UNIVERSIDAD NACIONALPedro Ruz Gallo
Apellidos y Nombres._ CHOZO RIOJAS GILDACurso._ ESTRUCTURA Y
FISIOLOGA CELULARDocente._ BLGO. VCTOR H. MELNDEZ GUERREROCiclo._
2015 -I
Lambayeque - Per
MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA:
Tpicos en Biofsica Molecular
2do Cuat rimestre de 2011
Docentes: La Pietrasanta y Catalina von Bilderling
1-Microscopa de Fluorescencia._La fluorescencia refiere al
proceso mediante el cual un espcimen absorbe y subsecuentemente
irradia luz, en un intervalo de tiempo (entre la absorcin de la luz
de excitacin y la emisin de la luz fluorescente) que es usualmente
de pocos nanosegundos. La Microscopa de Fluorescencia es la
herramienta que permite estudiar materiales fluorescentes, ya sea
de manera natural (materiales autofluorescentes) o tratados con
sondas fluorescentes. El Microscopio de Fluorescencia fue
desarrollado a principios del siglo veinte por August Khler, Carl
Reichert, y Heinrich Lehmann, entre otros. Sin embargo no fue sino
hasta dcadas despus que se descubri su potencial, siendo hoy una
tcnica indispensable en biologa celular. La principal diferencia
del Microscopio de Fluorescencia es que permite irradiar al
espcimen con la luz de excitacin y separar la luz fluorescente
emitida, que es mucho ms dbil, de la luz de excitacin. As, slo la
luz emitida por el espcimen es detectada por el ojo o el detector
(usualmente una cmara digital). Como resultado, las partes
fluorescentes de la muestra brillan contra un fondo (background)
oscuro con suficiente contraste como para permitir la deteccin.
Cuanto ms oscuro es el fondo, ms eficiente ser el instrumento.La
microscopa de fluorescencia es una herramienta de inestimable valor
ya que permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y resolucin
microscpica, permitiendo una apreciacin diferente de la informacin
que se puede obtener de los especmenes y que generalmente pasa
desapercibida. El uso de fluorforos ha permitido identificar
clulas, componentes celulares sub-micromtricos y otras entidades
con un alto grado de especificidad. Ms an, esta microscopa permite
la deteccin del material fluorescente con una altsima sensibilidad:
puede ser detectada una cantidad muy pequea de molculas
fluorescentes (unas 50 molculas por micrn cbico). En una misma
muestra, diferentes sondas fluorescentes permiten apreciar
distintos tipos de molculas gracias a las tcnicas de marcado
especfico.
2- Filtros para Fluorescencia._ Los filtros juegan un papel muy
importante en un Microscopio de Fluorescencia ya que son los que
permiten separar la luz emitida de la luz de excitacin. Bsicamente
hay tres categoras de filtros: filtros de excitacin, filtros de
barrera y espejos dicroicos usualmente combinados para producir un
cubo de filtros.
Los filtros de excitacin permiten que slo las longitudes de onda
seleccionadas de la fuente de luz pasen a travs del camino de
iluminacin del espcimen. Los filtros de barrera o filtros de emisin
estn diseados para suprimir o bloquear (absorber) las longitudes de
onda de excitacin en el paso hacia el detector. Los espejos
dicroicos son filtros especializados diseados para reflejar las
longitudes de onda de excitacin y dejar pasar las de emisin
eficientemente. Los dicroicos se posicionan en el camino ptico
despus del filtro de excitacin pero antes del de emisin, a un ngulo
de 45 grados respecto de cada uno de ellos.
3- Algunos materiales y sondas fluorescentes._ La Microscopa de
Fluorescencia aprovecha principalmente el alto grado de
sensibilidad de la tcnica combinado con la habilidad de marcar
componentes estructurales y procesos dinmicos en clulas o tejidos
ya sea vivos o fijados qumicamente. Muchas sondas fluorescentes son
construidas a partir de compuestos aromticos sintticos y fueron
diseadas para ligarse a una macromolcula biolgica (por ejemplo una
protena o un cido nucleico) o para localizarse en una regin
estructural especfica como citoesqueleto, mitocondria, retculo
endoplasmtico o ncleo. Otro tipo de sondas son empleadas para
monitorear procesos dinmicos y variables ambientales localizadas
incluyendo concentracin de iones, pH y potencial de mebrana. Una de
las sondas ms utilizadas es la Fluorescena, y su derivado FITC
(fluorescein isothiocyanate) que se une a aminas primarias
permitiendo marcar componentes biolgicos. Como otro ejemplo, el
fluorforo DAPI (o 4',6- diamidino-2-phenylindole) se une a regiones
del ADN ricas en bases A-T, y puede pasar a travs de la membrana
celular por lo que se usa para marcar clulas fijadas o vivas. En
cuanto al marcado de organelas, se han desarrollado fluorforos
especficos como los de la serie MitoTracker y MitoFluor de
Molecular Probes, que presenta fluorforos para marcar Mitocondria
con diversas propiedades espectrales. El mecanismo de ligadura vara
en cada sonda de la serie, desde una unin covalente a la oxidacin
en membranas de mitocondrias respiratorias.
