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免疫組織化学染色

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平成２９年度 免疫組織化学サーベイ報告

免疫組織化学染色（TTF-1）

【はじめに】

Thyroid transcription factor-1 (TTF-1)はホメオドメインタンパクファミリーに属し、甲状腺、

肺の上皮細胞で特異的に発現している転写因子である。このタンパクは甲状腺特異遺伝子の転写調

節因子であり、また肺特異分化誘導遺伝子の活性化にも関与していることが示されている。

本抗体の染色、正常組織においては、肺の II 型肺胞上皮細胞、クララ細胞、甲状腺濾胞上皮細

胞の核に反応性を示す。

腫瘍組織においては肺および甲状腺の腫瘍細胞に反応性を示す。また、大部分の肺小細胞癌と原

発性および転移性肺腺癌と反応するが、中皮腫とは反応を示さないことから、原発性の肺腺癌と悪

性中皮腫を鑑別するのに有用なマーカーのひとつである。

【材料および実施方法】

今回使用した検体は肺腫瘍（手術材料；10％中性緩衝ホルマリン液固定）を薄切し、室温で1時

間乾燥させたものを2枚配布し各施設で染色していただいた。

なお、染色工程により染色結果に差異が生じると思われたので、所定の報告書をweb上で公開し、

各施設で現在行っている方法の記入もお願いした。

また、一次抗体販売メーカー４社、アジレント・テクノロジ－株式会社（以下アジレント社）、

ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社（以下ロシュ社）、ニチレイバイオサイエンス株式会

社（以下ニチレイ社）、ライカマイクロシステムズ株式会社（以下ライカ社）に同一標本を染色

していただき、その染色性を判定の基準として使用した。

【判定方法】

下記の項目を基準に判定した。

① 目的とする細胞、部位が染色されていること。

② 染色ムラや非特異反応がないこと。

以上の項目について判定者は、兵臨技・病理細胞検査研究班 解析委員で行い、病理医の立場

から、伊藤 智雄先生（神戸大学医学部附属病院 病理部）にご確認頂いた。

判定基準は、『ＡあるいはＢ．診断上支障のない標本』、『Ｃ．診断上支障をきたす標本』と

して、慎重なる評価判定を行った。

【結 果】

＜集計にあたって＞

１）申し込み施設32施設に対し、回収施設数32施設（100％）であった。

昨年のKi-67の参加34施設に比べ2施設減少した。

＜集計結果＞

TTF-1染色についての集計結果は別表に示すごとくである。また、日常業務でのTTF-1染色につ

いても記載している。

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染色の判定結果および講評評価

平成29年度の免疫染色サーベイではTTF-1をテーマに染色・評価を行った。

参加施設は32施設で、協力メーカーは（アジレント、ロシュ、ニチレイ、ライカの4社。

各施設で使用した一次抗体メーカーの染色性と見比べ、染色強度や陽性率、染色ムラ、非特異的反

応、切片の剥離について、メーカーの染色性と遜色ない染色性であった施設を「Ａ」、メーカーの染

色性よりも弱いまたは強い、切片の剥離、細胞形態の異常がみられた施設は「Ｂ」、陽性所見がない

または非特異反応が強すぎるなど判定に影響がある施設は「Ｃ」として評価をおこなった。

今回の評価結果は「Ａ」が１８施設、「Ｂ」が１４施設となり、「Ｃ」評価の施設はなく比較的良

好な結果となったが、残念なことに標本を紛失した施設が１施設あった。

染色対象は肺組織を使用し、腫瘍部分と正常部分の確認できるものを使用した。

染色方法については自動染色装置を使用した施設が27施設（84％）、用手法は5施設（16％）であっ

た。自動染色装置はロシュ社が74％と多く、ライカ社22％、ニチレイ社4％のシェアであった。用手法

についてはニチレイ社のみであった。自動染色装置で染色した施設と、用手法で染色した施設間での

違いは見られなかった。

一次抗体についてはアジレント社（８Ｇ７Ｇ３/１）を使用している施設が最も多く１２施設、ロ

シュ（ＳＰ１４１）を使用している施設は９施設、次いでニチレイ社（ＳＰＴ２４）は６施設、ライ

カ社（ＳＰＴ２４）は４施設、日本ターナー株式会社（８Ｇ７Ｇ３/１）１施設であった。

染色結果について、TTF‐1というメジャーな抗体であるがメーカー間での染色性が異なっていた。

特にメーカー間というよりは抗体クローンにより染色性の差異が認められた。（ＳＰ１４１）抗体を

用いた施設にＡ判定が多く染色性がきれいであった。（８Ｇ７Ｇ３/１）抗体は染色性が比較的薄く、

ムラの多い施設が多かった。

TTF‐1に関してクローンの違いによる染色性の検討が行われており、肺癌に対する感度と特異性の

相違ならびに肺腺癌以外に肺扁平上皮癌や悪性中皮腫との反応性が報告されている。今回は肺腺癌の

組織を使用したが、使用するクローンの特性や染色性をよく理解したうえで、その評価および判定・

解釈について十分注意して染色をする必要がある。

参加施設の判定結果（ランク総数）は（表1）に示し、染色の評価は下記のごとくである（表2）。

参加施設の判定結果（ランク総数）（表1）

【結 語】

TTF-1 染色の精度管理における結果は『診断上支障のない標本』と判定されたのが 32 施設中 32

施設（100％）という満足な結果が得られた。

（文責：病理細胞検査研究班、精度管理解析・編集委員）

判 定 ＡおよびＢ．診断上支障のない標本 Ｃ．診断上支障をきたす標本

標本数 32 0

（％） 100％ 0％

ＡおよびＢ 目的とする細胞、部位が染色され、判定に影響のある染色ムラや

非特異反応が見られない。病理診断をするにおいて差し支えのな

い標本である。 診断上支障のない標本

Ｃ 目的とする細胞、部位が染色されていない。または判定に影響の

ある染色ムラや非特異反応が見られる。診断上支障をきたす標本

である。 診断上支障をきたす標本

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平成29年度（第37回）兵臨技臨床検査精度管理

ＴＴＦ－１免疫染色検査報告書（表2）

施設番号 評価 備考

9280001 Ｂ やや感度不足

9280002 Ｂ 感度不足

9280003 Ｂ やや感度不足

9280033 Ａ

9280035 Ａ

9280051 Ａ

9280059 Ｂ コントラスト悪く、非特異反応あり

9280083 Ｂ 感度不足

9280091 Ａ

9280092 Ａ

9280095 Ａ

9280099 Ａ

9280100 Ａ

9280115 Ｂ 感度不足、非特異反応

9280125 Ａ

9280130 Ｂ やや感度不足

9280135 Ｂ 非特異反応、不適切counter stain

9280140 Ａ

9280143 Ｂ 共染

9280146 Ａ

9280148 Ａ

9280149 Ｂ 感度不足

9280162 Ｂ 感度不足

9280169 Ａ

9280187 Ｂ 感度不足

9280280 Ａ

9280305 Ａ

9280322 Ｂ 非特異反応

9280390 Ａ

9780014 Ｂ わずかに非特異反応

9780032 Ａ

9780066 Ａ

免疫染色サーベイ：TTF-1

x4

x4

x4

x4

x4

x4

x4

x4

アジレント社（8G7G3/1）

ニチレイ社（SPT24）※切片上のキズは標本送付時についたものです

ライカ社（SPT24)　

