Debrecen, 2011. június 2. DAB, B-terem

DEBRECENI EGÉSZSÉGÜGYI MINŐSÉGÜGYI NAPOK 2011. (DEMIN XI.)

AZ EGÉSZSÉGÜGYI ELLÁTÁS, A SZOCÁLIS ELLÁTÁS ÉS AZEGÉSZSÉGIPAR MINŐSÉGI HELYZETÉNEK AKTUÁLIS KÉRDÉSEI

A Debreceni Egyetem OEC Népegészségügyi Kar Népegészségügyi Iskola és a Debreceni Akadémiai Bizottság,

az Európai Minőségügyi Szervezet Magyar Nemzeti Bizottságával (EOQ MNB) és az ISO 9000 Fórum Egészségügyi és Szociális Ágazata

Tudományos konferencia2011. június 2-3.

Debreceni Akadémiai Bizottság Székháza (Debrecen, Thomas Mann u. 49.)

Debrecen, 2011. június 2. DAB, B-terem

A diabetes mellitus molekuláris biológiaidiagnosztikája

Dr. Szigeti Tamás János üzletfejlesztési igazgatóWESSLING Hungary Kft. 1047 Budapest, Fóti út 56.

Debrecen, 2011. június 2. DAB, B-terem

WESSLING Hungary Kft.

Budapest WESSLING

Budapest, WESSLING, 20. éve Magyarországon

www.wessling.hu

1983. AltenbergeDr. Erwin Weßling

A WESSLING Hungary Cégcsoportban 2010-ben:2010: 7,2 millió € forgalomKb. 80.000 különböző minta

Nemzetközi jelenlétünk:8 országban,16 laboratórium,30 iroda,1000 munkatárs>50 millió €.

Szakértőink mintegy40 szakterületen dolgoznak.

Európai jelenlétünk – Magyarországon 1992 óta

www.wessling.hu

„Életünk minősége” = szakértelmünk felajánlása a jobb életminőség szolgálatában.

Vállalati vezérlő elv: a QSHE filozófia Quality - Safety - Health - Environment = Minőség - Biztonság - Egészség – Környezet;

Kifogástalan környezet, élelmiszer- és gyógyszer-minőség, egészséges élet; GMO-mentes alapanyagok;Doppingmentes sport, egészséges sportolók;

Cégfilozófiánk

www.wessling.hu

Környezeti vizsgálatok

Kutatás -fejlesztés

Gyógyszeranalitika

Oktatás,szaktanácsadás

Dopping-ellenőrzés

Tevékenységünk

www.wessling.hu

Élelmiszer- és takarmány vizsgálatok

VIZSGÁLÓNAT-1-1398/2005

VIZSGÁLÓNAT-1-1406/2006

VIZSGÁLÓNAT-1-1141/2006

VIZSGÁLÓNAT-1-1009/2008

OGYI GMP engedély: 511/47/2007 MgSZHÁTI GMP engedély: MA-HU/17V/2006/M1

MMR 559

www.wessling.hu

Minőségbiztosítás

Bevezető biokémia

Az ATP térszerkezete

Bevezető biokémia – néhány szénhidrát, GI

Dextrin (keményítőgumi)

Fruktóz (gyümölcscukor)

Glükóz (szőlőcukor)

Szacharóz (répacukor)

Az energia-felszabadítási folyamatok a sejten belül a mitokondriumokban történnek. A mitokondriumok 1 µm átmérőjű, baktérium méretű organellumok. A sejtlégzés során a sejt számára ATP-t szintetizálnak. Itt használódik el a légzés során felvett O2, és itt keletkezik a kilégzéssel eltávolított CO2. Ez a folyamat a sejtlégzés. Az emberi szervezet sejtjeiben több száz, esetleg több ezer mitokondrium található. Minél intenzívebb anyagcserét folytat egy sejt, annál több mitokondrium található benne. Jellemzői:

Gélszerű alapállomány, saját, prokarióta jellegű, gyűrűs DNSés riboszóma, citromsav-ciklus, zsírsavak oxidációja (béta-oxidáció).

