau.

3.1.5.4. Xác đinh giới hạn đinh lượng dưới (LLOQ)

Phân tích các mẫu huyết tương trắng và mẫu huyết tương chứa VDG với

nồng khoảng 3 ng/mL (mẫu LLOQ). Xác định diện tích pic VDG và chuẩn nội

của mẫu LLOQ, so sánh với đáp ứng chất phân tích trên mẫu trắng thêm chuẩn

50

nội (mẫu zero) và xác định nồng độ VDG có trong các mẫu từ đường chuẩn

tiến hành làm song song trong cùng điều kiện.

Kết quả đánh giá giới hạn định lượng dưới của phương pháp được trình

bày ở Bảng 3.7 và Bảng 3.8.

Bảng 3.7. Tín hiệu đo pic cua mẫu LLOQ và mẫu Zero tại tR cua VDG

STT Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3

Zero LLOQ Zero LLOQ Zero LLOQ

1

15694

144497

7220

106152

0

124656

2 140499 113668 127716

3 137253 120664 128485

4 146818 124154 125703

5 136867 122218 122070

6 131931 123009 124764

TB 139644 118311 125566

Tỷ lệ

LLOQ/Zero 8,9 16,4 -

(-): Không xác định

Bảng 3.8. Độ đúng, độ chính xác cua mẫu LLOQ

STT

Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3

Nồng độ

(ng/mL)

Độ đúng

(%)

Nồng độ

(ng/mL)

Độ đúng

(%)

Nồng độ

(ng/mL)

Độ đúng

(%)

1 3,2 106,0 3,5 117,1 3,2 106,0

2 3,1 103,1 4,0 133,7 3,3 108,6

51

3 3,1 103,4 3,2 105,9 3,2 106,3

4 3,2 105,8 3,0 98,9 3,2 105,7

5 3,0 101,5 2,9 96,6 3,1 102,7

6 3,1 102,5 2,9 97,0 3,2 105,6

TB 3,1 103,7 3,2 108,2 3,2 105,8

CV (%) 1,8 1,7 13,5 13,6 1,8 1,8

TB (n=18) 3,2 105,9

CV% (n=18) 7,7 7,9

Kết quả trong Bảng 3.7 cho thấy tại vị trí thời gian lưu của VDG, diện

tích của mẫu chuẩn ở nồng độ khoảng 3 ng/mL tỷ lệ diện tích pic của mẫu

LLOQ/Zero đều lớn hơn 5 lần. Bảng 3.8 cho thấy độ chính xác sau 6 lần phân

tích với giá trị CV (≤ 20%); độ đúng trung bình của từng ngày và của 3 ngày

(trong khoảng 80 – 120%). Như vậy mẫu chuẩn VDG có nồng độ 3 ng/mL đáp

ứng yêu cầu là LLOQ của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.

Giá trị LLOQ khoảng 3ng/mL xấp xỉ 1/100 Cmax, chứng tỏ phương pháp phân

tích đã xây dựng có đủ độ nhạy để định lượng VDG trong huyết tương người.

3.1.5.5. Ảnh hưởng cua nền mẫu

Các mẫu LQC và HQC được chuẩn bị trong nền mẫu và trong pha động,

sau đó được phân tích theo phương pháp đã xây dựng. Các hệ số MFVDG, MFIS

và tỷ lệ MFVDG/MFIS được xác định và trình bày trong Bảng 3.9. Kết quả cho

thấy tỷ số MFVDG/MFIS ở cả hai mức nồng độ thấp và cao (LQC và HQC) có

giá trị CV <15%, đáp ứng yêu cầu của một phương pháp phân tích thuốc trong

dịch sinh học.

52

Bảng 3.9. Kết quả đánh giá ảnh hưởng cua nền mẫu

STT

MFVDG MFIS MFVDG/MFIS

LQC HQC LQC HQC LQC HQC

1 0,612 0,652 0,105 0,099 5,820 6,613

2 0,625 0,669 0,109 0,112 5,753 5,963

3 0,703 0,683 0,119 0,113 5,884 6,034

4 0,621 0,647 0,106 0,110 5,862 5,897

5 0,614 0,673 0,116 0,115 5,299 5,838

6 0,645 0,665 0,112 0,109 5,780 6,083

TB 0,636 0,665 0,111 0,110 5,733 6,071

CV (%) 5,4 2,0 5,1 5,4 3,8 4,6

3.1.5.6. Độ nhiễm chéo

Các mẫu để phân tích và đánh giá độ nhiễm chéo được chuẩn bị và tiến

hành như mục 1.3.2.5.

Kết quả được trình bày ở Bảng 3.10 cho thấy: đáp ứng của mẫu LLOQ

tại thời điểm trùng với thời gian lưu của VDG gấp 9,0 – 20,0 lần tín hiệu đo pic

của từng mẫu trắng (lớn hơn 5 lần). Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của

IS, tín hiệu đo pic trung bình của mẫu LLOQ đều lớn hơn 20 lần tín hiệu đo pic

của từng mẫu trắng. Như vậy phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu về độ

nhiễm chéo của một phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.

53

Bảng 3.10. Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo

STT

Mẫu Blank Mẫu LLOQ Tỷ lệ tín hiệu đo pic

LLOQ/Blank

VDG IS VDG IS VDG IS

1 10002 0 144497 11226806 14,0 -

2 14350 0 140499 11338149 9,7 -

3 6967 0 137253 11042035 20,0 -

4 11472 0 146818 11438489 12,2 -

5 0 0 136867 11300587 - -

6 15564 0 131931 10741417 9,0 -

TB 139644 11181247

(-): Không xác định

3.1.5.7. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

Độ đúng, độ chính xác của phương pháp được nghiên cứu và đánh giá

trên 4 mức nồng độ: LLOQ (3 ng/mL), LQC (9 ng/mL), MQC (240 ng/mL) và

HQC (480 ng/mL). Môi ngày, tại môi mức nồng độ phân tích 6 mẫu. Xác định

hàm lượng VDG có trong mẫu bằng phương pháp đường chuẩn. Độ đúng là tỷ

lệ % giữa nồng độ xác định được từ đường chuẩn so với nồng độ lý thuyết. Độ

chính xác là độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả phân tích. Tiến hành lặp

lại trên 5 ngày khác nhau.

Kết quả độ đúng – độ chính xác trong ngày, kết quả độ đúng – độ chính

xác khác ngày được trình bày trong Bảng 3.11 cho thấy ở cả ba khoảng nồng độ

thấp, trung bình và của các mẫu QC, phương pháp có độ đúng trong ngày và

khác ngày nằm trong khoảng cho phép 85 – 115% (trừ nồng độ LLOQ có độ

54

đúng cho phép (80 – 120%), độ chính xác trong ngày và độ chính xác khác ngày

đều nằm trong giới hạn cho phép (giá trị CV ≤ 15%).