ロシュ社（SP141）

B評価：アジレント社（8G7G3/1）使用施設

B評価：ニチレイ社（SPT24）使用施設

B評価：ライカ社（SPT24）使用施設

A評価：ロシュ社（SP141）使用施設

第37回兵臨技

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TTF-1 染色についての集計

１． 貴施設では1ヶ月何枚位、TTF-1 染色をしていますか。

染色枚数 施設数 %

10枚以下 23 72 %

11～30枚 6 19 %

31～50枚 3 9 %

２．何μｍで薄切していますか。

厚さ (μm) 施設数 %

～3 14 44 %

～4 16 50 %

～5 2 6 %

３．今回貴施設で行った方法を下記の欄に具体的に記入して下さい。

（1） 染色方法

染色方法 施設数 %

自動染色装置 27 84 %

用手法 5 16 %

染色装置

メーカー 染色装置名 施設数 %

ロシュ

ベンチマーク XT 7 26 %

ベンチマーク GX 5 18 %

ベンチマーク ULTRA 8 30 %

ライカ BOND MAX 4 15 %

BOND Ⅲ 2 7 %

ニチレイ HISTOSTAINER 36A 1 4 %

（2）使用試薬

【一次抗体】

メーカー名 クローン名 自動染色

施設数

用手法

施設数

合計

施設数 %

アジレント 8G7G3/1 11 1 12 38 %

ロシュ SP141 9 0 9 28 %

ニチレイ SPT24 3 3 6 19 %

ライカ

(Novocastra) SPT24 3 1 4 12 %

日本ターナー 8G7G3/1 1 0 1 3 %

【二次抗体・発色基質】

メーカー名 キット名 自動染色

施設数

用手法

施設数

合計

施設数 %

ロシュ

I-VIEW DAB ﾕﾆﾊﾞｰｻﾙｷｯﾄ 10 0 10 31 %

ultraView DAB ﾕﾆﾊﾞｰｻﾙｷｯﾄ 7 0 7 22 %

記載なし 3 0 3 9 %

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ライカ Bond Polymer Refine Detection 6 0 6 19 %

