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Universidad Autó nóma de Quere taró Licenciatura en microbiología, Campus Aeropuerto
Reporte de Practica #5:
Crecimiento Microbiano
Laboratorio de Biodiversidad de los Microorganismos
Profesora:
Erika Beatriz Álvarez Hidalgo
Equipo #9:
Alma Marina Peralta Ruiz Rebeca Alejandra Oloarte Pulido
Juana María López Martínez
11 de noviembre del 2013
INTRODUCCIÓN
El crecimiento microbiano es el incremento ordenado de todos los constituyentes celulares que conducen a un aumento en el número de células y
por lo tanto a un aumento de biomasa, dicho crecimiento se da por la división celular que puede ser sexual (cuando hay recombinación cromosómica) o asexual (cuando no hay recombinación y por tanto una célula madre da lugar a dos células
hijas idénticas); las bacterias se dividen por fisión binaria por lo que su reproducción es asexual y dan lugar a células iguales.
Es importante mencionar que existe el crecimiento individual que se da por el
ciclo celular, y el crecimiento de las poblaciones también llamado colectivo. En el
ciclo celular bacteriano, primero se produce la elongación de la célula en donde se duplica el material genético y los otros componentes celulares, seguido de la
formación del septo (tabique en donde se corta la célula) y finalmente se produce la división celular.
El crecimiento microbiano se compone de 4 fases llamadas: fase de latencia,
la cual se refiere a la etapa en el cual no hay crecimiento celular debido a que la célula necesita un periodo de transición cuando son transferidos a diferentes condiciones; fase exponencial, que es cuando las células están dividiéndose; fase
estacionaria, la cual se da cuando existe un agotamiento de nutrientes esenciales por lo que las células no pueden seguir reproduciéndose; y finalmente, fase de muerte que se da cuando las células además de dejar de crecer, dejan de realizar
actividades metabólicas.
Existe cierto tiempo que es necesario para que una célula se duplique, dicho tiempo recibe el nombre de “generación”, y varía considerablemente dependiendo de los mismos microorganismos así como de las condiciones ambientales.
El crecimiento de poblaciones microbianas puede medirse de diferentes maneras, para esta práctica utilizamos 2 métodos, el primero fue el método de
vertido en placa para conteo de colonias, y el segundo conteo lo hicimos por medio de un espectrofotómetro al medir el cambio en la turbidez a lo largo de 12 horas, de un medio de caldo soya tripticasa inoculado con Escherichia Coli; para
este tipo de conteo se requiere realizar varias diluciones.
Uno de los procedimientos se efectúa indirectamente en una serie de
diluciones cada un mililitro de dilución tendrá una centésima parte de las bacterias que tenía una muestra de la inicial, con este método es posible estimar el número
de bacterias presentes en la muestra.
El método más utilizado para la medición de poblaciones bacterianas es el
recuento en placa. Una ventaja de ésta técnica es que mide el número de células viables; o sea el número de células que pueden reproducirse. Para el método de vertido en placa, se inocula 1.0ml de diluciones de la suspensión bacteriana en
una placa Petri. El medio nutritivo, en el que el agar se mantiene líquido en un baño maría se vierte sobre la muestra, luego se mezcla en un medio con una
agitación suave de placa para poder observar colonias separadas. Para algunos tipos de trabajo experimental la turbidez es un método práctico.
Cuando la siembra de bacterias se realiza en un tubo de ensaye con medio líquido, las bacterias se multiplican y el medio se vuelve turbio, esa turbidez se
debe al crecimiento celular y se puede medir con un instrumento llamado espectrofotómetro; el cual consiste en un haz de luz dirigida en donde con ayuda de una celda, se puede medir el porcentaje de transmitancia y por tanto el número
de células tanto vivas como muertas que se encuentran en
dicha celda, por esta razón, cuando la cantidad de bacterias aumenta dentro de la celda,
menor cantidad de luz alcanza la célula fotoeléctrica ya que
dicha luz es desviada debido a la presencia de dichas bacterias, para poder realizar
un conteo satisfactorio se debe primero medir la transmitancia
en un medio blanco (sin inoculo).
OBJETIVO
Determinar el crecimiento de Escherichia Coli mediante conteo de colonias
por vertido en placa así como mediante la medición de turbidez por medio de un espectrofotómetro.
