UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA DE RECURSOS NATURAIS

DESENVOLVIMENTO DE FERRAMENTAS

BIOTECNOLÓGICAS A PARTIR DE RECURSOS NATURAIS PARA O TRATAMENTO DA DOENÇA DE ALZHEIMER

ROSIANE DOS SANTOS

SÃO CRISTÓVÃO, SE

2013

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA DE RECURSOS NATURAIS

DESENVOLVIMENTO DE FERRAMENTAS BIOTECNOLÓGICAS A PARTIR DE RECURSOS NATURAIS

PARA O TRATAMENTO DA DOENÇA DE ALZHEIMER

ROSIANE DOS SANTOS

Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Biotecnologia de Recursos Naturais da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do título de Mestre em Biotecnologia de Recursos Naturais.

Orientadora: Profa. Dra. Rosilene Moretti Marçal

SÃO CRISTÓVÃO, SE 2013

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

Santos, Rosiane

S237d Desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas a partir de recursos naturais para o tratamento da doença de Alzheimer / Rosiane dos Santos ; orientador Rosilene Moretti Marçal. – São Cristóvão, 2013. 93 f. : il. Dissertação (mestrado em Biotecnologia de Recursos Naturais) – Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, 2013.

O 1. Biotecnologia. 2. Doença de Alzheimer. 3.

Acetilcolinesterase. 4. Butirilcolinesterase. 5. Phomopsis sp.. 6. Zebrafish. I. Marçal, Rosilene Moretti, orient. II. Título.

CDU: 60-7:616.892.3

ROSIANE DOS SANTOS

DESENVOLVIMENTO DE FERRAMENTAS BIOTECNOLÓGICAS A PARTIR DE RECURSOS NATURAIS

PARA O TRATAMENTO DA DOENÇA DE ALZHEIMER

Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Biotecnologia de Recursos Naturais da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do título de Mestre em Biotecnologia de Recursos Naturais.

Dedico aos amigos que me acompanharam durante essa jornada, confortando-me nos momentos de angústia e celebrando comigo cada vitória conquistada.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, e não poderia ser diferente, pois nos momentos em que as

dificuldades quase me fizeram desistir, me sustentou com sua força, misericórdia e amor

incondicional, sempre prometendo vitória e me impulsionando a continuar.

Em especial à mulher incrível que com seu jeito firme e também sereno,

provou que ser mãe é muito mais que carregar no ventre, é amar, proteger e dar limites. A

você minha mãe, tia e melhor amiga “Minha Elizabeth” muitíssimo obrigada, Sempre te

Amarei.

Aos velhos e verdadeiros amigos (quase irmãos) e aos familiares que sempre me

incentivaram e esperaram o melhor de mim, acreditando que a distância e ausência seriam

temporárias e que no final tudo daria certo.

Aos amigos que fiz durante essa caminhada, pessoas muito especiais que em

muitos momentos foram confidentes, conselheiras e às quais rendo sincera gratidão, esse

momento ímpar de felicidade não seria o mesmo sem suas presenças. Muito obrigada pela

amizade e apoio nos momentos certos!

À equipe do LAFETH que dividiu comigo muitos momentos de stress, mas

também de muito trabalho e alegria, muito obrigada pelo apoio e por todas as sugestões,

muitas delas aplicadas a este trabalho.

E por fim, agradeço aos Professores pela contribuição valiosíssima na

construção do meu conhecimento, fundamentais à minha formação profissional e

principalmente pessoal.