ニチレイ ﾋｽﾄﾌｧｲﾝ ｼﾝﾌﾟﾙｽﾃｲﾝ

MAX-PO(MULTI)、DAB基質キット 1 5 6 19 %

【染色方法・使用試薬まとめ】

染色方法・装置名 一次抗体メーカー/

クローン名 検出キット 施設数

ﾍﾞﾝﾁﾏｰｸXT

ｱｼﾞﾚﾝﾄ / 8G7G3/1

I-VIEW DABﾕﾆﾊﾞｰｻﾙｷｯﾄ 1

ultraView DABﾕﾆﾊﾞｰｻﾙｷｯﾄ 1

記載なし 1

ﾛｼｭ / SP141 ultraView DABﾕﾆﾊﾞｰｻﾙｷｯﾄ 2

ﾆﾁﾚｲ / SPT24 I-VIEW DABﾕﾆﾊﾞｰｻﾙｷｯﾄ 1

日本ﾀｰﾅｰ / 8G7G3/1 I-VIEW DABﾕﾆﾊﾞｰｻﾙｷｯﾄ 1

ﾍﾞﾝﾁﾏｰｸGX ｱｼﾞﾚﾝﾄ / 8G7G3/1

I-VIEW DABﾕﾆﾊﾞｰｻﾙｷｯﾄ 2

記載なし 1

ﾛｼｭ / SP141 I-VIEW DABﾕﾆﾊﾞｰｻﾙｷｯﾄ 2

ﾍﾞﾝﾁﾏｰｸULTRA

ｱｼﾞﾚﾝﾄ / 8G7G3/1 ultraView DABﾕﾆﾊﾞｰｻﾙｷｯﾄ 1

記載なし 1

ﾛｼｭ / SP141 I-VIEW DABﾕﾆﾊﾞｰｻﾙｷｯﾄ 3

ultraView DABﾕﾆﾊﾞｰｻﾙｷｯﾄ 2

ﾆﾁﾚｲ / SPT24 ultraView DABﾕﾆﾊﾞｰｻﾙｷｯﾄ 1

BOND MAX ｱｼﾞﾚﾝﾄ / 8G7G3/1

Bond Polymer Refine Detection 2

ﾗｲｶ / SPT24 2

BOND Ⅲ ｱｼﾞﾚﾝﾄ / 8G7G3/1

Bond Polymer Refine Detection 1

ﾗｲｶ / SPT24 1

HISTOSTAINER 36A ﾆﾁﾚｲ / SPT24 ﾋｽﾄﾌｧｲﾝ ｼﾝﾌﾟﾙｽﾃｲﾝ 1

用手法

ｱｼﾞﾚﾝﾄ / 8G7G3/1

ﾋｽﾄﾌｧｲﾝ ｼﾝﾌﾟﾙｽﾃｲﾝ

1

ﾆﾁﾚｲ / SPT24 3

ﾗｲｶ / SPT24 1

（３）染色プロトコール

【抗原賦活化】

抗原賦活化 自動染色

施設数

用手法

施設数 施設数 %

する 27 5 32 100 %

しない 0 0 0 0 %

【抗原賦活化方法】

賦活装置 緩衝液名

緩衝液

pH 処理温度 処理時間 施設数

自動

染色

ロシュ

染色装置

CC1 buffer 8.5 90～100℃

60分 6

64分 3

76分 1

90分 1

記載なし 1

記載なし 8

ライカ

染色装置

Epitope

Retrieval

Solution 1

6 100℃ 20分 1

30分 2

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Epitope

Retrieval

Solution 2

9 100℃ 20分 1

記載なし 2

自動制御恒温装置

HEAT PRO Ⅱ

ヒストファイン

抗原賦活液 9 100℃ 40分 1

用手

法

電子レンジ

ヒストファイン

抗原賦活液 9 100℃ 5分×2回 1

10mM クエン酸

緩衝液 6 100℃ 10分 1

ウォーターバス ヒストファイン

抗原賦活液 9 98℃

40分 1

60分 1

その他 記載なし 98℃ 40分 1

【一次抗体】

染色法 一次抗体

メーカー

一次抗体

希釈倍率 反応温度 反応時間 施設数

ロシュ

染色装置

アジレント

希釈済み 42℃ 32分 1

50倍

室温 32分 1

37℃ 32分 1

60分 1

200倍 42℃ 32分 1

記載なし 3

ロシュ 希釈済み

37℃

16分 3

