Coloración de pared celular

Método de webb

La pared celular bacteriana puede tornarse visible, en la tinción de la pared celular bacteriana se aprovecha que los contenidos de la matriz citoplasmática se pueden hidrolizar diferencialmente o fijar sin que la pared celular se afecte. El método de Webb es usa para realizar esta tinción, una vez realizado se logra ver la pared celular con un citoplasma a manera de “hueco”, debido a que la pared celular esta más teñida que el interior citoplasmático.

Las bacterias pueden ser Gram positivas o Gram negativas, las primeras poseen una pared celular con varias capas de peptidoglucano, mientras que las segundas tienen una delgada capa de este peptidoglucano, por ello es recomendable realizar este método con bacterias gran positivas, así se evidencian mejor los resultados.

Material biológico

Cultivo de Bacillus

Materiales químicos

Acido tánico (C76H52O46)

Posee una baja acidez debido a los grupos fenoles que tiene en su estructura. Es el mordiente de los colorantes.

Cristal violeta (C25H30CIN3)

También conocido como violeta de genciana. Es un colorante orgánico de naturaleza catiónica.

Rojo de congo (C32H22N6Na2O6S2)

Es soluble en agua, sin embargo es más soluble en solventes orgánicos. Tiene una gran afinidad (no covalente) a fibras de celulosa. También es utilizado como indicador de pH. Es un colorante aniónico.

Fundamento

A diferencia de la tinción gran donde primero se adiciona el colorante y luego el mordiente, en el método de Webb es indispensable que la célula bacteriana sea en un primer momento tratado con un sustancia química, en este caso es el mordiente acido tánico, el cual se combinara con un constituyente celular y lo desestabilizara de tal modo que el tratamiento posterior con cristal violeta sea más efectivo, este colorante es catiónico, es decir de carga positiva. Como la pared celular bacteriana es de naturaleza negativa, el colorante tendrá una alta afinidad por la superficie de la bacteria.

El rojo de Congo es un colorante aniónico de naturaleza negativa, que al ser añadido no tendrá afinidad con la pared celular debido a las cargas similares que poseen, además el cristal violeta ya se encuentra neutralizando la superficie, de esta manera penetrara el interior de la célula, donde tendrá afinidad con muchas proteínas intracelulares básicas, las cuales constituyen la mayoría.

Finalmente se puede evidenciar al microscopio la pared celular teñida de un color azul debido al cristal violeta y el interior citoplasmático de un color rosado por acción del rojo de Congo.

Metodología

Se prepara un frotis de un concentrado de Bacillus sobre una lámina portaobjeto, esperar hasta que la muestra este seca.

Adicionar el mordiente acido tánico durante 30 minutos, evitando que durante este tiempo el colorante se evapora, de ser el caso es necesario añadir más colorante.

Lavar con agua del caño, tratando de evitar que no se desprenda todo el frotis, este procedimiento se realiza hasta que el agua ya no arrastre nada de colorante.

Colorear con cristal violeta durante 2-3 minutos, cubriendo toda la muestra.

Volver a lavar con agua del caño, hasta quitar el colorante excedente.

Añadir el ultimo colorante rojo de Congo durante 2-3 minutos, se lava, se deja secar y finalmente se puede observa al microscopio con aceite de inmersión.

Cultivo de Bacillus, notar la pared celular de color purpura y el interior del citoplasma de rosado.

Citoplasma (color rosado – colorante rojo de Congo)

Pared celular (color azul – colorante cristal violeta)

Resultados

Los resultados para el método de Webb fueron satisfactorios pues se logró observar las paredes celulares (azul) en contraste con el citoplasma (rosado).

Discusión

Es importante respetar el protocolo, sobre todo el tiempo de exposición del frotis al colorante, de lo contrario la coloración podría no ser del todo bueno, es decir, no podrían fijarse bien los colorantes a las estructuras celulares, lo cual no permitirá visualizar correctamente la pared.

La evaporación del mordiente acido tánico antes de los 30 minutos de exposición altera los resultados, si fuera el caso, se debe añadir más mordiente para completar el tiempo necesario.

Conclusiones

Se debe trabajar con cultivos de bacterias jóvenes pues la exposición ante el acido tánico podría alterar considerablemente la estructura de bacterias viejas, desintegrándolas por completo.

También es posible visualizar la pared celular de una manera indirecta, gracias a colorantes simples como el azul de metileno que no tiñe la pared celular, pero se puede evidenciar por contraste.

Las diferencias de carga entre la superficie bacteriana y el citoplasma permiten que el método de Webb sea efectivo para evidenciar la pared celular.