SUMÁRIO

Página

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS i

LISTA DE FIGURAS ii

Resumo iii

Abstract iv

INTRODUÇÃO 9

REFERENCIAL TEÓRICO 12

Os fungos endofíticos 12

A planta hospedeira 13

As colinesterases e sua importância 14

Doenças associadas ao déficit colinérgico 16

Atividades biológicas e farmacológicas do Mentol 18

Emprego do Zebrafish em modelos experimentais 19

Memória e tipos de memória 20

Memória imediata 20

Memória de curto prazo 20

Memória de longo prazo 20

Estudo de memória em zebrafish 20

Modelo da esquiva passiva 23

Escopolamina 24

REFERÊNCIAS 26

CAPÍTULO I –

Artigo1 – Potentes inibidores de butiril e acetilcolinesterase isolados do

fungo endofítico Phomopsis sp. associado à planta medicinal brasileira

Hancornia speciosa

31

31

RESUMO 32

ABSTRACT 33

1. Introdução 34

2 Parte Experimental 35

2.1 Material Fúngico 35

2.1.1 Assepsia e tratamento do material vegetal 36

2.2 Extração e Isolamento 36

2.2.1 Fermentação, extração e isolamento do Phomopsis sp. 36

2.3 Análise Química 37

2.3.1 Identificação de compostos dos fungos 37

2.3.1.1 Composto 1 37

2.3.1.2 Composto 2 37

2.3.1.3 Composto 3

37

2.3.1.4 Composto 4 38

2.5 Avaliação Biológica 38

2.5.1 Drogas e reagentes 38

2.5.2 Avaliação da atividade anticolinesterásica 38

2.6 Análise matemática 38

3 Resultados e Discussão 39

3.1 Atividade inibitória das colinesterases 39

Conclusão 42

Agradecimentos 42

Referências 43

TÍTULO DAS FIGURAS CAPÍTULO I 46

CAPÍTULO II

ARTIGO 2 – Efeito do mentol na aquisição e consolidação da memória em

zebrafish

50

50

Resumo 51

Abstract 52

1 Introdução 53

2 Metodologia 54

2.1 Tratamento da água 54

2.2 Drogas e sais 55

2.3 Ensaios in vivo 55

2.3.1 Animais 55

2.3.2 Câmara experimental 55

2.3.3 Teste da resposta de esquiva passiva 55

2.3.4 Procedimento experimental 56

2.3.4.1 Grupo Controle veículo 56

2.3.4.2 Grupo Controle neostigmina 56

2.3.4.3 Grupo Tratado com escopolamina 56

2.3.4.4 Grupo Tratado com mentol 56

2.3.4.5 Grupo Reversão controle 57

2.3.4.6 Grupo Reversão mentol 57

2.4 Análise Matemática 57

3 Resultados e discussão 57

Conclusão 59

Agradecimentos 59

Referências 59

TÍTULO DAS FIGURAS CAPÍTULO II

62

CONCLUSÃO 68

MATERIAL SUPLEMENTAR 69

i

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ACh Acetilcolina

AChE

AChEI

AcOEt

Acetilcolinesterase

Inibidor da acetilcolinesterase

Acetato de etila

ACTI Iodeto de acetiltiocolina

APP

Aβ

BuChE

CA1

CBD

CC

CCDC

DA

Proteína precursora amilóide

Peptídeo β-amiloide

Butirilcolinesterase

Região 1 do complexo amigdaloide

Caldo batata dextrose

Coluna cromatográfica

Cromatografia de camada delgada comparativa

Doença de Alzheimer

DTNB Ácido 5,5’ – ditiobis-2-nitrobenzóico

Emax Eficiência máxima

FDA Food and Drug administration

GABA Ácido gama-aminobutírico

GABAA Complexo receptor GABA

IC50 Potência

JNM Junção neuromuscular

LTM Memória de longo prazo

mAChR Receptor muscarínico colinérgico

ME Extrato de malte

nAChR Receptor nictínico colinérgico

NF - kB Fator de transição nuclear kappaB

PS1 Proteína presenilina 1

PS2 Proteína presenilina 2

SNC Sistema nervoso central

STM Memória de curto prazo

TRIS Tris (hidroximetil aminometano)

TRIS-HCl Tampão TRIS contendo 0,1% de HCl

TRP Receptor transiente potencial

TRPA1 Receptor transiente potencial anquirina1

TRPM8 Receptor transiente potencial melastatin 8

ii

LISTA DE FIGURAS

Página

FIGURA 1 – Fungo endofítico 13

FIGURA 2 – Planta mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) 14

FIGURA 3 – Estrutura terciária da Acetilcolinesterase humana 15

FIGURA 4 – Estrutura da Butirilcolinesterase 16

FIGURA 5 – Cristais e Estrutura do Mentol 18

FIGURA 6 – Zebrafish (Danio rerio) 19

FIGURA 7 – Caixa para o teste de esquiva passiva 24

FIGURA 8 – Estrutura da Escopolamina

25

CAPÍTULO I

FIGURA 1 – Estruturas dos Compostos 1 – 4 isolados do PE extrato AcOEt-ME e

AcOEt-CBD

47

FIGURA 2 – Inibição da atividade da AChE e BuChE pelo PE e neostigmina 48

FIGURA 3 – Inibição da atividade da AChE e BuChE pela 5-metil meleína (1);

nectriapirona (1); tirosol (3) e triptofol (4)

49

CAPÍTULO II

FIGURA 1 – Estrutura do Mentol 63

FIGURA 2 – Efeito dos controles veículo (V), neostigmina (N) e escopolamina (E)

sobre a aprendizagem e consolidação da memória em zebrafish

64

FIGURA 3 – Efeito do mentol sobre a aquisição da memória em zebrafish no teste

da esquiva passiva

65

FIGURA 4 – Efeito do mentol sobre a consolidação da memória 66

FIGURA 5 – Efeito do mentol (M) na reversão de amnésia induzida por

escopolamina (E) no teste da esquiva passiva

67

iii

Desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas a partir de recursos naturais para o tratamento da Doença de Alzheimer RESUMO

A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa responsável pelo maior número de casos de demência em idosos. As regiões cerebrais associadas ao córtex frontal e ao hipocampo são as mais comprometidas pelas alterações decorrentes da DA, resultando em perda da função neuronal, além de perda progressiva da memória e declínio cognitivo. Em nível celular, a DA está associada à redução das taxas de acetilcolina (ACh) no processo sináptico, diminuindo a neurotransmissão colinérgica cortical. A ACh é um neurotransmissor encontrado no cérebro e nas junções neuromusculares, compondo parte do sistema nervoso parassimpático, sua atividade e permanência na fenda sináptica são reguladas por hidrólise catalisada pela acetilcolinesterase (AChE) e pela butirilcolinesterase (BuChE) enzimas que modulam os níveis de ACh no sistema nervoso. A perspectiva por novos alvos inibidores das colinesterases tem estimulado pesquisas utilizando compostos bioativos de origem natural e também a utilização de modelo animal que proporcione melhor compreensão dos mecanismos do desenvolvimento cognitivo. Diante disso, pelo fato de serem microrganismos produtores de metabólitos secundários de grande importância para bioprospecção, foi realizado um estudo da atividade anticolinesterásica de compostos isolados do fungo endofítico Phomopsis sp. (PE) associado à mangabeira (Hancornia speciosa Gomes). Além disso, foi investigado o efeito do mentol sobre a memória de zebrafish adulto através do teste da esquiva passiva. O mentol foi selecionado tomando-se como base o screening realizado por nosso grupo de pesquisa, onde esse composto apresentou potente atividade anticolinesterásica. Na busca por compostos promissores a fármacos anticolinesterásicos, o presente trabalho teve como objetivo a avaliação in vitro da atividade do extrato bruto do fungo, e de seus compostos isolados 5-metil meleína (1), nectriapirona (2), tirosol (3) e triptofol (4) frente às enzimas AChE e BuChE, assim como a avaliação in vivo do efeito do mentol sobre a aprendizagem e consolidação da memória. O extrato bruto do PE e os seus compostos isolados apresentaram efeito na inibição das colinesterases, sendo o triptofol (4) o mais promissor, pois apresentou ação dual sobre as enzimas sendo seletivo para BuChE. O estudo da exposição de zebrafish ao mentol revelou que este composto não produz efeito sobre a memória. Por outro lado, em todas as concentrações testadas o mentol foi capaz de reverter a amnésia induzida por escopolamina. Diante dos resultados, conclui-se que os compostos isolados do PE podem ser considerados como alternativas para o desenvolvimento de novos fármacos anticolinesterásicos e que o mentol pode ser indicado como alternativa terapêutica para tratamento de déficits de memória. Palavras chave: Doença de Alzheimer; acetilcolinesterase; butirilcolinesterase; Phomopsis sp.; zebrafish; memória Orientadora: Rosilene Moretti Marçal – UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

iv

Development of biotechnological tools from natural resources for the treatment of Alzheimer's Disease ABSTRACT