Belső membránban: a légzési lánc (terminális oxidáció) működéséhez szükséges fehérjék, ATP szintézis.

Bevezető biokémia – A glükóz lebontása

Bevezető biokémia – A glükóz lebontása

Oxigén jelenlétében a glükózból piroszőlősav, majd a mitokondriumokban acetil-CoA képződik, ami a citrát-körben és a terminális oxidáció folyamataiban oxidálódik.

Aerob energiamérleg:

Egy glükóz molekula lebontásának energiájával összesen 36 ATPmolekula képeződik.

Keményítő Glükóz Glikogén

C6Glükóz-foszfát

2C3 Glicerinaldehid foszfát

2C3Piroszőlősav

CH3CO-COOH

2C2CoAAcetil-CoenzimA

CH3CO-CO2

ATP

Granulum

Riboszóma

Betűrődések

ATP-szintáz részecskék

DNS

Külső membrán

Belső membrán

Mátrix

Ahol a glükóz ég… Mitokondrium

Bevezető biokémia – szabályozó az inzulin

A hasnyálmirigy Langerhans-szigete a béta-sejtekkel és emésztőenzimeket termelő sejtekkel körülvéve (hematoxylin-eosin-festés)

Az inzulin hormon térbeli szerkezete. A szervezet sejtjei csak inzulin jelenlétében képesek felvenni a vérből a glükózt.

GI Élelmiszer

Nagyon magas

90-100%szőlőcukor, malátacukor, méz, cukros üdítőitalok, gabona-, kukorica-, rizspehely

Magas 70-90%(répa- vagy nád)cukor, fehérlisztből készült pékáruk és főtt tészták, szőlő, tejberizs

Közepes 50-70% kukorica, főtt rizs, banán, cukrozatlan gyümölcslé

Alacsony30-50%

tej, joghurt, kefir, a legtöbb hazai gyümölcs, durumbúzából készült spagetti és makaróni

<30%bab, lencse, dió, mogyoró, retek, paprika, paradicsom, fruktóz

Glikémiás index

Glikémiás index (GI): az egyes élelmiszerek 1000 kJ-nyi mennyiségének vércukoremelő képessége a szőlőcukorhoz (néha a fehér kenyérhez) képest, százalékban. A GI jelentősége a 2-es típusú cukorbetegek és fogyókúrázók esetén a legnagyobb.

A diabetes ENSZ-jele

Diabetes mellitus:

-„mézédes átfolyás”

- "διαβήτης" = „átmenet, átfolyás” (görög)

- „mellitus” = „mézédes” (latin)

A betegség egyik főtünetre, a cukor vizelettel való fokozott kiválasztására és a megemelkedett vizeletmennyiségre utal. A Diagnózis a középkorban: a vizelet megkóstolásával...

A betegség a glükóz feldolgozási zavarát jelenti. Okai:

- 1-es típus: a hasnyálmirigy által termelt inzulin hiánya;

- 2-es típus: a szervezet inzulinnal szembeni érzéketlensége (inzulinrezisztencia, relatív inzulinhiány);

- MODY: a glükóz anyagcsere génjeinek mutációi;

A cukorbetegségről

A diabetes mellitus kialakulásának lehetősége

A cukorbetegség minden ismert formájának kialakulását és lefolyását együttesen határozzák meg az örökletes tényezők –a génjeinkben kódolt hajlam – és a környezeti hatások. Ez pedig azt jelenti, hogy nagy valószínűséggel nem lesz cukorbeteg az, akinek nincsenek „hajlamgénjei”, és feltehetően elodázhatjuk vagy megelőzhetjük a cukorbetegség manifesztációját, ha a kialakulásáért felelős környezeti tényezőket időben meg tudjuk változtatni.

