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日本臨床細胞学会関東連合学術集会 2012年9月8日 高崎
呼吸器細胞診検体の液状化処理と 非小細胞肺癌の診断・治療のための
遺伝子解析
中西陽子1、関 利美2、根本則道1,2
1日本大学医学部病態病理学系病理学分野 2日本大学医学部附属板橋病院病理診断科
肺癌診療における細胞診の重要性 検診における早期癌の発見 生検困難、手術適応のない進行肺癌の診断 LBCの活用：ThinPrep2000(オリンパス) 標本作製以外に残余検体の保存が可能 ↓ 標的細胞を含む貴重な検体 免疫染色 遺伝子発現解析 遺伝子変異解析 診断・治療への情報提供
肺癌診療に求められていること
細胞診の役割
良性 悪性 非腫瘍
腫瘍 小細胞癌 非小細胞癌
肺癌薬物療法の進歩 治療感受性、副作用の予測に 基づく厳密な治療法選択 細胞形態とともに細胞が持つ分子レベルの情報
腺癌 扁平上皮癌 大細胞癌 その他
EGFR遺伝子変異 ALK融合遺伝子
LBC 免疫染色 肺癌の組織型鑑別
日本肺癌学会 肺癌診療ガイドライン 肺癌の病理・細胞診断ガイドライン 2011年6月 より抜粋
TTF-1 CK18 CK7
ThinPrep法
ThinPrep法
擦り合わせ法
擦り合わせ法
CEA
Calretinin WT1 CK14
肺腺癌 すべて×400
5
第51回日本肺癌学会総会ワークショップ
ADCC Cocktail 抗体 TTF-1, NapsinA
SqCC Cocktail 抗体 P63, CK14
肺腺癌ThinPrep標本 (6か月保存) (×400)
TTF-1陰性 肺腺癌 ThinPrep標本 (3か月保存) (×400)
カクテル抗体による免疫染色 抗体：NSCLC Cocktail Core Kit (ﾊﾟｿﾛｼﾞｰ研究所)
6
第49回日本臨床細胞学会秋季大会
LBC 免疫染色 ・染色性に問題ない ・ThinPrepで塗沫したプレパラートは賦活処理も可能 ・6か月程度保存(4℃)しても染色可能 ・ただし、肺癌組織型鑑別には、複数の染色が必要 ・細胞数が少ない場合は困難 (LBCに限らず)
LBC 遺伝子発現解析による 肺癌の組織型鑑別 ・少数細胞から一度に多数の解析可能
LBCとレーザーマイクロダイセクション 一層の細胞を顕微鏡下で観察しながら異型細胞を回収
保存液に浮遊させた 細胞検体を自動塗沫 ThinPrep2000(オリンパス)
検体
組織細胞化学2010、2011、2012 PALM MBⅢ-N(ZEISS)
性別 年齢 病期 細胞診
1 M 65 4 Class V、AC
2 M 78 3B Class V、 AC
3 M 61 3B Class V、AC
4 M 77 4 Class V、AC
5 F 86 4 Class V、AC
6 M 69 3B Class V、AC
7 M 64 4 Class V、AC
8 M 80 3B Class III
9 M 80 3B Class V Ca
10 F 75 3B Class V AC
10
症例
内因性 ｺﾝﾄﾛｰﾙ
転移性
CK7 CK18 TTF-1 CEA CK6 CK14 CK20 WT1 Calretinin
1 ＋ － ＋ ＋ － － － － － －
2 ＋ ＋ ＋ － － － － － － －
3 ＋ ＋ ＋ － － － － － － －
4 ＋ － ＋ ＋ － － － － － －
5 ＋ ＋ ＋ － ＋ － － － － －
6 ＋ ＋ ＋ － ＋ － － － － －
7 ＋ － ＋ － ＋ － － ＋ － －
8 ＋ － － － － ＋ ＋ － － －
9 ＋ ＋ ＋ － － － － － － －
10 ＋ ＋ ＋ － ＋ － － － － －
腺癌 扁平上皮癌 悪性中皮腫
胸水10症例の遺伝子発現解析 ThinPrep標本→ﾚｰｻﾞｰﾏｲｸﾛﾀﾞｲｾｸｼｮﾝ →ﾘｱﾙﾀｲﾑRT-PCR 症例7: 胃癌の転移 症例8: 肺扁平上皮癌 その他: 肺腺癌 １種類のﾏｰｶｰでは鑑別困難
LBC 遺伝子発現解析 肺癌の組織型鑑別 ・少数の細胞から一度に多数の標的分子を解析できる ・免疫染色の結果を予測できる可能性 ・複数年保存したThinPrep検体でも、細胞の同定が可能であれば解析できる ・細胞量少なく、診断困難な症例に有用
LBC EGFR遺伝子変異解析
右：Thinprep2000(オリンパス) 左：i-densyTM5310 (ARKRAY)