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder responsible for the largest number of cases of dementia in the elderly. The brain regions associated with the frontal cortex and the hippocampus are the most affected by the changes arising from the AD, resulting in loss of neuronal function, and the loss of memory and cognitive ability. In the cellular level, AD is associated with reduced levels of acetylcholine (ACh) in the synaptic process, decreasing cortical cholinergic neurotransmission. ACh is a neurotransmitter found in the brain and at(in the) neuromuscular junctions, forming part of the parasympathetic nervous system, your activity and staying in the synaptic cleft is regulated by hydrolysis catalyzed by acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE) enzymes that modulate the levels of Ach in the nervous system. The outlook for new targets cholinesterase inhibitors has stimulated research using bioactive compounds of natural products and also the use of an animal model that provides better understanding of the mechanisms of cognitive development. Because they are microorganisms that produce secondary given this, metabolites of great importance for bioprospecting, a study of the anticholinesterase activity of compounds isolated from the endophytic fungus Phomopsis sp. (PE) associated with mangabeira (Hancornia speciosa). Furthermore, it was investigated the effect of menthol on the adult zebrafish memory in the passive avoidance test. The menthol was selected taking to account the screening conducted by our research group in previous work, where this compound showed potent anticholinesterase activity. In the search for promising compounds to anticholinesterase drugs, the present study aimed to evaluate the in vitro activity of the crude extract of the fungus, as well as their isolated compounds 5-methyl mellein (1), nectriapyrone (2), tyrosol (3) and tryptophol (4) in AChE and BuChE in vivo evaluation the effect of menthol on the acquisition of learning and memory consolidation. In all assays were obtained encouraging results. The crude extract of PE and its isolated compounds were effective to inhibit cholinesterase, and the tryptophol (4) was the most promising because it showed dual action on the enzymes being selective to BuChE. The study of exposure to menthol zebrafish showed that this compound produces no effect on memory. On the other hand, at all doses tested menthol reverses amnesia induced by scopolamine. This study, therefore, demonstrated the potencial use of these compounds isolated from PE as source of novel agents for the treatment of AD and that menthol may be indicated as therapeutic alternative for the treatment of memory deficits. Keywords: Alzheimer’s disease; acetylcholinesterase; butyrilcholinesterase; Phomopsis sp.; zebrafish; memory

Orientadora: Rosilene Moretti Marçal – UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

9

INTRODUÇÃO

Estudos científicos utilizando-se de recursos naturais tem sido alvo de pesquisas,

principalmente objetivando-se a produção de novos fármacos ou síntese de novos

compostos com potencial terapêutico e alternativas para a indústria química e farmacêutica.

Para tanto, a busca por fontes promissoras vem diversificando-se desde estudos com

plantas produtoras de metabólitos secundários a microrganismos sintetizadores de

compostos bioativos. Nesse campo, os fungos e suas possibilidades metabólicas têm sido

explorados como fonte de novos produtos biologicamente ativos.

Dentre os fungos mais promissores estão os fungos endofíticos, microrganismos que

vivem no interior das células de plantas sem causar danos aparentes à espécie hospedeira,

essa colonização pode ocorrer de várias formas. Simbiótica, onde não há prejuízos para

ambos ou antagonista onde a presença do fungo causa uma interferência no

desenvolvimento da planta como resposta aos metabólitos secundários sintetizados por

esses microrganismos e como mecanismo de defesa ou no desenvolvimento do próprio

fungo a fim de promover sua sobrevivência em associação como a espécie hospedeira.

Existe ainda muita discussão a respeito da relação fungo espécie hospedeira, tendo em

vista que os metabólitos secundários produzidos tanto pelos fungos como pela espécie

hospedeira nem sempre possuem as mesmas propriedades, função ou expressão.

Especula-se que a presença dos fungos colabora para a melhoria do desenvolvimento da

planta e também para sua proteção devido ao potencial desses microrganismos em produzir

compostos bioativos com propriedades químicas capazes de promover o melhor

desempenho da planta e maior resistência a predadores e condições ambientais, no entanto

existe estudos que exploram o fato de a planta também produzir metabólitos para própria

defesa, julgando assim que os fungos por si só, não são capazes de produzir todos

compostos presentes em seu ciclo metabólico, levantando a hipótese de que é a interação

fungo espécie hospedeira, que proporciona tal característica ao microrganismo. O fato é que

fungos endofíticos produzem metabólitos de interesse científico e comercial quando

associados a outras espécies, ampliando assim a possibilidade de novas fontes de recursos

para o desenvolvimento de novas tecnologias e seu uso na produção de compostos de alto

valor agregado para a indústria química, alimentícia, agrícola e farmacêutica.