A cukorbetegség és szövődményei ellen folytatott harcot tehát a betegséghajlam genetikai hátterének és a környezeti tényezőknek a megismerésével kell kezdenünk.

Referencia: Korányi László, Pánczél Pál: A diabetes mellitus genetikája, Lege Artis Medicinae 2004;14(7):495–505.

A diabetes mellitus és a glükóz anyagcsere

• A vér cukorkoncentrációja csak bizonyos határok között változik;

• A májban folyamatos szőlőcukor-újraképzés, glukoneogenezis zajlik.

• A májban naponta 250 g glükóz képződik (max. 500 g/nap!)

• Szabályzás: inzulin (gátol) glukagon (serkent)

• Inzulinhiány: abszolút, vagy relatív → a szabályozás felborul.

A cukorbetegeknek a máj glükóz termelése miatt szénhidrát-szegény táplálék felvétele esetén is magas vércukorszintje lehet.

Vércukorszintek és epidemiológia

Normál anyagcsere

Emelkedett glükóz-szint vagy glukóz tolerancia

Kifejezett cukorbetegség

Glükóz adagolása nélkül

<110 mg/100 ml<6,1 mmol/L

110-125 mg/100 ml6,1-6,9 mmol/L

≥126 mg/ 100 ml≥7,0 mmol/L

2 órával az OGTT után (75 g glükóz)

<140 mg/100 ml<7,8 mmol/L

140-199 mg/100 ml7,8-11,1 mmol/L

≥200 mg/ 100 ml≥11,1 mmol/L

A betegség riasztó mértékben terjed: egyes szerzők szerint 1995-től 2025-ig (30 év alatt) 135 millióról 300 millióra nőhet a világ népessége körében a cukorbetegek száma!

Népbetegséggé válik!

1-es típus: inzulinfüggő diabetes mellitus

Autoimmun betegség, gyakorisága kb. 10%

Abszolút inzulinhiány okozza;

A szervezet immunrendszere idegenként ismeri fel a saját sejtek egy részét;

Gyulladás miatt elpusztulnak a hasnyálmirigy inzulint termelő β-sejtjei;

Gyakoribb gyermek és fiatalkorban,

A betegek általában soványak,

A betegek kezeléséhez inzulin szükséges.

Tartósan magas vércukorszint (hiperglikémia): ketózissal járó életveszélyes ketoacidózisos kóma alakulhat ki a betegeknél,

Leggyakoribb: Skandináviában,

Nagyon ritka: Japánban, Koreában,

Magyarországon nő az egyes típus gyakorisága;

Genetikája jobban ismert, mint a kettes típusé.

2-es típus: nem inzulinfüggő diabetes mellitus

Magas glikémiás indexű élelmiszer fogyasztás okozza, gyakoriság: kb. 90%;

Folytonosan magas GI esetén a sejtek védekeznek a glükóz bejutása ellen;

Az inzulin nem képes a sejtmembránt átjárhatóvá tenni a glükóz számára;

A pancreas β-sejtjei az agy utasítására emelik az inzulintermelést;

Később leáll az inzulintermelés;

Tünetek: kezdetben tünetmentesség, majd látászavarok, vakság,végtagok keringési elégtelensége, érelmeszesedés, szívinfarktus, impotencia;

A tünetek elhízással, magas vérnyomással társulnak;

Gyakoribb közép- és idősebb korban; egészségtelen életmód: -10–15 év;

Kezelés: kezdetben diéta, sport, tabletta, majd inzulin adagolása;

A diabetes típusok összehasonlítása

Jellemzők 1-es típusú diabetes mellitus 2-es típusú diabetes mellitus

Okok InzulinhiányInzulinrezisztencia (relatív inzulinhiány)

ÉletkorBármely életkor, gyakrabban gyerek- vagy fiatalkor

Felnőttkor (40. életévtől), a korhatár csökken

Testsúly Általában normális Normális vagy elhízott (2b típus)