Bảng 3.11. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

Độ đúng,

Độ lặp lại

Mẫu LLOQ

(3 ng/ml)

Mẫu LQC

(9 ng/ml)

Mẫu MQC

(240 ng/ml)

Mẫu HQC

(480 ng/ml)

Độ

đúng

(%)

Độ lặp

lại

(CV%)

Độ

đúng

(%)

Độ lặp

lại

(CV%)

Độ

đúng

(%)

Độ lặp

lại

(CV%)

Độ

đúng

(%)

Độ lặp

lại

(CV%)

Ngày 1 (n = 6) 103,7 1,7 106,4 4,3 107,7 3,2 107,2 2,5

Ngày 2 (n = 6) 108,2 13,6 94,3 1,3 101,3 3,3 104,8 1,5

Ngày 3 (n = 6) 105,8 1,8 98,8 1,8 99,6 1,6 101,1 1,2

Ngày 4 (n = 6) 104,6 3,2 96,8 1,3 104,1 1,0 105,8 3,5

Ngày 5 (n = 6) 106,2 2,5 96,3 2,2 103,0 3,4 106,4 1,3

Khác ngày (n = 5) 105,7 6,3 98,5 4,9 103,1 3,7 105,1 2,9

3.1.5.8. Độ lặp lại khi tiêm lại

- Chuẩn bị mẫu đường chuẩn và 6 mẫu ở môi mức nồng độ LQC, MQC

và HQC.

- Tiêm các mẫu QC cùng với đường chuẩn.

- Tiêm lại các mẫu QC và tính lại nồng độ dựa vào đường chuẩn ban

đầu.

Kết quả xác định và đánh giá độ lặp lại khi tiêm lại được trình bày ở

Bảng 3.12 cho thấy độ đúng trung bình ứng với môi mức nồng độ QC đều nằm

trong khoảng từ 85 – 115% nồng độ lý thuyết. Độ lặp lại giữa các nồng độ phân

tích được ứng với môi mức nồng độ QC có giá trị CV% ≤ 15%. Như vậy

55

phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại khi tiêm lại của một

phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.

Bảng 3.12. Độ lặp lại khi tiêm lại

STT

Mẫu tiêm lần đầu

LQC: 8,97 ng/mL MQC: 239,25

ng/mL

HQC: 478,49

ng/mL

Nồng độ

(ng/mL)

Độ

đúng

(%)

Nồng độ

(ng/mL)

Độ đúng

(%)

Nồng độ

(ng/mL)

Độ đúng

(%)

1 8,27 92,1 249,44 104,3 495,05 103,5

2 8,53 95,1 231,23 96,6 496,71 103,8

3 8,44 94,1 248,55 103,9 506,10 105,8

4 8,48 94,5 236,68 98,9 502,00 104,9

5 8,46 94,3 250,05 104,5 493,67 103,2

6 8,56 95,5 237,73 99,4 513,48 107,3

TB 8,46 94,3 242,28 101,3 501,17 104,8

CV (%) 1,2 1,3 3,3 3,3 1,5 1,5

Mẫu tiêm lại

STT

LQC: 8,97 ng/mL MQC: 239,25

ng/mL

HQC: 478,49

ng/mL

Nồng độ

(ng/mL)

Độ

đúng

(%)

Nồng độ

(ng/mL)

Độ đúng

(%)

Nồng độ

(ng/mL)

Độ đúng

(%)

56

1 8,54 95,2 256,44 107,2 498,62 104,2

2 8,77 97,8 242,76 101,5 506,92 105,9

3 8,84 98,5 255,10 106,6 494,21 103,3

4 8,2 93,0 242,89 101,5 488,83 102,2

5 8,63 96,2 256,37 107,2 497,34 103,9

6 8,84 98,5 246,50 103,0 498,16 104,1

TB 8,72 97,3 250,01 104,5 497,35 103,9

CV (%) 1,4 1,4 2,7 2,7 1,2 1,2

3.1.5.9. Độ đúng, độ chính xác khác khi pha loãng mẫu 2 lần

- Chuẩn bị các mẫu pha loãng để khảo sát độ đúng, độ chính xác của

phương pháp khi pha loãng. Tiến hành pha loãng mẫu 2 lần trong huyết tương

bằng cách: Hút 125 µL mẫu chuẩn, thêm 125 µL huyết tương trắng, lắc đều.

- Chuẩn bị 01 đường chuẩn và các mẫu QC trong huyết tương.

- Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình phân tích. Phân tích sắc ký, ghi lại

sắc ký đồ và tín hiệu đo pic.

- Xác định nồng độ, độ đúng và độ chính xác của các mẫu pha loãng.

Kết quả xác định và đánh giá độ đúng, độ chính xác khi pha loãng mẫu

2 lần được trình bày ở Bảng 3.13 cho thấy độ đúng trung bình tại môi mức nồng

độ pha loãng nằm trong khoảng 85 – 115% so với nồng độ thực đã pha. Độ lặp

lại giữa các nồng độ có giá trị CV% ≤ 15%. Như vậy, phương pháp phân tích

hoàn toàn đáp ứng được yêu cầu về độ đúng – độ chính xác khi pha loãng của

một phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.

57

Bảng 3.13. Độ đúng, độ chính xác khi pha loãng

STT

Mẫu pha loãng: 968,89 ng/mL

Hệ số pha loãng: 2

VDG IS VDG/IS Nồng độ

(ng/mL)

Độ đúng

(%)

1 26273020 9408271 2,793 900,00 92,9

2 26445714 9318046 2,838 914,66 94,4

3 25373219 9300522 2,728 879,30 90,8

4 26956270 9676402 2,786 897,83 92,7

5 26411028 9320095 2,834 913,26 94,3

6 27541341 9603129 2,868 924,25 95,4

TB 904,88 93,4

CV (%) 1,6 1,7

3.1.5.10. Xác đinh độ thu hồi cua chất phân tích và chuân nội

- Xác định độ thu hồi của phương pháp ở ba khoảng nồng độ: LQC, MQC

và HQC.

- Chuẩn bị các lô mẫu QC trong huyết tương, môi lô mẫu QC gồm 6 mẫu

độc lập, xử lý và phân tích theo quy trình. Ghi lại sắc ký đồ và tín hiệu đo pic.

- Chuẩn bị các lô mẫu trong nền mẫu sau xử lý và có nồng độ tương ứng

với nồng độ các mẫu QC, môi lô mẫu gồm 6 mẫu độc lập. Phân tích định lượng

trực tiếp các mẫu trên không qua giai đoạn chiết tách. Ghi lại sắc ký đồ và tín

hiệu đo pic. Xác định độ thu hồi của VDG và IS bằng cách so sánh kết quả tín

hiệu đo pic của chuẩn, chuẩn nội trong các mẫu QC pha trong huyết tương (có

58

qua chiết tách) với tín hiệu đo pic của các mẫu tương ứng pha trong nền mẫu

(không qua chiết tách).