Diante desses fatos, fungos endofíticos vêm sendo pesquisados com interesse no

desenvolvimento de fármacos, principalmente se tratando em alternativas terapêuticas para

doenças graves como alguns tipos de câncer e doenças degenerativas. Alguns fungos vêm

sendo testados em pesquisas como produtores de compostos inibidores de colinesterases

com resultados promissores sendo obtidos tanto a partir dos extratos brutos desses fungos

10

como de seus compostos isolados, o que aumenta o interesse científico nesses

microrganismos como alvos importantes para a síntese de compostos bioativos e para o

desenvolvimento de novos fármacos. A produção de novos fármacos anticolinesterásicos é

amplamente investigada por proporcionar novas alternativas para o tratamento de doenças

que afetam o sistema nervoso central (SNC), tendo em vista a importância da transmissão

colinérgica para a regulação da memória e da aprendizagem, a baixa concentração do

neurotransmissor acetilcolina (ACh) provoca o aparecimento de doenças degenerativas

como, por exemplo, a Doença de Alzheimer (DA), uma doença caracterizada por

comprometer o funcionamento do cérebro com perdas de neurônios colinérgicos e sinapses

que ocorrem no córtex e hipocampo. A hipótese colinérgica para a DA desperta grande

interesse em pesquisas que aumentem a eficácia de terapias que minimizem o efeito a

atividade da acetilcolinesterase (AChE) e da butirilcolinesterase (BuChE) no sistema

nervoso. Essas enzimas também estão relacionadas com a formação das placas senis e

agregação do peptídeo β-amilóide em decorrência da clivagem incorreta da proteína

precursora do peptídeo amiloide (APP) devido a mutações nos genes das proteínas

presenilina 1 e 2 (PS1 e PS2), formando placas insolúveis de proteína em regiões

específicas do cérebro, interrompendo de maneira progressiva a comunicação neuronal. A

DA também é caracterizada pelo comprometimento da memória e outras funções cognitivas

que afetam o funcionamento ocupacional e social. O distúrbio progressivo da memória

compromete a capacidade de aprendizado e aquisição de novos conhecimentos dificultando

o relacionamento interpessoal do paciente e interferindo de forma negativa em sua

qualidade de vida. Para atenuar os efeitos da doença, tem-se buscado alternativas nos

recursos naturais, com objetivo de desenvolver medicamentos que possibilitem melhoras no

funcionamento da memória e condicionamento de aprendizagem. Alguns metabólitos

secundários como alcaloides, cumarinas e terpenos vêm sendo testados como alternativas

terapêuticas devido a apresentarem propriedades excelentes para serem aplicados como

modelos para o desenvolvimento de medicamentos sintéticos e também como fármacos

naturais, entre eles o que mais se destacam são os da classe dos alcaloides por

apresentarem propriedades farmacológicas diversas e efeito terapêutico como, anti-

hipertensivo, efeito supressor, anti-inflamatório, antibacteriano, antiespasmódico, além de

possuir ação sobre o sistema nervoso central, incluindo a potenciação dos efeitos

colinérgicos. Os terpenos também vem sendo testados por serem substâncias naturais que

possuem diversas propriedades químicas e biológicas ativas de ação antimicrobiana,

anticonvulsivante, antidepressiva, anestésica, analgésica entre outras como sua capacidade

de interagir com o SNC proporcionando efeitos interessantes em neurotransmissores e ação

sobre as colinesterases. Essas características expressas pelos terpenos faz aumentar o

interesse farmacológico por esses compostos, principalmente em relação ao

11

desenvolvimento de novos fármacos de origem natural. Esses compostos estão

classificados de acordo com as unidades de isopreno presente em monoterpenos,

sesquiterpenos, diterpenos ou triterpenos.

Monoterpenos por exemplo possuem ampla aplicação na indústria química e

farmacêutica devido à sua capacidade de ativar, desativar e modular canais de íons. Alguns

monoterpenos são descritos na literatura como sendo inibidores não competitivos de

receptores nicotínicos colinérgicos, por afetarem os canais de cálcio e potássio.

Diante desses fatos, o presente trabalho teve como objetivo avaliar in vitro o

potencial anticolinesterásico sobre as enzimas AChE e BuChE de extratos brutos dos fungos

endofíticos Phomopsis sp. (PE) associados à mangabeira e dos compostos 5-metil meleína,

nectriapirona, tirosol e triptofol isolados do PE, identificando entre os compostos, os

potenciais novos fármacos anticolinesterásico. Além disso, investigar in vivo o efeito do

mentol, um álcool monoterpênico, sobre a aprendizagem e consolidação da memória em

zebrafish adultos no teste da esquiva passiva.

12

REFERENCIAL TEÓRICO

Os Fungos Endofíticos

Fungos endofíticos, representados na Figura 1, são microrganismos que vivem toda

ou uma parte do seu ciclo de vida no interior de plantas sem causar, aparentemente,

sintomas de doenças (TAN; ZOU, 2001). Estes fungos podem habitar seu hospedeiro

intracelularmente (CABRAL et al., 1993) ou intercelularmente (BOYLE et al., 2001), podendo

estar presentes em quaisquer órgãos das plantas e em todos os estágios de seu

desenvolvimento, colonizando todos os nichos ecológicos existentes (SCHULZ; BOYLE,

2005).

Entre os microrganismos endofíticos, os fungos e bactérias que formam nódulos nas

raízes das plantas as quais estão associados são bastante estudados devido a sua

importância na agricultura, particularmente por sua participação na fixação de nitrogênio

pelas plantas. Ao contrário, os endófitos das partes aéreas dos vegetais só recentemente

têm despertado o interesse da comunidade científica, especialmente por seus potenciais na

produção de metabólitos de interesse econômico, incluindo os relacionados às plantas

hospedeiras (SOUZA et al., 2004).

Uma grande dificuldade em identificar os fungos quanto ao seu papel ecológico é a

mudança em sua funcionalidade, pois esta depende da disponibilidade de recursos e

interação com a espécie hospedeira (TERMORSHUIZEN e JEGER 2008). Alguns

pesquisadores como Saikkonen e seus colaboradores (2006) acreditam que a presença de

fungos endofíticos aumenta o vigor da planta hospedeira, melhorando sua resistência a

herbívoros e patógenos, como também sua tolerância às várias intempéries ambientais.