Kialakulása Általában gyors Lassú

β-sejtek száma Kevesebb, mint a normális 10%-aKezdetben normális, később csökken

Vérinzulin Alacsony vagy teljesen hiányzik A betegség elején magas

Autoantitestek Vannak Nincsenek

Ketózisra való hajlam Kifejezett hajlam jellemző Nem jellemző

Inzulinterápia Szükséges Nem feltétlenül szükséges

Genetikai előrejelzés Viszonylag könnyű Genetikája kevéssé ismert

Genetikai ok HLA a 6-os kromoszómán Calpain 10 a 20. kromoszómán

A Human Leukocita Antigen rendszer (1. típus)

A későbbiekben vizsgálandó génszakaszok a humán 6-os kromoszómán

MODY típusú diabetes mellitus

• MODY = Maturity-Onset Type Diabetes in Young people(felnőtt diabétesz, amely fiataloknál jelentkezik) gyakorisága 2-5%;

• Ritka, sajátos cukorbetegség, jelenleg hat genetikai formája ismert;

• A glükóz anyagcsere génjeinek hatféle mutációja miatt alakul ki;

• Öt esetben transzkripciós faktorokat kódoló gének (például Hepatic Huclear Factor (HNF)-1alfa, HNF-4alfa) károsodnak, amelyek a β-sejtekbenfejeződnek ki;

• Az inzulintermelés és kiválasztás zavarát okozzák;

• A hatodik forma (2-es típusú MODY) esetében a glukokinázt (glükóz szenzor a hasnyálmirigyben) kódoló gén károsodik;

• A betegségek dominánsan öröklődnek;

• Gyerek- vagy fiatal felnőttkorban felléphet;

• Kezeléséhez a kezdetekben nem szükséges inzulin;

Cukorbetegség okozta retinakárosodás

A diabetes genetikai vizsgálatának lehetősége

A molekuláris chiptechnológia, a fejlett komputerek a DNS (genom), az mRNS (transcriptom) és az átírt fehérje (proteom) szintjén vizsgálják a diabetes mellitus patogenezisét. Remélhetjük, hogy a cukorbetegség „hajlamgénjeinek” megismerésével nemcsak korai diagnózist segítő genetikai markerekhez jutunk, de értelmezni tudjuk majd a betegség különböző fenotípusait; megismerjük, hogy mely formák jellemzőek országunkra, népességünkre.

A genetikai háttér „populáció-specificitásának” elengedhetetlen tisztázása nemcsak a megfelelő, populációspecifikus markerekhasználatát biztosítja, de a későbbiekben tervezhetővé teszi az esetleges génterápiát is. Ennek a munkának az alapja a hazai betegpopuláció genetikai mintáinak gyűjtése, tárolása, egy olyan cukorbeteg-DNS-mintatár, azaz cukorbeteg-génbankkialakítása, amely bármikor, ismételhetően.

Hajlamosító gének keresésének módszerei

1. Klasszikus jelöltgén kutatás

• A betegségben szerepet játszó molekulák vizsgálata

2. Fordított genetikai megközelítés (beteg családok)

• Kapcsoltság (linkage) elemzése allélek együttes átmenetének vizsgálatával

• Társulás (association) elemzés relatív rizikó számítása

• Genom scan vizsgálatok

Diabetes 1, klasszikus jelöltgén-kutatás 1. elv

Releváns molekulák polimorfizmusának vizsgálata

Logikus, hipotézis által irányított, erősen fókuszált stratégia: az alap- és klinikai kutatások által a betegség kialakulásában feltételezetten szerepet játszó ágensek keresése:

• GAD65 (glutamate decarboxylase) antigén;

• Inzulin antigén;

• ICA69 (islet cell antigene) - Golgi complex insuloma;

• Immunglobulinok stb.;

A teljes genom polimorfizmusainak vizsgálata

A polimorfizmusokat vaktában elemzik nagyszámú, cukorbetegségben érintett család bevonásával. Ha egy, többnyire 10–30 cM szélességű DNS-szakasszal kapcsoltságot (linkage) találnak, azt még tovább kell elemezni, hiszen az molekuláris szinten hatalmas mennyiségű gént jelent.