MATERIALES
Agar de bilis y rojo violeta Incubadora Pipeta de 10ml
Caldo soya tripticasa Gradillas Mechero bunsen
Agua peptonada Hidroxido de sodio 2 Matraces Erlenmeyer de 200ml
40 tubos de ensayo con rosca Ácido Clorhidrico 1 Matraz Erlenmeyer de 1 L
40 cajas de Petri Micropipeta de 1000µl Probeta
Plato caliente 45 puntas para micropipeta Balanza analítica
Medidor de pH Propipeta Autoclave
Espectrofotómetro Refrigerador Celdas para espectrofotometro
Contenedores Contador de colonias Cloro
METODOLOGÍA
1. Preparar el agar de bilis y rojo violeta
2. Preparar el caldo soya tripticasa y poner 100 ml en los 2 matraces de 250ml, tapar con gasa y
aluminio
3. Con una pipeta poner 9ml de agua peptonada en cada uno de los tubos de ensayo y rotular
4. Tomar 1000µl del medio inoculado con E. coli y empezar las diluciones hasta tener una dilución de 104
5. Tomar 1000µl del medio inoculado con E. coli y
ponerlo en un matraz de 250ml, hacer lo mismo en
el segundo matraz
6. Tomar 1000µl del caldo soya tripticasa con las
células de E. coli y ponerlas en una caja de Petri,
vaciar después el agar bilis y rojo violeta, homogenizar, solidificar y después agregar otra capa de agar, rotular e incubar a 37° C
7. Pasos para los métodos de siembra, para esta práctica utilizamos el método de siembra por vertido en
placa.
8. Rotular y poner a incubar uno de los matraces en
una incubadora con movimiento constante a 37° C.
9. Rotular y poner a incubar el otro matraz de 250 ml
en refrigeración a 4° C
10. A las 2 horas, sacar los dos matraces, tomar 2000µl de cada uno con una pipeta y poner los inóculos en
una celda independiente, después proceder a la lectura de transmitancia de ambos en el espectrofotómetro.
11. Tomar 1000µl de inoculo de la muestra refrigerada (ya incubada durante 2 horas) y sembrarlo
directamente por vaciado en placa en agar bilis y rojo violeta, hacer el mismo procedimiento con el inoculo
de la muestra incubada a 37° C, tomar otros 1000 µl, vaciar en un tubo con 9ml de agua peptonada y sembrar por vaciado en placa rotulándolo como primera dilución, hacer lo mismo a las 2 horas, rotular como tiempo 4 y repetir primera dilución y hacer una segunda, para el siguiente será tiempo 6, segunda y
tercera dilución y así sucesivamente. Cada 2 horas medir el porcentaje de transmitancia.
12. Incubar durante 24 horas
13. Proceder al conteo de colonias y reportar resultados
Diagrama de flujo para crecimiento microbiano
INICIO
FIN
Preparar caldo soya
tripticasa, agua
peptonada y agar
bilis y rojo violeta
Poner 3ml de caldo soya
en 2 tubos de ensayo
Esterilizar
Poner 100ml de
caldo soya tripticasa
en cada uno de los 2
matraces de 250ml
Poner 9ml de agua
peptonada en los tubos
de ensayo restantes
Inocular con 2 cepas
distintas de E. Coli e
Incubar durante 24 hr
Tomar 1 ml de inoculo
y diluirlo hasta tener
104 bacterias
Tomar 1 ml de inoculo ya
diluido y ponerlo en cada
uno de los matraces con
caldo soya tripticasa
Tomar 2ml en una celda y proceder
a la medición de transmitancia
Tomar 1 ml de cada uno de los matraces
de 250ml y sembrar por vaciado en placa
en 2 cajas Petri rotuladas correctamente
como tiempo 0
Incubar un matraz en refrigeración
a 4° C y el otro en incubadora a
37° C durante 2 horas
Medir el porcentaje de
transmitancia
Tomar 1ml directo del matraz a
temperatura de refrigeración y
sembrar por vaciado en placa
rotular como tiempo 2
Incubar los respectivos
matraces a la temperatura a la
que están rotulados; uno a
temperatura de refrigeración y
otro a temperatura de 37° C
Tomar 1ml directo del matraz a 37°
C y sembrar por vaciado en placa
rotular como tiempo 2 - Directa
Tomar 1ml directo del matraz a 37°
C diluir 1 vez en un tubo de ensayo
con 9ml de agua peptonada
sembrar por vaciado en placa
rotular como tiempo 2 – 1ª Dilución
Dejar incubar durante
otras 2 horas
Repetir el procedimiento
de medir porcentaje de
transmitancia y siembra
por vaciado en placa de la
muestra en refrigeración
directa y la muestra a 37° C
Directa, en 1ª Dilución y 2ª
Dilución y volver a incubar
durante 2 horas en
refrigeración y a 37° C
respectivamente
Repetir el procedimiento
completo durante 12 horas
Dejar incubar durante 24
horas y proceder al conteo
de colonias
Reportar Resultados
RESULTADOS
Tiempo Hora Porcentaje de Transmitancia
Muestra a 37° C Muestra a 4° C Referencia
0 10:00 104.00 104.00 104.00
2 12:00 106.00 104.00 104.00
4 14:00 105.70 103.20 104.00
6 16:00 101.40 99.20 104.00
8 18:00 91.40 98.60 104.00
10 20:00 11.80 97.20 104.00
12 22:00 5.77 95.00 104.00
Tiempo Hora Dilución 37° C Refrigeración #de colonias
0 10:00 Directa 16 0 10:00 Directa 16
2 12:00 Directa 117 2 12:00 Directa 18 2 12:00 1ª Dilución 10