Kết quả khảo sát và đánh giá độ thu hồi của IS, VDG được trình bày lần

lượt trong Bảng 3.14 và Bảng 3.15 cho thấy, ở các khoảng nồng độ thấp, trung

bình và cao, tỷ lệ thu hồi của VDG đạt được từ 92,7 – 103,2%; tỷ lệ thu hồi của

IS là 100,1%; có CV ≤ 15% đối với mẫu huyết tương và CV ≤ 10% với mẫu

pha trong pha động, độ thu hồi tại các nồng độ chênh lệch nhau không quá 15%,

đáp ứng yêu cầu về độ nhiễm chéo của một phương pháp phân tích thuốc trong

dịch sinh học.

Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ thu hồi cua IS

STT

Tín hiệu đo pic IS

Mẫu trong huyết tương Mẫu pha trong nền mẫu

(không chiết tách)

1 9576204 9010226

2 9945901 9390534

3 9549825 9488040

4 9592075 9361129

5 9866755 8878993

6 9366261 10211537

7 9480251 9374875

8 9246130 9615891

9 9367460 9775542

10 9068263 9877974

59

11 9398848 9957832

12 9301933 9540177

13 9014624 9585006

14 9139450 9673293

15 9409839 9664500

16 9380244 9261784

17 9298572 10071936

18 9305612 9760587

TB 9406014 9583325

CV

(%) 2,6 3,6

Độ thu

hồi (%) 100,1

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ thu hồi cua VDG

STT

LQC MQC HQC

Mẫu

trong

huyết

tương

Mẫu pha

trong nền

mẫu

Mẫu

trong

huyết

tương

Mẫu pha

trong nền

mẫu

Mẫu

trong

huyết

tương

Mẫu pha

trong nền

mẫu

1 468180 522236 13947867 14196514 27560856 27512230

2 479609 517245 14035664 14264111 27890236 27075849

60

3 468653 520547 13803632 14113496 28213286 27460194

4 473246 514959 13755972 14319135 28077915 27919973

5 481853 525768 13840611 14046828 28669080 28623680

6 479226 536164 14033902 13968673 28454426 28295060

TB 475128 522820 13902941 14151460 28144300 27814498

CV

(%) 1,2 1,4 0,9 0,9 1,4 2,1

Độ

thu

hồi

(%)*

92,7 100,2 103,2

(*): Kết quả được tính toán với hệ số hiệu chỉnh

3.1.5.11. Nghiên cứu độ ổn đinh

Độ ổn đinh thời gian dài cua dung dich VDG gốc

- Sau khi chuẩn bị dung dịch gốc, chuyển một lượng dung dịch gốc vào

các lọ có nhãn trước và bảo quản trong tủ lạnh (từ 2 – 8°C) trong thời gian dự

kiến để nghiên cứu độ ổn định.

- Mẫu độ ổn định sẽ được phân tích song song với mẫu dung dịch gốc

pha sau 28 ngày.

- Pha loãng dung dịch gốc đến nồng độ thích hợp. Tiêm 3 lần để đánh

giá sự ổn định của độ ổn định dung dịch gốc thời gian dài.

- Đánh giá độ ổn định bằng cách so sánh mẫu ổn định với mẫu mới pha.

- Xác định thời gian ổn định: Thời gian cất mẫu bảo quản được coi là

thời gian bắt đầu ổn định. Thời gian kết thúc được là thời gian lấy mẫu để phân

tích.

61

Kết quả được trình bày trong Bảng 3.16. Nồng độ VDG trong dung dịch

mới pha được phân tích ngay theo quy trình so với nồng độ VDG trong dung

dịch được phân tích sau 28 ngày bảo quản ở nhiệt độ (2 – 8°C) lệch nhau không

quá 15% và các giá trị CV đều ≤ 15%. Như vậy, dung dịch gốc VDG ổn định ở

nhiệt độ 2 – 8°C trong 28 ngày.

Bảng 3.16. Kết quả độ ổn đinh dung dich chuân gốc VDG theo thời gian

STT

Dung dịch gốc mới pha Dung dịch gốc sau 28 ngày

Tín hiệu đo

pic

Nồng độ

(µg/mL)

Tín hiệu đo

pic

Nồng độ

(µg/mL)

1 43019291

239,0

45279705

240,2 2 44121722 44200332

3 44081953 44898845

TB 43740989 44792961

CV (%) 1,4 1,2

% Độ ổn

định 101,9

Độ ổn đinh thời gian dài cua dung dich chuân nội gốc thời gian dài

- Phân tích, so sánh nồng độ dung dịch chuẩn nội gốc bảo quản ở

nhiệt độ 2 – 8°C sau thời gian 9 ngày với nồng độ của dung dịch chuẩn nội

mới pha tương ứng.

Kết quả được trình bày trong Bảng 3.17 cho thấy, độ lệch giữa nồng độ

dung dịch IS bảo quản ở điều kiện 2 – 8°C sau thời gian 9 ngày so với nồng độ

dung dịch IS mới pha khác nhau ≤ 2%. Như vậy, dung dịch IS gốc ổn định ở

điều kiện bảo quản 2 – 8°C trong 9 ngày.

62

Bảng 3.17. Kết quả độ ổn đinh dung dich nội chuân gốc theo thời gian

Mẫu Nồng độ (mg/mL)

Ban đầu Sau 9 ngày

1 10,096 10,168

2 10,092 10,155

3 10,087 10,144

TB 10,092 10,156

CV (%) 0,0 0,1

Độ lệch (%) 0,6

Độ ổn đinh thời gian ngắn cua dung dich chuân gốc ở nhiệt độ phòng

Độ ổn định thời gian ngắn của dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ phòng

được xác định thông qua phân tích, so sánh nồng độ dung dịch chuẩn gốc

bảo quản ở nhiệt độ phòng sau 21 giờ với nồng độ của dung dịch chuẩn mới

pha tương ứng. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.18 cho thấy Độ ổn định

99,6% (nằm trong khoảng 85 – 115%). Giá trị CV (%) giữa các kết quả định

lượng tại từng thời điểm ≤ 5%. Như vậy, dung dịch chuẩn gốc làm việc ổn định

ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 21 giờ.

Bảng 3.18. Kết quả độ ổn đinh dung dich chuân gốc trong thời gian ngắn

STT

Dung dịch gốc mới pha Dung dịch ổn định 21 giờ

Tín hiệu đo

pic

Nồng độ

(µg/mL)

Tín hiệu đo

pic

Nồng độ

(µg/mL)

1 63547940

238,5

65634453

240,2

2 63828812 62259607

63

3 63536462 63608945

TB 63637738 63834335

CV (%) 0,3 2,7

% Độ ổn định 99,6%

Độ ổn đinh thời gian ngắn cua dung dich IS gốc ở nhiệt độ phòng

Phân tích, so sánh đáp ứng dung dịch chuẩn nội gốc bảo quản ở nhiệt

độ phòng sau thời gian 21 giờ với đáp ứng của dung dịch chuẩn nội mới

pha tương ứng. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.19 cho thấy, độ ổn định

đạt 100,6% (nằm trong khoảng 85 – 115%) và giá trị CV (%) giữa các kết quả

định lượng tại từng thời điểm ≤ 5%. Như vậy, dung dịch IS làm việc ổn định ở

điều kiện nhiệt độ phòng trong 21 giờ.