A módszer korlátait a betegség fenotípus-heterogenitása, populációs és etnikai különbségek, statisztikai számítási problémák határozzák meg (például: mi legyen a szignifikancia határa?). Emiatt az egyik kutatócsoport által talált eredményt mások gyakran nem tudják megerősíteni.

Diabetes 1, klasszikus jelöltgén-kutatás 2. elv

Hajlamosító gének keresésének módszerei

Vizsgált csoportAz 1-es típusú diabetes

előfordulása (%)

Az átlagnépességben, 30 éves korra 0,1–0,4

Diabeteses egyén testvérénél, 30 éves korra 6

Diabeteses egyén gyermekében (általában) 3–6

Diabeteses az apa gyermekében 20 éves korra 6–9

Diabeteses az anya gyermekében 20 éves korra 1–4

Egypetéjű ikertestvér, 30 éves korra 34

Egypetéjű ikertestvér, 12 évvel a proband diagnózisa után 43

Egypetéjű ikertestvér, 40 évvel a proband diagnózisa után 50

Kétpetéjű ikertestvér 10–12

HLA-identikus testvér 15

HLA-haploidentikus testvér 9

HLA nem identikus testvér 1–2

Az 1-es típusú cukorbetegség várható megjelenése a populációban és a diabeteses egyén (proband) családjában

Társulás- (association) elemzés.

Egy adott marker- (vagy gén-) allél gyakrabban fordul-e elő a betegekben, mint a kontrollcsoportban?

Ha igen, akkor feltételezhető a marker és a betegséglocus közötti kapcsoltsági kiegyensúlyozatlanság (linkage dysequilibrium = a betegséghez kötött és a markerallél-kombináció nem random módon fordul elő a populációban).

Protektív allél: a markerallél ritkábban fordul elő a várhatónál; örökletesen véd a betegség kialakulásától.

Az asszociáció erősségét a relatív rizikóval (RR) fejezik ki.

Diabetes 1, klasszikus jelöltgén-kutatás 2. elv

Az asszociáció erősége: relatív rizikó faktor (RR)

az allélt hordozó betegek száma × az allélt nem hordozó kontrollok számaaz allélt hordozó kontrollok száma × az allélt nem hordozó betegek száma

RR =

Ha RR>1: diabetogén az allél

Ha RR<1: protektív az allél

Az abszolút rizikó ritka betegség esetén nagy RR kimutatásakor is alacsony marad: 14 éves kor alatt az 1-es típusú cukorbetegség prevalenciája 0,07%. Tízszeres RR-növekedés esetén is 1% alatt marad az abszolút rizikó.

A diabetes

Genom scan vizsgálatokA genom scan vizsgálatok feltétele volt, hogy olyan genetikai markerkészletet

találjanak, amely:

• az egész emberi genomot egyenletesen lefedi,

• informatív, azaz a populáció nagy része heterozigóta az eléggé polimorf allélokra, nagy tömegben vizsgálható.

Első generációs genom scanek: Mikroszatelliták. Ismétlődő, 16–60 bázispárból álló DNS-szakaszok, amelyek minden kromoszómán, azok egész hosszában megtalálhatók, nagyon polimorfok, azaz számos alléllel rendelkeznek. Pozitív esetben tovább kell vizsgálni, hogy az adott szakaszon levő több tíz vagy száz gén közül melyik áll valóban kapcsolatban a betegséggel.

Második generációs genom scanek: a markerek az egy nukleotidból álló polimorfizmusok (Single Nucleotide Polymorphism, SNP). Ezek sűrűbben helyezkednek el, tehát nagyobb a felbontásuk.