Uma grande vantagem apresentada pelos fungos endofíticos está exatamente em

sua capacidade de produzir diferentes compostos além de compostos semelhantes ou

idênticos biologicamente ativos como aqueles produzidos por sua planta hospedeira (Zhang,

et al., 2012). A utilização de fungos endofíticos reduz a ameaça e aumenta a possibilidade

de novas fontes produtoras de fármacos de alto valor agregado o que confere aos fungos

valor econômico além do seu grande potencial biotecnológico (PIMENTEL, et al., 2011).

13

Figura 1 – Placa contendo fungo endofítico em crescimento (Acervo pessoal).

A Planta hospedeira

A mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) Figura 2, pertencente à família

Apocynaceae e é uma árvore de porte médio, que varia de 2 a 10 metros (RIBEIRO, 2006),

tem uma fruta rica em vitamina C, e vem sendo amplamente utilizada pela indústria de

alimentos. Na medicina popular, a infusão da casca do caule de mangabeira tem sido usada

no tratamento da hipertensão, úlceras gástricas, distúrbios gástricos e doenças inflamatórias

(MORAES et al., 2008). O látex da mangabeira e o suco leitoso do fruto são comumente

usados para tratar de doenças fúngicas, tuberculose e úlceras gástricas (GUARIM NETO e

MORAIS, 2003; SAMPAIO e NOGUEIRA, 2005; SANTOS et al, 2007). Moraes e

colaboradores (2008) avaliaram a ação e anti Helicobacter pilore (anti-Hp) efeito

gastroprotetor do extrato da casca do caule de Hancornia speciosa. Os resultados

mostraram que este extrato tem eficácia no combate e na cura de úlceras gástricas através

da sua capacidade para estimular a síntese de muco e produzir efeito antisecretório. Os

autores também observaram o efeito anti-Hp e ausência de toxicidade (MORAES et al.,

2008). Vários compostos têm sido relatados em relação a estas atividades biológicas, tais

como os compostos ativos L-(+)-bornesitol, ácido quínico andrutin, isolados do extrato de

etanólico das folhas da mangabeira (ENDRINGER et al., 2009) que foram avaliados numa

bateria de ensaios in vitro (inibição da aromatase do NF-kB e da ornitina descarboxilase,

indução e ensaios de proliferação celular) e avaliados e descritos como potencialmente úteis

como agentes quimiopreventivos.

No entanto, os endófitos desta planta e seus valores medicinais ainda não possuem

investigação descrita em literatura.

14

Figura 2 – Planta mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) (Fonte: Embrapa,

2013)

As Colinesterases e sua importância

O sistema colinérgico está baseado no neurotransmissor acetilcolina (ACh) e está

distribuído tanto no sistema nervoso central como no sistema nervoso periférico. Os dois

tipos de receptores colinérgicos no sistema nervoso e nas junções neuromusculares são

receptors muscarínicos (mAChR) e receptores nicotínicos (nAChR). Estes receptores são

encontrados também expressos em várias células, incluíndo células endoteliais e células do

sistema imune (POHANKA, 2011).

As colinesterases são uma família de enzimas que catalizam a hidrólise da ACh em

colina e acetato, num processo essencial para permitir o restabelecimento do sistema

neuronal. São divididas em dois tipos: acetilcolinesterase e butirilcolinesterase (POHANKA,

2011).

A acetilcolinesterase (AChE; EC 3.1.1.7) conhecida como colinesterase ‘verdadeira’

ou esterase I da colina, é a enzima responsável pela degradação da acetilcolina nas fendas

sinápticas do sistema nervoso central e periférico dos organismos vivos bem como nas

junções neuromusculares. A estrutura terciária da AChE está representada na Figura 3.

Estudos revelam que esta enzima pode estar associada a funções de co-regulação de

esterase na terminação mediada pelo neurotransmissor acetilcolina. A expressão da AChE

na modulação de outras proteínas, fluxo sanguíneo na região cerebral, fosforilação da

proteína T e cascata amilóide podem afetar as taxas de progressão de demências como a

doença de Alzheimer (LANE, et al., 2006).

15

Figura 3 – Estrutura terciária da Acetilcolinesterase humana (Fonte:

neuromed87).

A butirilcolinesterase (BuChE; EC 3.1.1.8) Figura 4, também conhecida como pseudo

colinesterase ou colinesterase não neuronal, é distribuída extensamente em diferentes

tecidos dentro do corpo humano, tal como plasma e células sanguíneas, fígado, pulmão,

coração e sinapses colinérgicas dentro do sistema nervoso central. Apesar de sua presença

abundante em diferentes tecidos, a função fisiológica desta enzima não foi ainda

estabelecida (KÁLMÁN J. et al, 2004). No cérebro normal, a atividade da BuChE é

encontrada em todas as regiões que recebem inervação colinérgica, a BuChE é encontrada

principalmente em células da glia e em células endoteliais, enquanto que a AChE é

encontrada nos neurônios e axônios (LANE R. M. et al. 2006).

16

Figura 4 – Estrutura da Butirilcolinesterase (Fonte: Freitas 2009).

Doenças associadas ao déficit colinérgico

Inibidores da AChE são também utilizados como alternativa terapêutica no tratamento

de doenças tais como, miastenias gravis, glaucoma e Doença de Alzheimer.