Bảng 3.19. Kết quả độ ổn đinh dung dich chuân nội gốc trong thời gian ngắn

STT

Dung dịch gốc mới pha Dung dịch ổn định 21 giờ

Tín hiệu đo

pic

Nồng độ

(µg/mL)

Tín hiệu đo

pic

Nồng độ

(µg/mL)

1 102202158

2,538

103485303

2,546 2 100936778 102075578

3 101740845 102244188

TB 101626594 102601690

CV (%) 0,6 0,8

% Độ ổn định 100,6

Độ ổn đinh cua mẫu huyết tương sau 6 chu kỳ đông – rã đông

64

- Độ ổn định đông rã của mẫu huyết tương được đánh giá ở nồng độ LQC

(LGCS) và HQC (HQCS).

- Chuẩn bị các mẫu QC trong huyết tương người ở nồng độ LQC và

HQC. Bảo quản các mẫu ở -70°C trong ít nhất 12 giờ và rã đông ở nhiệt độ

phòng. Sau 6 chu kỳ đông rã, xác định nồng độ của các mẫu đó. Các mẫu ổn

định được phân tích cùng với đường chuẩn và các mẫu QC mới pha. So sánh

nồng độ trung bình của các mẫu ổn định với nồng độ thực tế khi pha.

- Độ ổn định phải nằm trong khoảng 85 – 115%.

- Giá trị CV (%) giữa các kết quả định lượng tại từng thời điểm phải ≤

15 %.

Kết quả được trình bày ở Bảng 3.20. Nồng độ VDG trong cả 2 lô mẫu

LQC và HQC bảo quản sau 6 chu kỳ đông – rã đông khác không quá 15% so

với nồng độ ban đầu, CV ≤ 15%. Như vậy, mẫu ổn định khi được bảo quản sau

6 chu kỳ đông – rã.

Bảng 3.20. Độ ổn đinh cua mẫu huyết tương sau 6 chu kỳ đông – rã

LQCS: 8,96 ng/mL

STT Tín hiệu pic

VDG

Tín hiệu pic

IS

Tỷ lệ tín hiệu

pic VDG/IS

Nồng độ

(ng/mL)

1 397006 4773456 0,083 8,85

2 395559 4638272 0,085 9,07

3 393333 4808253 0,082 8,70

4 397384 4913238 0,081 8,61

5 402689 4999822 0,081 8,57

6 399169 5021608 0,079 8,46

65

TB 8,71

CV (%) 2,3

% Độ ổn định 97,2

HQCS: 477,70 ng/mL

STT Tín hiệu pic

VDG

Tín hiệu pic

IS

Tỷ lệ tín hiệu

pic VDG/IS

Nồng độ

(ng/mL)

1 21786908 5018845 4,341 454,67

2 23763521 4966023 4,785 501,18

3 21136862 5099075 4,145 434,17

4 21961287 5017183 4,377 458,46

5 21905940 5063621 4,326 453,11

6 22491961 5098813 4,411 462,02

TB 460,60

CV (%) 4,4

% Độ ổn định 96,4

Độ ổn đinh cua mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn

Độ ổn định mẫu huyết tương thời gian ngắn được đánh giá ở nồng độ

LQC và HQC.

- Chuẩn bị các mẫu QC trong huyết tương người ở nồng độ LQC và

HQC. Bảo quản các mẫu ở nhiệt độ phòng trong 5 giờ. Xác định nồng độ của

các mẫu đó. Các mẫu ổn định được phân tích cùng với đường chuẩn và các mẫu

QC mới pha. So sánh nồng độ trung bình của các mẫu ổn định với với nồng độ

pha thực tế.

66

- Lấy mẫu ra khỏi tủ lạnh sâu được coi là thời gian bắt đầu độ ổn định và

thời gian bắt đầu xử lý được coi là thời gian kết thúc độ ổn định.

Kết quả được trình bày ở Bảng 3.21.

Bảng 3.21. Kết quả độ ổn đinh cua mẫu huyết tương trong thời gian ngắn

Thời gian ổn định: 5 h

LQCS: 8,96 ng/mL

STT Tín hiệu pic

VDG

Tín hiệu pic

IS

Tỷ lệ tín

hiệu pic

VDG/IS

Nồng độ

(ng/mL)

1 487704 9636395 0,052 7,65

2 485250 9023942 0,054 7,96

3 461240 8436837 0,055 8,10

4 475551 8741086 0,054 8,06

5 484330 8746963 0,055 8,20

6 466042 8639536 0,054 7,99

TB 7,99

CV (%) 2,2

% Độ ổn định 89,2

HQCS: 477,70 ng/mL

STT Tín hiệu pic

VDG

Tín hiệu pic

IS

Tỷ lệ tín

hiệu pic

VDG/IS

Nồng độ

(ng/mL)

67

1 27831960 8606814 3,234 472,92

2 27769238 8902093 3,119 456,20

3 27906848 8793047 3,174 464,15

4 26947912 8724280 3,089 451,73

5 27862579 8511270 3,274 478,75

6 27547466 8371104 3,291 481,26

TB 467,50

CV (%) 2,4

% Độ ổn định 97,9

Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.21 cho thấy, nồng độ VDG

trong mẫu LQC và HQC của các mẫu ổn định có giá trị CV ≤ 15% và độ ổn định

trong khoảng cho phép. Như vậy, mẫu huyết tương ổn có định ở nhiệt độ phòng

trong thời gian ngắn (5 giờ).

Độ ổn đinh mẫu huyết tương không kiềm hóa thời gian ngắn, bảo quản

trong thùng đá (~ 4°C)

- Độ ổn định mẫu huyết tương không kiềm hóa thời gian ngắn, bảo quản

trong thùng đá được đánh giá ở nồng độ LQC và HQC.

- Chuẩn bị các mẫu QC trong huyết tương người ở nồng độ LQC và

HQC. Bảo quản ngay các mẫu ở trong thùng đá 1 giờ. Xác định nồng độ của

các mẫu đó. Các mẫu ổn định được phân tích dựa trên đường chuẩn và các mẫu

QC mới pha. So sánh nồng độ trung bình của các mẫu ổn định với với nồng độ

pha thực tế.

- Lấy lại từ tủ lạnh sâu được coi là thời gian bắt đầu ổn định và thời gian

bắt đầu xử lý được coi là thời gian kết thúc ổn định.

Kết quả được trình bày trong Bảng 3.22.