32分 2

36分 1

42℃ 32分 1

記載なし 2

ニチレイ 希釈済み 37℃ 16分 1

32分 1

日本ターナー 100倍 37℃ 32分 1

ライカ

染色装置

アジレント

希釈済み 室温 15分 1

200倍 室温 15分 1

記載なし 1

ライカ

希釈済み 室温 15分 1

100倍 室温 15分 1

200倍 室温 15分 1

ニチレイ ニチレイ 希釈済み 室温 30分 1

用手法

アジレント 100倍 室温 30分 1

ニチレイ 希釈済み 室温

20分 1

30分 1

60分 1

ライカ 100倍 室温 60分 1

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【二次抗体】

染色法 二次抗体

メーカー 反応温度 反応時間 施設数

ロシュ染色装置 ロシュ

室温 16分 1

37℃ 8分 11

42℃ 8分 3

記載なし 5

ライカ染色装置 ライカ 室温 8分 6

ニチレイ染色装置 ニチレイ 室温 30分 1

用手法 ニチレイ 室温 30分 5

【発色基質】

染色法 発色基質

メーカー 反応時間 施設数

ロシュ染色装置 ロシュ

8分 14

20分 1

記載なし 5

ライカ染色装置 ライカ 10分 6

ニチレイ染色装置 ニチレイ 5分 1

用手法 ニチレイ

1分未満 1

2～3分 1

5分 1

5～10分 1

10分 1

日常業務での TTF-1染色についての集計

１．固定液

固定液の種類 施設数

20％ ホルマリン 1

10％ 中性緩衝ホルマリン 23

15％ 中性緩衝ホルマリン 2

20％ 中性緩衝ホルマリン 6

２．採取から固定までの時間 ３．固定時間

時間 施設数

直ちに 20

10分以内 2

30分以内 4

1時間以内 3

2時間以内 1

不明 2

４．コントロールの有無

施設数 自動染色 用手法

あり 20 17 3

なし 12 10 2

固定時間 施設数

12時間以内 5

24時間以内 19

48時間以内 5

72時間以内 3

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コントロールの材料

材料 施設数

マルチコントロール 1

肺 10

甲状腺 6

肺・甲状腺 1

肺腺癌、肺扁平上皮癌、

大腸癌を一つにしたもの 1

記載なし 1

５．染色のコツがあれば記入してください

・標本撥水防止のため、スキムミルクに10分浸す

・背景汚染の対処を行うため、染色装置にかける前に5％スキムミルクに10分程度反応させる

・内部コントロールで染色態度がわかる抗体はコントロールをつけていないが、陽性がわから

ない抗体は陽性コントロールを同じプレパラートをつけて染色している

６．日常業務の免疫組織化学での悩みなどあればご記入してください

・染色頻度が少ない抗体は使用期限内に使用できないことがある

・コントロールをどのように作製すれば良いのかわからない

・稀に機械のエラーでうまく染まらないことがある

・コントロールが無く、見つけるのに苦労しています

・コントロールの確保・管理

・コントロールが立てられないものへの対応について(ウイルス関係など）

・一次抗体の種類が多く、管理が難しい

・ｐ53を染色時、特に検体が骨髄液の場合バックグラウンドが染まってしまう

７． 今後、免疫染色サーベイを行ってほしい項目があれば記入してください

・CD30、p53

・項目の希望ではないですが、試料の送付をブロックでして頂けると助かります