Miastenia gravis é uma doença autoimune em que os anticorpos do próprio

organismo bloqueiam a transmissão de impulsos nervosos aos músculos e danos na junção

neuromuscular, esta doença é caracterizada por fraqueza e músculos que cansam

facilmente, além disso, dificuldade de deglutição ou insuficiência respiratória (GAJDOOS, et

al., 2008). Os anticorpos funcionam contra os receptores de acetilcolina nicotínico (nAChR)

na membrana pós sináptica da junção neuromuscular (JNM) e caracterizada por fraqueza e

fatigabilidade do músculo voluntário. Atualmente as alternativas terapêuticas para essa

patologia baseia-se em drogas anticolinesterásicas que aumentam o aporte de acetilcolina

na fenda sináptica e assim melhoram a eficiência da neurotransmissão (GILBOA-GEFFEN,

et al., 2007).

Glaucoma é uma doença que causa a pressão intraocular elevada, que pode

conduzir à cegueira. O fluido no olho do paciente se acumula em uma razão que faz com

que a pressão intraocular se eleve. Pressão intraocular elevada danifica o nervo ótico, que

não pode ser recuperado e os pacientes gradualmente perdem a visão (NAKAI, et al., 2007).

A Doença de Alzheimer (DA) é uma doença degenerativa progressiva que é a causa

mais comum de demência em idosos, sua etiologia está associada a uma série de

alterações genéticas, neuropatológicas e fisiológicas que resultam na redução dos níveis de

17

colina. A DA ocorre com maior frequência em pacientes idosos e é caracterizada pela perda

de memória, distúrbios na linguagem, deficiência na habilidade visual e espacial e

problemas comportamentais (LEE, et al, 2008). Esses distúrbios em grande parte surgem

pela disfunção e morte de neurônios em regiões do cérebro importantes na cognição e

humor, incluindo a parte basal do prosencéfalo, hipocampo e córtex frontal (KAMAL et al.,

2008).

Do ponto de vista neuropatológico, a DA é resumida pela presença de placas

amiloides que são constituídas principalmente de peptídeo amiloide-β (Aβ), emaranhados

neurofibrilares intraneuronais e perda dos processos sinápticos e marcadores pré-sinápticos

do sistema colinérgico observadas nas áreas do cérebro supracitadas (KAMAL et al., 2008).

Atualmente, o tratamento farmacológico mais utilizado para inibir os déficits

cognitivos no início da DA consiste em aumentar a função colinérgica usando inibidores das

colinesterases (AChEI), os quais aumentam a meia vida da acetilcolina (ACh) propiciando

um maior tempo de atuação da mesma nos receptores colinérgicos (DAVIES, 1982; ATTA-

UR-RAHMAN, 2004; CUMMINGS, 2000; ELLIS, 2005). Os fármacos anticolinesterásicos

com uso clínico aprovado nos Estados Unidos pela Food and Drug Administration (FDA)

para o tratamento da DA são o donepezil, a rivastigmina e a galantamina (ENRE, et al.,

2007). Todos estes fármacos apresentam limitações clínicas quanto ao seu uso em função

do tempo de meia-vida curto, bem como dos seus efeitos colaterais indesejáveis (SUNG et

al., 2002). Em função destes fatos, estudos continuam sendo realizados no sentido de

buscar novos compostos com atividade anticolinesterásica com maior efetividade do que os

existentes, que possuam baixo perfil de toxicidade e permitam o controle da evolução da

DA.

Pesquisas têm demonstrado que com o progredir da patologia reduz-se a expressão

da AChE enquanto que a expressão da BuChE aumenta no sistema nervoso central de

pacientes com DA. Tem também sido postulado e parcialmente comprovado que inibidores

com ação dual sobre a AChE e a BuChE apresentam eficácia em reduzir os sintomas

cognitivos por tempo maior do que os que atuam apenas como AChEI (ENGELHARDT,

2005; CLEGG et al, 2002). Uma vez que diminui a atividade da AChE e aumenta a atividade

da BuChE com a progressão da doença, a inibição da BuChE pode tornar-se alvo

terapêutico cada vez mais importante em demências como a DA (LANE et al, 2006).

18

Atividades biológicas e farmacológicas do Mentol

O mentol é um monoterpeno cíclico endroanelado encontrado em óleos essenciais

de várias plantas, principalmente da Menta piperita, é um material cristalino de cor branca

Figura 5. Seu uso é bastante difundido em produtos cosméticos e alimentícios devido a sua

ação refrescante, mas também tem ampla aplicação na indústria farmacêutica por possuir

complexos efeitos periféricos, é considerado seguro e tem sido aprovado como controlador

do efeito de substâncias irritantes como nicotina em pacientes fumantes (PATEL, et al.,

2007). Essa substância possui ação sobre uma variedade de receptores de membrana

diferentes e também sobre o SNC e pode atravessar a barreira cerebral, ativando receptores

GABAA e induzindo canais de cálcio e ativação nos canais TRPM8 e TRPA1, membros da

superfamília de receptores transiente potencial (TRP) que funcionam como sensor térmico

no sistema somatossensorial (DAMANN, et al., 2008).

Alguns estudos tem demonstrado sua ação analgésica central por indução do

receptor GABAA, além disso, mostram o efeito do mentol sobre os canais de Na+ e Ca2+

sugerido o uso do mentol como um eficaz analgésico da dor crônica, bem como analgésico

de uso tópico (PAN et al., 2012). O mentol também aumenta a inibição tônica medidada pela

modulação dos receptores GABA em neurônios piramidais da região CA1 no SNC de ratos,

levando à inibição in vitro da excitabilidade neuronal e in vivo da rede de hiper-excitabilidade

do hipocampo (ZHANG, et al., 2008; WILLIS, et al., 2011). Recentemente o efeito do mentol

sobre os nAChR’s tem sido mostrado, o mentol age inibindo reversivelmente os nAChR’s

expressos por neurônios sensoriais por meio do mecanismo de modulação alostérica de

nAChR (HANS, et al., 2012).

Figura 5 – Cristais de Mentol e estrutura do (1R,2S,5R)-2-isopropil-5-metilciclohexanol (Fonte: Wikipédia e PuBmed).