・肺腺癌におけるEGFR-TKI治療感受性予測 ・進行肺癌では細胞診検体のみの場合あり ・迅速、高感度、正確な評価結果が求められる ・偽陰性の回避 ・細胞同定の重要性
i-densyTM IS-5310 (アークレイ)
L858R(exon 21) ・・・EGFR-TKI感受性 exon19 deletion ・・EGFR-TKI感受性 T790M(exon 20) ・・・EGFR-TKI耐性
方 法 -QP法-
KRAS codon12,codon13、BRAF V600E
細胞沈渣、DNA溶液を分注
試薬パック、チップ、反応チューブを装置にセットしスタート
沈渣
沈渣
沈渣
沈渣
1 - 2mL
腫瘍細胞確認
Exon 21 L858R Exon 19 E746V, L747-S752 del
Exon 19 E746-A750 del Exon 20 T790M
EGFR遺伝子変異解析 QP法による結果とDNAダイレクトシーケンス法による解析結果
EGFR遺伝子 野生型
(WT)
EGFR遺伝子 変異型 (L858R)
EGFR遺伝子 変異型
(exon19欠失)
EGFR遺伝子 変異型
(T790M)
Exon 21 L858R
Exon 19 deletion
Exon 20 T790M
QP法
DNAダイレクトシーケンス法
第101回日本病理学会総会
×40 ×400
×400
×400 ×40
×400 ×40 ×40
胸水 (腫瘍細胞多数) 胸水 (腫瘍細胞多数)
胸水 (腫瘍細胞少数) 気管支洗浄液 (腫瘍細胞少数)
DNA抽出 不要 検体採取から結果の評価まで 約90分
DNA抽出 必須 ﾏｲｸﾛ ﾀﾞｲｾｸｼｮﾝ 細胞転写法
検体 EGFR変異 QP法 Clamp法 シーケンス法
細胞診 DNA量
(ng/μL) 検出限界DNA量
胸水 N=25
69.8歳 (51-86)
M:F 17:8
変異型 Exon19deletion Exon21 L858R
Exon 20 T790M
野生型
非腫瘍 腫瘍
DNA抽出後
0 5 1 1
18/19 19/19
0 5 1 －
18/18
0 5 1 －
Ⅳ:1,Ⅴ:4
Ⅲ:1 Ⅳ:1,Ⅴ:18
270.3 ±330.0
0.1ng/μL
気管支 洗浄液 N=10
63.9歳 (48-75)
M:F 8:2
変異型 Exon19deletion Exon21 L858R
Exon 20 T790M
野生型
非腫瘍 腫瘍
DNA抽出後
1 0 0
1/1 7/8 8/8
1 0 0 － 7/7
1 0 0 － －
Ⅴ:1
Ⅱ:1 Ⅲb:1,Ⅳ:1,Ⅴ:6
40.8 ±1.76
10ng/μL
細胞診検体からのEGFR遺伝子変異解析結果
第101回日本病理学会総会
検体 EGFR変異 QP法 Clamp法 シーケンス
法 細胞診
DNA量(ng/μL)
検出限界DNA量
胸水
46, F
変異型 Exon19deletion Exon21 L858R Exon 20 T790M
○ ○
○ ○
○ ○
Ⅴ
210.0 10ng/μL
気管支 擦過細胞
67, F
変異型 Exon19deletion Exon21 L858R Exon 20 T790M
○
○
○
Ⅴ 190.5 10ng/μL
剥離した細胞診検体(パパニコロウ標本)からのEGFR遺伝子変異解析結果
胸水(ギムザ染色) 気管支擦過細胞(ギムザ染色)
×20 ×400 ×20 ×400
第101回日本病理学会総会
年齢 性 細胞診ｸﾗｽ QP法＋Tm解析 PCR clamp法 ｼｰｹﾝｽ法 治療
胸水（細胞沈渣） 1 65 M Ⅴ L858R L858R L858R ｹﾞﾌｨﾁﾆﾌﾞ(継続中） 2 78 M Ⅴ WT WT 3 61 M Ⅴ WT WT 4 77 M Ⅴ WT WT 5 86 F Ⅴ WT WT 6 69 M Ⅴ WT WT 7 64 M Ⅴ WT WT 8 80 M Ⅴ WT WT 9 80 M Ⅴ WT WT
10 75 F Ⅴ L858R L858R L858R ｹﾞﾌｨﾁﾆﾌﾞ ↓
11 75 F Ⅴ L858R,T790M L858R,T790M L858R,T790M ｹﾞﾌｨﾁﾆﾌﾞ(耐性化→憎悪し死亡） 12 72 F Ⅴ UD WT(生検) 13 65 F Ⅴ WT WT 14 66 M Ⅴ WT WT 15 56 M Ⅳ L858R L858R L858R ﾍﾟﾒﾄﾚｷｾﾄﾞ(継続中） 16 85 F Ⅴ WT WT 17 67 M Ⅴ WT WT 18 64 M Ⅴ L858R L858R L858R ｹﾞﾌｨﾁﾆﾌﾞ（継続中） 19 51 F Ⅴ WT WT 20 68 F Ⅴ WT WT 21 66 M Ⅴ WT WT 22 78 M Ⅴ WT WT 23 73 M Ⅴ WT WT 24 56 M Ⅳ WT WT 25 69 M Ⅲ WT ND 気管支洗浄液（細胞沈渣）