La ingeniera de sondas fluorescentes tuvo un salto tecnolgico
muy grande con el descubrimiento de la protena verde fluorescente
(GFP) y el desarrollo de sus variantes mutantes espectrales, que
abrieron la puerta a las investigaciones multicolor no invasivas en
localizacin de protenas, interacciones intermoleculares y trfico en
cultivos de clulas vivas. En la prctica de Cultivo Celular usaremos
vectores de expresin para marcar con este tipo de sondas distintas
protenas en clulas. Por ltimo, como desarrollo ms reciente en
sondas fluorescentes podemos mencionar los quantum dots (QDs) o
nanopartculas semiconductoras fluorescentes, cuyas propiedades
espectrales estn fuertemente determinadas por su tamao . QDs con
tamaos que difieren en decenas de un nammetro emiten en diferentes
longitudes de onda (menores tamaos emiten longitudes de onda ms
cortas y viceversa). Los materiales ms comunes de estas
nanopartculas es el Seleniuro de Cadmio (CdSe) o Sulfuro de Cadmio
(CdS). Los QDs vienen recubiertos con polmeros hidroflicos y
conjugados a anticuerpos u otros pptidos biolgicamente activos y
carbohidratos para su aplicacin en protocolos de inmunohistoqumica.
Sus propiedades fotofsicas presentan ventajas significativas
respecto de otros fluorforos, como fotoestabilidad, altos niveles
de fluorescencia y emisin en mltiples colores con una nica longitud
de onda de excitacin.
1.2 Microscopa de fluorescencia:Una sustancia natural en las
clulas o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado
por un haz de luz, emitiendo parte de la energa absorbida como
rayas luminosas: esto se conoce como fluorescencia. La luz
fluorescente de mayor longitud de onda se observa como si viniera
directamente del colorante.Microscopio de fluorescencia:Microscopio
que incorpora una lmpara especial, que acta emitiendo una luz
excitadora de los fluorocromos, con los que se tien las muestras a
observar, y que posee adems un filtro especial, que permite el paso
de la luz emitida por el fluorocromo.1.3 Un microscopio confocal es
un microscopio capaz de obtener imgenes tridimensionales de la
clula. Se basa en un principio similar al de un microscopio de
fluorescencia, pero se utilizan dos diafragmas confocales (uno
antes de la muestra y otro despus) capaces de enfocar la iluminacin
en un nico punto de la muestra. Se utiliza un lser como fuente
luminosa, y con l se va barriendo la muestra por todo su volumen,
plano a plano, creando muchas imgenes bidimensionales que un
ordenador interpreta, generando finalmente una imagen
tridimensional del objeto.Para observar preparaciones con este
microscopio es necesario teirlas con sustancias fluorescentes o
marcarlas con sustancias conjugadas con fluorocromos, como los
anticuerpos.