19

Emprego do zebrafish em modelos experimentais

O peixe zebrafish (Danio rerio) Figura 6, é uma espécie que apresenta inúmeras

vantagens de uso em pesquisas científicas por serem peixes de tamanho pequeno, fácil

cultivo, reprodução rápida e fácil manutenção. Além disso, o possui genoma bastante

organizado e os caminhos genéticos que controlam a transdução de sinais e

desenvolvimento, são altamente conservadas em relação ao homem, favorecendo o

zebrafish como excelente modelo para investigações de doenças características da espécie

humana e má formação congênita (POSTLETHWAIT, et al., 2000).

O crescimento ininterrupto, sem sofrer metamorfose, proporciona um processo

contínuo de maturação do desenvolvimento e envelhecimento em zebrafish. Isto pode

permitir o estudo de doenças relacionadas à idade, considerando a elevada capacidade

reparadora em peixes, em comparação com os mamíferos. O monitoramento dos processos

evolutivos da doença pode trazer novas respostas sobre os mecanismos que promovem o

envelhecimento bem sucedido em vertebrados, ou aqueles mecanismos que induzem os

primeiros prejuízos cognitivos e físicos em decorrência da idade (YU, et al., 2006). Estudos

mostram que zebrafish é também um modelo útil para o desenvolvimento precoce dos

vertebrados e é passível de modulação experimental do sistema colinérgico, e expressão do

gene AChE e sua atividade. Nesse tipo de peixe, a AChE é expressa em neurônios muito

antes de chegar aos seus axônios alvo (HANNEMAN, et al., 1988 e ROSS, et al., 1992).

Figura 6 – Zebrasfish (Danio rerio) (Fonte: internet).

20

Memória e tipos de memória

A capacidade cognitiva em humanos é estabelecida muito cedo durante o seu

desenvolvimento e estabilizada na fase adulta, podendo diminuir com o envelhecimento.

Esta tendência geral tem suas exceções notáveis, quando alguns indivíduos adultos jovens

apresentam déficits precocemente em contraste com outros que preservam altas funções

cognitivas com idade avançada. Acredita-se que fatores genéticos, ambientais e sociais

tenham influência direta sobre esse tipo de diversidade. Estudos revelam que a memória

humana pode tem três formas principais, e possui princípios operacionais distintos que são

mantidos por sistemas cerebrais diferentes e classificada de acordo com o tempo durante o

qual é eficaz. Memória imediata, memória de curto prazo (STM) memória de longo prazo

(LTM).

Memória imediata – é a capacidade de rotina para manter as experiências em curso

na mente por alguns segundos. A capacidade deste registro é muito grande, envolve todas

as modalidades (visual, verbal e tátil) e fornece a sensação permanente de um estado

presente.

Memória de curto prazo – é a segunda categoria temporal, é a capacidade de

armazenar informações em mente num período curto de tempo, ou seja, é a capacidade de

armazenar informações na mente o tempo suficiente para executar tarefas sequenciais.

Memória de longo prazo – é a retenção de informações de uma forma mais

permanente de armazenamento por dias, semanas ou até mesmo ao longo da vida. O

processo de LTM pode ser dividido em quatro fases distintas: aprendizagem, consolidação,

armazenamento e recuperação da memória (WANG, et al., 2006).

Especula-se que a formação da memória pode fazer a transição ao longo do tempo a

partir de memória de curto prazo para memória de longo prazo, como resultado sináptico de

consolidação da memória, embora a memória consolidada possa ser esquecida, a LTM é

vista como um estado permanente de estabilidade, tendo em vista que pode ser

reconsolidada (NADER e HARDT, 2009).

Estudo de memória em zebrafish

Modelos são usados para representar problemas complexos em formas

simplificadas, sejam físicas, químicas ou biológicas. Os modelos mais comuns são os

modelos matemáticos que formam a base da teoria da ciência natural. Nas ciências

biológicas, o conceito de modelagem pode se estender ainda mais para incluir

21

procedimentos experimentais e assuntos não humanos. O valor de um modelo é

principalmente uma função da sua fidelidade: no caso de um modelo teórico, a fidelidade é

medida em termos de resultados previstos e, no caso de modelos biológicos, a questão é

expressa em termos de validade. Quando se trata de modelos que expressem os processos

comportamentais e cérebro, o desafio aumenta porque esses processos são ambos

extraordinariamente complexos, e faz-se necessário encontrar espécies que exibam tanto

comportamento interessante e fácil acesso aos processos neurais.

Ratos e camundongos, sem dúvida são os modelos de maior sucesso na

neurociência, têm sido extremamente eficaz em auxiliar a determinar quais regiões do

cérebro de mamíferos e quais sistemas de neurotransmissores estão envolvidos nos

processos de cognição, aprendizagem, e outras variedades de função comportamental. Mas

o invertebrado, molusco marinho aplysia, também foi utilizado como um modelo molecular

de processos de memória (KANDEL, 2004). Tais espécies aparentemente de modelo não

relacionados, são úteis na medida em que eles oferecem equilíbrio, validade, simplicidade e

são economicamente viáveis. Mais recentemente estas considerações levaram

pesquisadores em neurociência comportamental a utilizar peixes, uma espécie de meio

termo entre roedores e moluscos. Nesse campo, destaca-se o uso de zebrafish (Danio

rerio), uma espécie que se impõe como modelo de desenvolvimento de vertebrados, e agora

abre novas portas para a investigação dos mecanismos cerebrais (LEVIN e CERUTTI,

2009).