68

Bảng 3.22. Độ ổn đinh cua mẫu huyết tương không kiềm hoá trong thời gian

ngắn bảo quản trong thùng đá (~ 4°C)

Thời gian ổn định: 1 h

LQCS: 9,03 ng/mL

STT Tín hiệu pic

VDG

Tín hiệu pic

IS

Tỷ lệ tín

hiệu pic

VDG/IS

Nồng độ

(ng/mL)

1 338711 4645018 0,073 7,77

2 344339 4613604 0,075 7,95

3 347697 4533524 0,077 8,17

4 350776 4444374 0,079 8,40

5 352630 4478627 0,079 8,38

6 358001 4471962 0,080 8,52

TB 8,20

CV (%) 3,2

% Độ ổn định 90,8

HQCS: 481,67 ng/mL

STT Tín hiệu pic

VDG

Tín hiệu pic

IS

Tỷ lệ tín

hiệu pic

VDG/IS

Nồng độ

(ng/mL)

1 19917154 4498211 4,428 463,76

2 20294018 4569468 4,441 465,16

69

3 20287960 4515038 4,493 470,63

4 20503707 4710631 4,353 455,89

5 20398577 4594962 4,439 464,97

6 20273533 4528063 4,477 468,94

TB 464,89

CV (%) 1,0

% Độ ổn định 96,5

Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.22 cho thấy, nồng độ VDG

trong mẫu LQC và HQC được xử lý ngay theo quy trình so với nồng độ VDG

trong mẫu được xử lý sau 1 giờ bảo quản trong thùng đá (~ 4°C) (khác nhau

không quá 15% và các giá trị CV đều ≤ 15%. Như vậy, mẫu huyết tương không

kiềm hoá thời gian ngắn bảo quản trong thùng đá (~ 4°C) ổn định 1 giờ.

Độ ổn đinh thời gian dài cua mẫu huyết tương

- Độ ổn định mẫu huyết tương thời gian dài được đánh giá ở nồng độ

LQC và HQC.

- Chuẩn bị các mẫu QC trong huyết tương người ở nồng độ LQC và

HQC. Bảo quản các mẫu ở -70°C. Sau khoảng thời gian dự kiến (12, 18, 23, 34

và 77 ngày), xác định nồng độ của các mẫu độ ổn định. Các mẫu ổn định được

phân tích cùng với đường chuẩn và các mẫu QC mới pha. So sánh nồng độ

trung bình của các mẫu ổn định với nồng độ pha thực tế.

- Thời gian cất các mẫu độ ổn định trong tủ đông sâu được coi là thời

gian bắt đầu độ ổn định.

- Thời gian lấy mẫu ra khỏi tủ lạnh sâu là thời gian kết thúc độ ổn định.

Kết quả được trình bày trong Bảng 3.23.

70

Bảng 3.23. Độ ổn đinh cua huyết tương trong thời gian dài (77 ngày)

LQCS: 8,96 ng/mL

STT Tín hiệu pic

VDG

Tín hiệu pic

IS

Tỷ lệ tín

hiệu pic

VDG/IS

Nồng độ

(ng/mL)

1 502649 12120287 0,041 7,55

2 478599 12287558 0,039 7,11

3 497186 11256745 0,044 8,02

4 520921 12178298 0,043 7,77

5 530794 11780803 0,045 8,17

6 534031 11172661 0,048 8,65

TB 7,88

CV (%) 6,2

% Độ ổn định 87,9

HQCS: 477,70 ng/mL

STT Tín hiệu pic

VDG

Tín hiệu pic

IS

Tỷ lệ tín

hiệu pic

VDG/IS

Nồng độ

(ng/mL)

1 28232919 11027245 2,560 445,55

2 28308150 10253712 2,761 480,41

71

3 27255693 9791200 2,784 484,40

4 28408363 9659290 2,941 511,76

5 27919711 10530809 2,651 461,36

6 28432493 9886244 2,876 500,44

TB 480,65

CV (%) 4,6

% Độ ổn định 100,6

Kết quả thực nghiệm cho thấy: Nồng độ VDG trong các mẫu bảo quản ở

điều kiện -70°C trong 77 ngày nằm trong khoảng 85 – 115% so với mức nồng độ

pha lý thuyết. Như vậy, VDG ổn định trong HT khi bảo quản ở điều kiện -70°C

trong vòng 77 ngày.

Độ ổn đinh cua mẫu sau xử lý (bảo quản trong auto – sampler)

- Khảo sát ở hai nồng độ LQC và HQC.

- Chuẩn bị mẫu QC trong huyết tương người ở nồng độ LQC và HQC.

Xử lý mẫu theo quy trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp. Mẫu sau

xử lý được bảo quản trong autosampler ở nhiệt độ phòng. Sau 75 giờ, phân tích

sắc ký để xác định nồng độ chất phân tích có trong mẫu so sánh với nồng độ

pha lý thuyết. Quá trình phân tích mẫu độ ổn định được phân tích song song

với mẫu QC và mẫu đường chuẩn.

Kết quả được trình bày trong Bảng 3.24.

Bảng 3.24. Kết quả độ ổn đinh cua mẫu bảo quản trong autosampler

Thời gian ổn định: 75 h

LQCS: 8,96 ng/mL

72

STT Tín hiệu pic

VDG

Tín hiệu pic

IS

Tỷ lệ tín

hiệu pic

VDG/IS

Nồng độ

(ng/mL)

1 431083 8248988 0,052 9,05

2 447229 8269695 0,054 9,34

3 433630 8288427 0,052 9,06

4 442997 8573892 0,052 8,96

5 447694 8315012 0,054 9,30

6 470706 8228292 0,057 9,84

TB 9,26

CV (%) 3,5

% Độ ổn định 103,3

HQCS: 477,70 ng/mL

STT Tín hiệu pic

VDG

Tín hiệu pic

IS

Tỷ lệ tín

hiệu pic

VDG/IS

Nồng độ

(ng/mL)

1 27172787 8711397 3,119 496,12

2 26680587 8929802 2,988 475,26

3 26537916 8650347 3,068 487,96

4 26804884 8859071 3,026 481,27

5 27492035 9132407 3,010 478,84

73

6 31491773 12645181 2,490 396,26

TB 469,29

CV (%) 7,8

% Độ ổn định 98,2

Kết quả ở Bảng 3.24 cho thấy, nồng độ VDG trong mẫu LQC và HQC

được xử lý theo quy trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp đã thực

hiện và được tiêm sắc ký sau khi bảo quản ở 75 giờ trong autosampler ở nhiệt

độ phòng khác nhau không quá 15% và các giá trị CV ≤ 15%. Do vậy, mẫu

huyết tương sau khi xử lý ổn định trong vòng 75 giờ trong autosampler ở nhiệt

độ phòng.

Như vậy, có thể nói quy trình xử lý mẫu và phân tích định lượng VDG

trong mẫu huyết tương người được xây dựng có độ thu hồi cao và ổn định, trên

90% ở các khoảng nồng độ thấp, trung bình và cao (Bảng 3.14 và Bảng 3.15).