1.2.2 Tcnicas utilizadas en el confocal:1.2.2.1 Marcajes con
mltiples fluorforosSuele ser lo ms utilizado. En este caso se
detectan varios marcadores simultneamente utilizando diferentes
fluorforos. Lo ms importante es que dichos fluorforos tengan unos
perfiles de excitacin y emisin lo menos solapantes posible y tener
el juego de filtros de emisin adecuado que permitan separar
perfectamente la emisin de los diferentes fluorforos. Asimismo es
necesario disponer de las lneas de lser necesarias para excitar
ptimamente todos ellos.Todo esto es debido a que el mayor problema
que se encuentra en los marcajes mltiples es el del bleedthrough,
del que ya se ha hablado previamente. Es fundamental estar seguro
de que lo que se est observando en un canal procede de uno solo de
los fluorforos. Para ello la emisin de cada fluorforo se distribuye
a un fotomultiplicador independiente que dispone de unos filtros
especficos para un determinado tipo de fluorforos. Es importante
adquirir de manera secuencial los diferentes canales, excitando
individualmente los fluorforos. De esta manera se consigue una
mejor separacin entre los mismos. Es recomendable en cualquier caso
realizar los controles convencionales de autofluorescencia
(observando las preparaciones en ausencia de anticuerpos) y de
anticuerpos secundarios (observando las preparaciones incubadas slo
con los mismos) para reconocer las seales especficas. Tambin
conviene optimizar la dilucin de los anticuerpos primarios y
secundarios para evitar artefactos. En la figura 6 se muestra un
ejemplo de marcaje triple.1.2.2.2 Recuperacin de la Fluorescencia
Despus del P hotobleaching (FRAP).Consiste en destruir la
fluorescencia en una muy pequea regin del campo de observacin
(ROI), aumentando mucho el zoom y hacindole incidir una elevada
intensidad de lser durante un largo perodo de tiempo. A
continuacin, se disminuye de nuevo el zoom y la intensidad de lser,
recogiendo desde ese momento imgenes cada cierto tiempo
(timelapse). De esta manera se puede visualizar la difusin
delfluorforo hacia la zona carente de fluorescencia, permitiendo
estudiar la fluidez de membranas, el movimiento de molculas en la
clula, etc.
1.2.2.3 Transferencia de Energa de Resonancia Fluorescente
(FRET).Cuando dos fluorforos se encuentran muy prximos (entre 10 y
100 ) la energa de la emisin de uno de ellos (donador) puede ser
transferida al segundo, siempre y cuando la longitud de onda de la
emisin del donador coincida con la de excitacin del aceptor. De
manera que si ambos fluorforos se encuentran lo suficientemente
prximos, excitando al donador se podr detectar la emisin del
aceptor. Otra aproximacin a esta tcnica es estudiar la emisin del
donador antes y despus de destruir la fluorescencia del aceptor
(photobleaching). Si se est teniendo lugar FRET la emisin del
donador disminuye puesto que la energa es transferida al aceptor.
Si se destruye la capacidad de excitacin del aceptor la emisin del
donador aumentar. Por tanto, estas tcnicas nos permiten en su
conjunto el estudio de la interaccin entre protenas que lleven
acoplados fluorforos ya que slo si interaccionan entre s las
protenas los fluorforos se encontrarn lo suficientemente prximos
como para detectar FRET.
CDIGO DE COLORES DE LOS OBJETIVOS
ESTRUCTURA DE OBJETIVOS Y OCULARES
Iluminador:
Descripcin10.Cristal de cierre con portafiltros11.Palanca de
graduacin del campo luminosodel diafragma12.Espejo cncavo13.Lmpara
incandescente14.Portalmpara con anillo de ajuste15.Lente
colector16.EspejoEs un elemento fundamental para la utilizacin del
microscopio. Si el sistema de iluminacin no funciona bien, el
microscopio puede quedar fuera de uso, dado que la intensidad
luminosa y el contraste son fundamentales para la identificacin y
observacin de la muestra estudiada. Diversos factores afectan el
sistema de iluminacin; los ms comunes son la suciedad o deterioro
de los componentes pticos como espejos y lentes, fallas en los
voltajes de alimentacin o la utilizacin de bombillos diferentes a
los recomendados por los fabricantes. Las anomalas mencionadas
producen pequeas sombras en el campo de visin, intensidad de luz
insuficiente o falta de homogeneidad en la iluminacin.Suciedad
internaAparece debido a que los sistemas de iluminacin no estn
sellados para impedir el ingreso de polvo y partculas. El polvo que
ingresa al sistema produce difusin y disminucin en la cantidad de
luz proyectada sobre la muestra. Las partculas grandes producen
sombras que dificultan la observacin.Para corregir el problema, se
desensambla el iluminador, se limpian sus componentes, se ensamblan
y alinean de nuevo sus componentes.
PERSONAJE QUE DIO EL NOMBRE DE MICROSCOPIO
METABOLISMO DEL CALCIO
METABOLISMO DEL AZUFRE
METABOLISMO DEL FIERRO
PH EN LA MUERTE
PH EN LA INDUSTRIA