Diabetes 2, kandidáns génjein leírt eltérések

Inzulin: 23 A/T (Hphl) HNF-1α: Ala98Val

Inzulinreceptor: Val 985Met HNF-4α: Val225Met

IRS-1: Gly972Arg HNF-4α: Thr130lle

IRS-1: Ala513Pro FABP2: Ala54Thr

IRS-2: Gly1057Asp β2-adrenerg-receptor: Gln27Glu

IRS-2: Leu647Val β3-adrenerg-receptor: Trp64Arg

p85 alegység Pl3-kináz: Met326lle UCP2: Ala55Val

Shc: Met300Val UCP2: 866 G→A

PCl: Lys121Gln UCP3: 55 C→T

GLUT4: Val383lle TNF-α: 238 A/G

PPARγ: Pro12Ala Paraoxonáz-2: Ala148Gly

SUR1: C/T (exon 18) Thr759Thr Hexokináz II: Gln142Pro

SUR1: IVS15-3 c/t glikogén-szintáz: Met416Val

KIR 6.2/Bir: Glu23Lys Az 1-es típusú protein-foszfatáz(PP1R3) glikogénhez kapcsolt reguláló alegysége: ASp905TyrGlukagonreceptor: Gly40Ser

Amylin: Ser20Gly Calpain 10: G/A intron 3 (UCSNP-43)

Sziget amyloid polipeptid: 132 G→A IRS-1: T608R

TNF-α: G308A IL-6: C174G

Membrán-glikoprotein: PC1 K121Q Rezisztinpromoter: 180C>G

Genomika és proteomika – genetikai analitika

Az örökítő anyag négy építőelem kombinációjából álló kettős spirál, a DNS, a Deoxiribonukleinsav.

Az építőkövek:

- Deoxiribóz (cukor)

- Foszforsav

- Négyféle szerves bázis: A, T, C, G.

- Bázispárok: A=T C–G : hidrogénhidak

Az emberi genom kb. 35 000 génből áll (tulajdonságok: 235000);

A DNS szerkezete

=

O

H HHH

H2C OH

O

O

HHH

H2C OH

O

OH

Deoxiribóz

3’-OH a normál DNS-szál hosszabításához

Dideoxiribóz

A normál DNS-szál növesztéséhez szükséges

3’-OH-csoport hiánya miatt a dideoxi-nukleotid leállítja a

lánchoszabbítást

A DNS szerkezete – a cukorváz

O

HHH

H2C OH

O

OH

PO OH

O

Deoxiribóz nukleotid

Egy ribóz molekula és egy ortofoszforsav-molekula kapcsolódik össze

A DNS szerkezete – a cukor-foszfát váz

O

H

H

H

H2C

O

OH

PO OH

O

Deoxiribóz nukleotid

Egy ribóz molekula és egy ortofoszforsav-molekula kapcsolódik össze

N

N N

N

H2N

Adenin nukleobázis (A)

purin bázis

OH

A DNS szerkezete – a cukor-dfoszfát váz + A

O

HHH

H2C

O

OH

PO OH

O

N

N N

N

H2N

Kilépése

H2OAdenozin nukleotid (dAMP)

A DNS szerkezete – d-Adenozin nukleotid

Timin pirimidin nukleobázis

A DNS szerkezete – Timin, Guanin, Citozin

Citozin pirimidin nukleobázis

Guanin purin nukleobázis

Genetikai analitika

A teendő: megkeresni a diabetes mellitusra való hajlam genetikai jeleit.

- Génszakaszok

- SNP-k

- A kérdéses régiók izolálása

- A betegségre való hajlamot kódoló gén detektálása

A modern vizsgálati módszerek alapja a PCR

Kary Banks Mullis – Berkeley Egyetem (1944 Lenoir USA É-Carolina)

Polymerase Chain Reaction

A legtöbb genetikai elemzés alapja

1993: kémiai Nobel-díj

Elv:

- DNS kinyerése a sejtekből

- DNS szakasz kiválasztása (primerek)

- TAQ polimeráz enzim felhasználása

- DNS-szakaszok másolása (amplifikálás)

- DNS-szakaszok méret szerinti elválasztása

- Detektálási technika (SYBER Green, Et-Br.)