Quá trình xử lý mẫu đơn giản, kinh tế và phù hợp với điều kiện trang thiết bị

phòng thí nghiệm hiện có ở Việt Nam. Do vậy, có thể triển khai phương pháp

chiết này để xử lý hàng loạt mẫu trong nghiên cứu SKD/TĐSH.

3.2. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG VDG TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI

TÌNH NGUYỆN

Để đánh giá khả năng ứng dụng của phương pháp cho các nghiên cứu

SKD và TĐSH các chế phẩm thuốc chứa VDG đang lưu hành trên thị trường.

chúng tôi đã áp dụng phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng và xác nhận giá trị

sử dụng ở trên để xác định nồng độ VDG trong huyết tương của 23 NTN với

736 mẫu huyết tương trong nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học chế

phẩm viên nén bao phim Vildagliptin 50 mg sản xuất tại Việt Nam.

SKĐ phân tích mẫu huyết tương của một số NTN tại thời điểm trước và

sau khi dùng thuốc được trình bày ở Hình 3.19 đến Hình 3.22. Mặc dù số người

tình nguyện tham gia vào nghiên cứu này là 23 người nhưng mục đích chính

không phải đánh giá các thông số dược động học của VDG mà nhằm xác nhận

74

giá trị sử dụng và tính khả thi của phương pháp phân tích được xây dựng nên

trong luận văn này chỉ trình bày kết quả nồng độ VDG trong huyết tương của

01 NTN (01 giai đoạn) trong Bảng 3.25.

Bảng 3.25. Kết quả nồng độ VDG trong huyết tương 01 NTN

STT Thời gian (h) Tín hiệu pic

VDG

Tín hiệu

pic IS

Tỷ lệ

tín hiệu

pic

VDG/IS

Nồng độ

(ng/mL)

1 0 0 3877974 0,000 0,0

2 0,25 991144 3176727 0,312 34,1

3 0,5 5220754 3069280 1,701 184,3

4 0,75 8581218 2931320 2,927 316,9

5 1 11550467 2960969 3,901 422,1

6 1,33 14310296 3068712 4,663 504,5

7 1,67 12853375 2943971 4,366 472,4

8 2 11317745 2916461 3,881 419,9

9 2,5 10093229 3134933 3,220 348,5

10 3 8056870 2974747 2,708 293,2

11 4 6234188 2934883 2,124 230,0

12 6 3795682 2621006 1,448 156,9

13 8 2077215 2666146 0,779 84,6

14 12 449601 2842672 0,158 17,5

15 15 110889 2856774 0,039 4,6

16 24 9093 2942873 0,003 0,7*

Cmax (ng/mL) 504,5

Tmax (h) 1,33

75

T1/2 (h) 1,67

AUClast (ng/mL*h) 2132,7

AUCinf (ng/mL*h) 2143,7

% AUClast/AUCinf 99,5%

Ghi chú: (*): Dưới giới hạn đinh lượng dưới

Hình 3.19. Sắc ky đồ mẫu huyết tương NTN trước khi uống thuốc

XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vil... Max. 1270.0 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8Time, min

0.00

5.00e5

1.00e6

1.23e6

Inte

nsity

, ...

0.40 0.57 0.960.61 1.070.01 1.180.860.42 1.22 1.560.72 1.34 1.380.270.16 1.59

XIC of +MRM (2 pairs): 237.000/194.000 Da ID: Car... Max. 1.2e6 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8Time, min

0.00

5.00e5

1.00e6

1.23e6

Inte

nsity

, ...

0.47

XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vil... Max. 1270.0 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8Time, min

0

500

1000

1270

Inte

nsity

, ...

0.40

0.57

0.960.61 1.070.01 1.180.860.42

1.22 1.560.49 0.72 1.34 1.380.270.16 1.59

76

Hình 3.20. Sắc ky đồ mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc 1,33 giờ

Hình 3.21. Sắc ky đồ mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc 12 giờ

XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vild... Max. 4.4e6 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8Time, min

0.0

1.0e6

2.0e6

3.0e6

4.0e6

Inte

nsity

, ...

0.53

XIC of +MRM (2 pairs): 237.000/194.000 Da ID: Car... Max. 1.3e6 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8Time, min

0.0

5.0e5

1.0e6

1.3e6

Inte

nsity

, ...

0.47

XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vild... Max. 4.4e6 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8Time, min

0.0

1.0e6

2.0e6

3.0e6

4.0e6

Inte

nsity

, ...

0.53

XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vild... Max. 1.4e5 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8Time, min

0.00

2.00e5

4.00e5

6.00e5

8.00e5

1.00e6

1.17e6

Inte

nsity

, ...

0.53

XIC of +MRM (2 pairs): 237.000/194.000 Da ID: Car... Max. 1.2e6 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8Time, min

0.00

2.00e5

4.00e5

6.00e5

8.00e5

1.00e6

1.17e6

Inte

nsity

, ...

0.47

XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vild... Max. 1.4e5 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8Time, min

0.0

5.0e4

1.0e5

1.4e5

Inte

nsity

, ...

0.53

77

Hình 3.22. Sắc ky đồ mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc 24 giờ

Hình 3.23. Đường cong nồng độ VDG trong mẫu huyết tương cua NTN theo

thời gian

XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vil... Max. 2900.0 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8Time, min

0.00

5.00e5

1.00e6

1.21e6

Inte

nsity

, ...

0.520.400.27 1.040.76 1.17 1.510.94 1.20 1.330.790.05 0.65 1.380.19 1.60

XIC of +MRM (2 pairs): 237.000/194.000 Da ID: Car... Max. 1.2e6 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8Time, min

0.00

5.00e5

1.00e6

1.21e6

Inte

nsity

, ...

0.47

XIC of +MRM (2 pairs): 304.000/154.000 Da ID: Vil... Max. 2900.0 cps.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8Time, min

0

500

1000

1500

2000

2500

2900

Inte

nsity

, ...

0.52

0.40

0.27 1.040.76 1.17 1.510.94 1.20 1.330.790.05 1.380.19 1.60

0

100

200

300

400

500

600

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Nồ

ng

độ

VD

G (

ng

/mL

)

Thời gian (h)

78

Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng VDG trong huyết

tương một người tình nguyện cho thấy:

Trên sắc ký đồ mẫu huyết tương của NTN trước khi uống thuốc (Hình

3.19), không có mảnh ion đặc trưng của VDG (m/z 304 → 154) và của IS (m/z

237 → 194) do vậy nền mẫu huyết tương không ảnh hưởng đến độ chọn lọc

của phương pháp. Sau khi NTN sử dụng 01 viên VDG 50 mg, trên sắc ký đồ

mẫu huyết tương của NTN này đều xuất hiện các pic tương ứng đặc trưng của

VDG và IS trong các mẫu chuẩn. Pic của VDG và IS trong các mẫu huyết tương

NTN sau khi dùng thuốc có hình dạng cân đối (Hình 3.20, Hình 3.21, Hình

3.22). Như vậy, phương pháp LC-MS/MS đã nghiên cứu có tính đặc hiệu –

chọn lọc cao, có thể sử dụng để định lượng VDG trong huyết tương người.