1 48 M Ⅴ WT WT 2 57 M Ⅴ WT WT 3 67 M Ⅱ WT ND 4 55 F Ⅴ WT WT 5 75 F Ⅳ WT WT 6 70 M Ⅴ WT WT 7 67 M Ⅴ ex19del ex19del ex19del Ope→ﾄﾞｾﾀｷｾﾙ＋ｶﾙﾎﾞﾌﾟﾗﾁﾝ (継続中) 8 73 M Ⅴ WT WT 9 69 M Ⅴ WT WT 10 58 M Ⅲb WT ND 細胞転写法による過去のパパニコロウ標本（精製DNA）
1 67 F Ⅴ exon19del exon19del exon19del ﾍﾟﾒﾄﾚｷｾﾄﾞ＋ｶﾙﾎﾞﾌﾟﾗﾁﾝ→ﾍﾟﾒﾄﾚｷｾﾄﾞ→ｴﾙﾛﾁﾆﾌﾞ (継続中)
2 46 Ｆ Ⅴ ex19del,T790M ex19del,T790M ex19del,T790M ｹﾞﾌｨﾁﾆﾌﾞ、ｴﾙﾛﾁﾆﾌﾞ (憎悪し死亡)
パラフィン包埋組織（精製DNA） 1 75 F L858R L858R L858R ｹﾞﾑｼﾀﾋﾞﾝ→ｹﾞﾌｨﾁﾆﾌﾞ (合併症あり、憎悪し死亡） 2 80 M WT UD WT 3 67 F ex19del ex19del ex19del ｹﾞﾌｨﾁﾆﾌﾞ (継続中) 4 67 F ex19del ex19del ex19del ﾍﾟﾒﾄﾚｷｾﾄﾞ＋ｶﾙﾎﾞﾌﾟﾗﾁﾝ→ﾍﾟﾒﾄﾚｷｾﾄﾞ→ｴﾙﾛﾁﾆﾌﾞ (継続中） 5 85 M ex19del ex19del ex19del BSC (経過観察中) 6 75 M L858R L858R L858R ﾄﾞｾﾀｷｾﾙ (継続中)
・EGFR遺伝子変異は各法で同様に検出 ・野生型症例でパラフィン組織1例 clamp法で検出不可も、本法、シーケンス法では検出可能 ・感受性変異陽性例13例中 EGFR-TKI治療7例 5例は奏功し継続中、 2例は耐性化後死亡 →T790M変異
第52回日本肺癌学会総会
EGFR変異 34.6%
KRAS変異 22.4%
その他 38.9%
BRAF変異 4.1%
EGFR変異群
KRAS or BRAF変異群 Log-rank p=0.06
その他の群 Log-rank p=0.02
QP法を用いたKRASおよびBRAF遺伝子変異解析
進行肺癌症例(2009-2010stage ⅢB, Ⅳ) 生検のパラフィン切片 ： 49例 細胞検体 ： 18例 i-densy(アークレイ)を用いた QP法とTm解析により、 KRAS codon12,codon13遺伝子、 BRAF V600E遺伝子の変異解析
KRAS遺伝子変異 Codon 12-Ser: tagtggc Codon 12-Asp: tgatggc
第101回日本病理学会総会
LBC EGFR遺伝子変異解析 肺腺癌におけるEGFR-TKI治療感受性予測
右：Thinprep2000(オリンパス) 左：i-densy (ARKRAY)
ベッドサイド分子細胞診断、One-day分子細胞診断
治療に直結する細胞診
迅速、簡便、省スペースなどの技術開発により
第50回日本臨床細胞学会秋季大会
LBC ALK融合遺伝子の検出
肺腺癌 ALK融合遺伝子陽性 クリゾチニブ治療感受性
摺合せ
Thinprep
Thinprep ↓ セルブロック
ALK肺癌患者の胸水
パパニコロウ／HE ニチレイ ALK検出キット
Abcam ALK(5A4) 1/50 + DAKO FLEX Linker
肺癌診療における細胞診の役割 LBCを活用した ● 組織型鑑別 ● EGFR遺伝子変異解析 ● ALK融合遺伝子変異解析 今後、分子標的薬の開発と共にさらに増える可能性 LBC、Thinprep法の活用が期待される
今後、細胞診技術に求められること ● 適切な検体採取（形態や分子のダメージを減らす) ● 適切な検体保存(あらたな治療標的分子の解析)
肺癌診療における細胞診の役割 LBCを活用した ● 組織型鑑別 ● EGFR遺伝子変異解析 ● ALK融合遺伝子変異解析 今後、分子標的薬の開発と共にさらに増える可能性 LBC、Thinprep法の活用が期待される
今後、細胞診技術に求められること ● 適切な検体採取（形態や分子のダメージを減らす) ● 適切な検体保存(あらたな治療標的分子の解析)