PCR készülék

Az analitika során a minta DNS-tartalmát hő közlésével denaturáljuk, majd enzimatikusan olyan koncentrációra szaporítjuk fel, amely a rendelkezésre álló technika segítségével jól detektálható.

Az enzim a TAQ polimeráz (Thermus aquaticus).

A modern vizsgálati módszerek alapja a PCR

2n

Amplifikáció a PCR készülékben

0 1 2 3 4 Ciklusok száma (n)

12

4

8

16

2n

A PCR készülékben a kiválasztott DNS-szekvenciák mennyisége (a

kópiák száma) a hőmérsékleti ciklusokkal exponenciálisan nő.

Kópia-szám

Amplifikáció a PCR készülékben

A PCR termék további vizsgálata

Az amplikonok (a feldúsított kópiák) további műszeres vizsgálata:

- Gélelektroforézis

- Gélkromatográfia

- Szekvenálás kapilláris gélelektroforézissel

- Real time PCR vizsgálat (szükség esetén mennyiségi analitika)

- Stb.

=

Referencia minta

Negatív minta

Pozitív minta minta

Gél elektroforézis

SNP vizsgálata bio-chippel (pl. diabetes 2.)

A

A

C

G

T

A

C

T

A

T

G

T T

C

T

G

A

C

C

C

T

G

G

T

A

C

G

G

A

T

1

2

3

4

5

54

32

1

1 2 3 4 5

1

2

3

4

5

T G C T T A

Genetikai chip

Zárókupak

Real time PCR

Száloptika

LencseZárókupak

Reakcióedény

Termoblokk

Szekvenálás

O

H HHH

H2C OH

O

O

HHH

H2C OH

O

OHDeoxiribóz

3’-OH a normál DNS-szál hosszabításához

Dideoxiribóz

A normál DNS-szál növesztéséhez szükséges

3’-OH-csoport hiánya miatt a dideoxi-nukleotid leállítja a

lánchoszabbítást

A DNS szerkezete – a cukorváz ismét

Ha a d-nukleotidok helyett dd-nukleotid kerül fel a templátra, a lánchosszabbítás leáll. Ez az alapja az egyik szekvenálási eljárásnak.

Szekvenálás - Deoxi- és dideoxi nukleotidok

dAMP deoxi-adenin-monofoszfát

dTMP deoxi-timin-monofoszfát

dCMP deoxi-citozin-monofoszfát

dGMP deoxi-guanin-monofoszfát

ddAMP dideoxi-adenin-monofoszfát

ddTMP dideoxi-timin-monofoszfát

ddCMP dideoxi-citozin-monofoszfát

ddGMP dideoxi-guanin-monofoszfát

Folytonos lánchosszabbítást tesznek lehetővé a polimeráz

enzim számára.

Megállítják a lánchosszabbítást, így a polimeráz enzim

tevékenysége leáll.

PRIMER����

PRIMER

Amplifikáció kb. 75 oC-on szekvenáláshoz

ddT (stop)

ddG (stop)

Szekvenálás

G C A T

A

A

A

A

A

A

AAAA

T

T

TT

T

C

C

C

C

C

G

GG

G=

Pufferben oldott minta

Lézeres fényforrás

Áramforrás

Fluorescens detektor

Puffer

CT AKapilláris a géllel

G C T A

Kapilláris gélelektroforézis – Szekvencia…

=

Szekvenálás - Elektroforetogram

The Genetic Landscape Of Diabetes

The Genetic LandscapeOf Diabetes

Laura Dean

Köszönöm szépen megtisztelő figyelmüket!