Hầu hết các mẫu đều có nồng độ VDG trên giới hạn định lượng dưới

(LLOQ). Giá trị Cmax (504,5 ng/mL) gần bằng nồng độ cao nhất của đường

chuẩn (600 ng/mL) nên không phải tiến hành pha loãng mẫu trong quá trình

phân tích. Giá trị LLOQ (3 ng/mL) bằng khoảng 1/100 lần giá trị Cmax với mức

liều 50 mg. Đa số các mẫu đều nằm trong khoảng tuyến tính được xác nhận giá

trị sử dụng (3 – 600 ng/mL). Do đó, khoảng tuyến tính đã xây dựng phù hợp để

định lượng nồng độ VDG trong huyết tương người.

Tỷ lệ phần trăm giá trị AUClast/AUCinf là 99,49% (lớn hơn 80%) chứng

tỏ thời điểm lấy mẫu đáp ứng yêu cầu của US-FDA [30, 31] và EMA [32] về

nghiên cứu tương đương sinh học.

Có ít nhất 2 nồng độ mẫu QC (LQC và MQC) đều nằm trong khoảng

nồng độ của NTN làm tăng độ đúng, độ chính xác của kết quả định lượng đáp

ứng các yêu cầu của US-FDA và EMA về phân tích thuốc trong dịch sinh học [16-

18], hoàn toàn phù hợp để áp dụng phân tích mẫu của NTN.

Giá trị Cmax, Tmax, T1/2 và AUC phù hợp với các tài liệu đã công bố. [7,

12, 36, 37]. Vì vậy, phương pháp phân tích VDG đã xây dựng và được xác nhận

giá trị sử dụng có thể áp dụng để nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng và

tương đương sinh học đối với các chế phẩm chứa VDG.

79

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Đề tài nghiên cứu của luận văn đã xây dựng thành công phương pháp

định lượng VDG trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ

(LC-MS/MS) sử dụng nguồn ion hóa kiểu phun điện dương (ESI +) theo chế

độ đo chọn lọc đa ion (MRM). Quy trình phân tích đã được xác nhận giá trị sử

dụng đầy đủ và đạt các yêu cầu của một phương pháp phân tích thuốc trong

dịch sinh học theo hướng dẫn hiện hành của US-FDA và EMA. Phương pháp

có độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác rất cao, thời gian phân tích ngắn (2

phút cho môi mẫu) có giá trị thực tiễn và khả thi để áp dụng định lượng nồng

độ VDG trong mẫu huyết tương NTN, đánh giá tương đương sinh học cho các

chế phẩm chứa VDG. Mẫu huyết đương được xử lý bằng kỹ thuật kết tủa

protein sử dụng dung dịch MeCN sau khi rã đông ở nhiệt độ phòng. Phương

pháp có độ chọn lọc cao với VDG; có giới hạn định lượng dưới (LLOQ) thấp

3 ng/mL (khoảng 1/100 Cmax ở mức liều 50 mg); khoảng nồng độ tuyến tính

rộng (3 – 600 ng/mL) trong khoảng từ 1/100 – 1/50 Cmax đến 2 – 3Cmax; không

bị ảnh hưởng của nền mẫu với giá trị CV đạt yêu cầu (< 15%); không bị nhiễm

chéo; độ đúng cao, độ lặp lại tốt với CV ≤ 15%; độ thu hồi hoạt chất cao và ổn

định (trên 92,7%) và ổn định trong các điều kiện bảo quản khác nhau (5 giờ ở

nhiệt độ phòng, 1 giờ trong thùng đá (~ 4°C), 75 giờ trong autosampler, sau 6

chu kì đông – rã và 77 ngày ở nhiệt độ -70°C).

Đề tài đã áp dụng phương pháp trên để xác định nồng độ của VDG trong

mẫu huyết tương NTN ở các thời điểm khác nhau với liều 50 mg. Kết quả cho

thấy phương pháp phân tích đã xây dựng có tính chọn lọc cao, khoảng tuyến

tính phù hợp để định lượng nồng độ VDG trong mẫu huyết tương người.

4.2. KIẾN NGHỊ

Sau khi thực hiện đề tài này, chúng tôi có một số kiến nghị sau:

- Tiếp tục triển khai và áp dụng phương pháp trong các nghiên cứu SKD

và TĐSH chế phẩm có chứa dược chất VDG với các hàm lượng khác nhau, các

chế phẩm đa thành phần có chứa VDG và theo dõi nồng độ VDG trong điều trị.

80

- Kỹ thuật LC-MS/MS có những ưu điểm vượt trội về độ nhạy, tính đặc

hiệu và chọn lọc. Do vậy, cần tiếp tục mở rộng và ứng dụng kỹ thuật này trong

các nghiên cứu SKD và TĐSH, đặc biệt cho các chế phẩm có hàm lượng, liều

dùng thấp.

81

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] M.F. Abdel-Ghany, O. Abdel-Aziz, M.F. Ayad, M.M. Tadros, 2014,

Validation of different spectrophotometric methods for determination of

vildagliptin and metformin in binary mixture, Spectrochimica Acta Part A:

Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 125, pp. 175-182.

[2] T. Boovizhikannan, V.K. Palanirajan, 2013, RP-HPLC determination of

vildagliptin in pure and in tablet formulation, Journal of Pharmacy Research,

7(1), pp. 113-116.

[3] A.A. El-Zaher, H.A. Hashem, E.F. Elkady, M.A. Allam, 2019, A validated

LC-MS/MS bioanalytical method for the simultaneous determination of

dapagliflozin or saxagliptin with metformin in human plasma, Microchemical

Journal, 149, p 104017.

[4] R. Pontarolo, A.C. Gimenez, T.M.G. de Francisco, R.P. Ribeiro, F.L.D.

Pontes, J.C. Gasparetto, 2014, Simultaneous determination of metformin and

vildagliptin in human plasma by a HILIC–MS/MS method, Journal of

Chromatography B, 965, pp. 133-141.

[5] Trần Tử An, 2007, Hoá Phân Tích, Nhà Xuất Bản Y Học, Bộ Y Tế.

[6] National Center for Biotechnology Information, PubChem Compound

Summary for CID 6918527, Vildagliptin,

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Galvus, Accessed 2021.

[7] Y.-L. He, D. Serra, Y. Wang, J. Campestrini, G.-J. Riviere, C.F. Deacon,

J.J. Holst, S. Schwartz, J.C. Nielsen, M. Ligueros-Saylan, 2007,

Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Vildagliptin in Patients with Type

2 Diabetes Mellitus, Clinical Pharmacokinetics, 46(7), pp. 577-588.

[8] A. Shakoor, A. Adnan, M. Ahmed, 2019, Simultaneous Determination of

Metformin and Vildagliptin by HPLC in Human Plasma: Application to

Pharmocokinetic Studies, Latin American Journal of Pharmacy, 38(7), pp.