4 14:00 Directa ≈7258 4 14:00 Directa 17 4 14:00 1ª Dilución 461
4 14:00 2ª Dilución 111 6 16:00 1ª Dilución ≈29131
6 16:00 Directa 19 6 16:00 2ª Dilución ≈2598
6 16:00 3ª Dilución 284 8 18:00 2ª Dilución ≈42538
8 18:00 Directa 21 8 18:00 3ª Dilución ≈19152 8 18:00 4ª Dilución ≈9128
0
20
40
60
80
100
120
10:00 12:00 14:00 16:00 18:00 20:00 22:00
0 2 4 6 8 10 12
Po
rce
nta
je d
e T
ran
smit
anci
a
Crecimiento Microbiano
Muestra a 37° C
Muestra en Refrigeración
Blanco de referencia
10 20:00 3ª Dilución ≈26006
10 20:00 Directa 17 10 20:00 4ª Dilución ≈20462
10 20:00 5ª Dilución ≈2375
12 22:00 6ª Dilución ≈2486 12 22:00 Directa 14
12 22:00 7ª Dilución 272 12 22:00 8ª Dilución 21
0
500000000
1E+09
1.5E+09
2E+09
2.5E+09
3E+09
2 4 6 8 10 12
Conteo de Colonias
Crecimiento a 37° C
0
5
10
15
20
25
2 4 6 8 10 12
Conteo de Colonias
Crecimiento a 4° C
DISCUSION DE RESULTADOS
De acuerdo con nuestros resultados en la muestra que incubamos a 37° C
tuvimos una fase de latencia que duró 8 horas, a partir del tiempo 8 inició el crecimiento exponencial y de haber seguido probablemente hubiéramos visto la
fase estacionaria. En la muestra que se mantuvo a temperatura de refrigeración, el crecimiento
estuvo bastante fluctuante probablemente debido a que a esas temperaturas es muy difícil que las bacterias se puedan duplicar sin embargo no es imposible,
observamos respecto al mismo tema que a pesar de que una vez que fueron cultivadas en agar bilis y rojo violeta no se vio un crecimiento considerable a pesar de que una vez que se cultivaron en dicho agar se incubaron a 37° C lo que nos
lleva a pensar que tal vez pudo haber apoptosis celular.
Los resultados en agar son consistentes con los resultados de porcentaje de transmitancia ya que el espectrofotómetro mide la luz que no es reflejada por la presencia de bacterias de forma que cuando arroja un número pequeño a
comparación de nuestro blanco de referencia, quiere decir que se captó menos luz por lo tanto la mayor parte de dicha luz fue desviada por la presencia de mayor
biomasa; si el numero fuera grande o sea lo más cercano a nuestro porcentaje de transmitancia de referencia, entonces se debería a que la luz pudo pasar libremente por la celda, arrojándonos la poca o nula presencia de biomasa dentro
de la celda.
Por último observamos que mientras más veces se diluye una muestra, es más sencillo contar el número de colonias resultantes después de 24 horas de incubación.
CONCLUSIÓN
El crecimiento microbiano es de gran importancia no sólo para entender el
comportamiento de dichos microbios sino que también puede utilizarse para biotecnología.
Una parte muy importante que se debe tomar en cuenta cuando se va a observar el crecimiento bacteriano es usar un cultivo fresco, con cepas recién activadas.
La Escherichia Coli es una bacteria que se ha estudiado a fondo, en la
actualidad se está considerando la posibilidad de utilizar la producción de hidrogeno que realiza gracias a la fermentación del glicerol, esta podría ser una fuente de energía bastante importante ya que sería ecológica, en un momento
dado que llegara a utilizar como fuente de energía, y es en este tipo de proyectos en donde radica la importancia del crecimiento microbiano ya que de esta forma
se puede manejar la logística de dicha producción de hidrógeno o de otros
productos de la fermentación.
El agar bilis y rojo violeta es importante cuando se va a hacer un conteo de colonias cuando se está utilizando E. coli, ya que en este medio de cultivo, las
bacterias de E. coli se pintan de color rosa y tienen una morfología bastante
característica y muy fácil de distinguir de otras bacterias que no se pintaran de ese color y no tendrán la misma forma
redonda de la E. coli.
Debemos tener muy presente el número de diluciones que estamos haciendo para tener control en el
crecimiento microbiano.
BIBLIOGRAFÍA
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Role of different Escherichia coli hydrogenases in H+ efflux and F1Fo-ATPase activity during glycerol fermentation at different pH values - Blbulyan Syuzanna,
Avagyan Arev, Poladyan Anna, Trchounian Armen - Biosci. Rep. (2011) / 31 / 179–185 (Printed in Great Britain) / doi 10.1042/BSR20100053 Volume 31 (3) / Pages
179–185 Journal of bacteriology/American Society for Microbiology - A.P. Singh, P.D. Bragg
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Production of biohydrogen by recombinant expression of [NiFe]-hydrogenase 1 in Escherichia coli - Jaoon YH Kim, Byung Hoon Jo, Hyung Joon Cha - Kim et al. Microbial Cell Factories 2010, 9:54 -
http://www.microbialcellfactories.com/content/9/1/54
Biología de los microorganismos – Michael T. Madigan, John Martinko, Jack Parker – Editorial Pearson