1416-1423.

[9] A. Pharne, B. Santhakumari, A.S. Ghemud, H. Jain, M. Kulkarni, 2012,

Bioanalytical method development and validation of vildagliptin a novel

dipeptidyl peptidase iv inhibitor by RP-HPLC method, International Journal

of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 4, pp. 119-123.

[10] C. Hess, F. Musshoff, B. Madea, 2011, Simultaneous identification and

validated quantification of 11 oral hypoglycaemic drugs in plasma by

electrospray ionisation liquid chromatography–mass spectrometry, Analytical

and Bioanalytical Chemistry, 400(1), pp. 33-41.

82

[11] M. Attimarad, S.H. Nagaraja, B.E. Aldhubaib, A. Al-Najjar, 2014,

Development of a rapid reversed phase-high performance liquid

chromatography method for simultaneous determination of metformin and

vildagliptin in formulation and human plasma, Journal of Young Pharmacists,

6(4), pp. 40-46.

[12] R.I. ElBagary, H.M.E. Azzazy, E.F. ElKady, F. Farouk, 2016,

Simultaneous determination of metformin, vildagliptin, and 3-amino-1-

adamantanol in human plasma: Application to pharmacokinetic studies,

Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 39(4), pp. 195-

202.

[13] P. Hu, Q. Yin, F. Deckert, J. Jiang, D. Liu, L. Kjems, W.P. Dole, Y.-L.

He, 2009, Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Vildagliptin in Healthy

Chinese Volunteers, The Journal of Clinical Pharmacology, 49(1), pp. 39-49.

[14] T.M. Annesley, 2003, Ion suppression in mass spectrometry, Clin Chem,

49(7), pp. 1041-1044.

[15] Phạm Luận, 2014, Phương Pháp Phân Tich Sắc Ký Và Chiết Tách, Nhà

xuất bản Bách Khoa Hà Nội.

[16] The United States Pharmacopeia 38 and National Formulary 33, 2015,

Volume 1, <1088> In Vivo and In Vitro Evaluation of Dosage Forms, The

United States Pharmacopoeial Convention, Rockville, MD 20852, pp.

[17] The United States Pharmacopeia 38 and National Formulary 33, 2015,

Volume 1, <1090> In Vivo Bioequivalence Guidances, The United States

Pharmacopoeial Convention, Rockville, MD 20852, pp.

[18] The United States Pharmacopeia 38 and National Formulary 33, 2015,

Volume 1, <1090> Assessment of Drug Product Performance -

Bioavailability, Bioequivalence, and Dissolution, The United States

Pharmacopoeial Convention, Rockville, MD 20852, pp.

[19] Bộ Y Tế, 2017, Dược Điển Việt Nam V, PL4, Nhà Xuất Bản Y Học, Hà

Nội.

[20] Somenath Mitra, 2003, Sample Preparation Techniques in Analytical

Chemistry, 162, John Wiley & Sons, Hoboken, New Jersey.

[21] Wilfried M. A. Niessen, 2006, Liquid Chromatography - Mass

Spectrometry, Third ed., CRC/Taylor & Francis, LLC.

[22] David A. Wells, 2003, 5, Chapter 6 Protein precipitation: High

throughput techniques and strategies for method development, Progress in

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Elsevier, 199-254.

83

[23] E. Rogatsky, D. Stein, 2005, Evaluation of Matrix Effect and

Chromatography Efficiency: New Parameters for Validation of Method

Development, Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 16(11),

pp. 1757-1759.

[24] R.R. Burgess, 2009, 463, Chapter 20 Protein Precipitation Techniques,

in: R.R. Burgess, M.P. Deutscher (Eds.), Methods in Enzymology, Academic

Press, 331-342.

[25] R. dos Santos, A.L. Carvalho, A.C.A. Roque, 2017, Renaissance of protein

crystallization and precipitation in biopharmaceuticals purification,

Biotechnology Advances, 35(1), pp. 41-50.

[26] S. Liu, Z. Li, B. Yu, S. Wang, Y. Shen, H. Cong, 2020, Recent advances

on protein separation and purification methods, Advances in Colloid and

Interface Science, 284, p 102254.

[27] P.L. Kole, G. Venkatesh, J. Kotecha, R. Sheshala, 2011, Recent advances

in sample preparation techniques for effective bioanalytical methods,

Biomedical Chromatography, 25(1‐2), pp. 199-217.

[28] O.S. Ahmed, Y. Ladner, C. Bousquet, J. Montels, P. Dubský, L. Philibert,

C. Perrin, 2020, Direct salting-out assisted liquid–liquid extraction (SALLE)

from human blood: Application for the analysis of tyrosine kinase inhibitors,

Microchemical Journal, 155, p 104791.

[29] N. Li, T. Zhang, G. Chen, J. Xu, G. Ouyang, F. Zhu, 2021, Recent

Advances in Sample Preparation Techniques for Quantitative Detection of

Pharmaceuticals in Biological Samples, TrAC Trends in Analytical Chemistry,

p 116318.

[30] FDA, 2003, Guidance for Industry - Bioavailability and Bioequivalence

Studies for Orally Administered Drug Products - General Considerations, U.S.

Department of Health and Human Services.

[31] FDA, 2018, Bioanalytical Method Validation: Guidance for Industry, U.S.

Department of Health and Human Services.

[32] European Medicines Agency, 2012, Guideline on Bioanalytical Method

Validation.

[33] The Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, 2005, Volume II,

Guidances in vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Drug

Preparations, in: C.P. Commission (Ed.), People's Medical Publishing House,,

A207-A210.

[34] ASEAN, 2015, ASEAN Guideline for The Conduct of Bioequivalence

Studies.

84

[35] N. Kumar, S.R. Devineni, G. Singh, A. Kadirappa, S.K. Dubey, P. Kumar,

2016, Identification, isolation and characterization of potential process-related

impurity and its degradation product in vildagliptin, Journal of Pharmaceutical

and Biomedical Analysis, 119, pp. 114-121.

[36] Y.-L. He, R. Sabo, G. Sunkara, M.-N. Bizot, G.-J. Riviere, S. Leon, M.

Ligueros-Saylan, W.P. Dole, D. Howard, 2007, Evaluation of Pharmacokinetic

Interactions Between Vildagliptin and Digoxin in Healthy Volunteers, The

Journal of Clinical Pharmacology, 47(8), pp. 998-1004.

[37] K. Sakthimanigandan, M. Ganesh, V. Kanthikiran, T. Sivakumar, H. Jang,

2015, Liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)

method for the determination of Vildagliptin in rat plasma, Acta

Chromatographica, 27(2), pp. 295-307.

85

PHỤ LỤC

1. Chứng chỉ phân tích của các chất chuẩn

2. Sắc ký đồ của các mẫu huyết tương NTN trước và sau khi uống thuốc

3. Sắc ký đồ của mẫu đường chuẩn và mẫu kiểm tra