Zebrafish são por vezes identificados como um modelo alternativo (em relação a

modelos de roedores clássicos), mas o termo modelo complementar pode ser mais

apropriado, uma vez que elimina a utilização de peixe para além de modelos clássicos de

mamíferos, a parte frontal dos vertebrados mostra grande variação morfológica e

adaptações especializadas. No entanto, uma quantidade crescente de dados

neuroanatômicos e funcionais revelam que a evolução do prosencéfalo vertebrado pode ser

mais conservada do que se costumava pensar. Por exemplo, a região do telencéfalo palial

de teleósteos contem subdivisões presumivelmente homólogas ao pálio medial ou

hipocampo em mamíferos. O hipocampo é crítico para a codificação da informação

complexo espacial para formar o mapa das representações cognitivas do ambiente. Dados

mostram que o pallium lateral do zebrafish é homólogo em base anatômica ao dos

mamíferos, e que estas estão igualmente envolvidas com a memória espacial e funcional

como representações ou relacionada com o espaço alocêntrico (RODRÍGUEZ, et al., 2002).

Os peixes apresentam capacidade de reconhecimento individual de membros da mesma

espécie pela visão ou odor e de cooperação (TEBBICH et al., 2002), capacidade de

22

aprendizagem socialmente mediada, seleção de estratégias, displays ritualizados de

agressão, de comunicação e de reconhecimento de perigo (READER, et al., 2003;

SUBOSKI, 1988 e SUBOSKI, et al., 1990). Com relação à cognição e comportamento

adaptativo dos peixes, estes são altamente desenvolvidos quanto às habilidades espaciais

de navegação e aprendizagem não associativa e habituação, comportamento operante

motivado por estímulos aversivos, tais como em testes de esquiva passiva. Em termos de

processos sensoriais, os peixes têm visão de cores excelente, algumas espécies podem

detectar fracas correntes elétricas, sensores que eles utilizam para identificar predadores e

presas, além de possuir pálio lateral, órgão que lhes permitem localizar com boa resolução,

o tamanho e características de objetos distantes por sensoriamento e sombras (LEVIN,

2009; DARLAND, 2001).

Animais não vertebrados como o zebrafish, proporcionam boa oportunidade para

observar diretamente os processos de desenvolvimento neurológico e determinar o impacto

de variações de desenvolvimento na aprendizagem e na memória. Zebrafish são

particularmente valiosos, devido à disponibilidade de técnicas morfológicas de supressão

transitória de partes específicas de expressão do genoma. O desenvolvimento de novos

métodos para o alto rendimento em testes de função cognitiva em peixes podem

proporcionar meios para a detecção rápida de potenciais agentes tóxicos, bem como

agentes terapêuticos promissores. É igualmente importante para o desenvolvimento de

testes específicos de vários aspectos da função cognitiva, incluindo a habituação, a

aprendizagem associativa, a memória e atenção, bem como ser capaz de diferenciar

alterações na função da cognição sensório-motora (LEVIN, 2009).

A maioria das doenças neurológicas mais comuns como Alzheimer e

Parkinson, está relacionada com demência, esclerose e idade avançada do paciente, essas

doenças manifestam-se pela perda de memória e um potencial reduzido para

aprendizagem. Estudar os processos que ocorrem no desenvolvimento destas doenças

requer um modelo animal que possibilite identificar os mecanismos de aprendizagem e

memória. Pesquisas demonstram a utilização de modelos desenvolvidos para estudar a

aprendizagem e capacidade de resposta de fuga rápida utilizando-se zebrafish (Danio rerio).

Alguns modelos permitem a manipulação genética do comportamento e testes de memória,

em simultâneo com gravações fisiológicas in vivo, método que não é possível utilizando-se

outro modelo animal. A utilização desse modelo, por exemplo, proporciona o monitoramento

de mudanças na atividade durante o aprendizado nos neurônios que provocam o

comportamento (ZETTERBERG, 2011). Na DA ocorre uma desordem neurodegenerativa

causando perda de memória e déficits cognitivos, seu mecanismo operante está relacionado

23

com disfunções do sistema colinérgico tais como a perda de neurônios colinérgicos no

prosencéfalo basal e hipocampo (SCHLIEBS, 2005). A acetilcolina funciona como

neurotransmissor principal no sistema colinérgico e, a diminuição em sua disponibilidade

resulta em déficits de aprendizagem (WATANABLE, 2009). Do mesmo modo, os níveis de

receptores nicotínicos e muscarínicos colinérgicos são encontrados diminuídos em paciente

com DA (MULUGETA, et al., 2003). Recentemente, com contribuições importantes para a

compreensão dos mecanismos de desenvolvimento dos vertebrados, foram realizados

experimentos utilizando-se zebrafish para estudo de funções neurocomportamentais do

cérebro e relacionadas com distúrbios neurológicos, esses estudos comportamentais

mostraram que os zebrafish são capazes de aprender várias tarefas, tais como alteração

espacial, ativo condicionado, prevenção e labirinto em cruz (XU, et al., 2009; SISON e

GERLAI, 2010). Outros estudos utilizaram zebrafish em testes da resposta esquiva passiva

para avaliar sua capacidade de aprendizagem e de memória quando expostos aos efeitos

da escopolamina, um antagonista do receptor muscarínico da acetilcolina, sendo esses

animais pré-tratados com fisostigmina, um inibidor da acetilcolinesterase, avaliando a

aquisição e consolidação da memória. Os resultados confirmaram o efeito negativo da

escopolamina sobre a memória do peixe, prejudicando a aquisição da resposta de esquiva

passiva e retenção da resposta aprendida, e que a fisostigmina resgata os efeitos

amnésicos de escopolamina em zebrafish, validando assim esse modelo para avalição de

análise comportamental, aquisição e retençõ de memória utilizando-se zebrafish como

animal experimental (KIM, et al., 2010).

Modelo da esquiva passiva

Uma das modificações de comportamento mais frequentemente estudada é a

inibição de respostas inatas e aprendidas, que levam a consequências aversivas. O termo

esquiva passiva é utilizado por autores para descrever experimentos em que um animal

aprende a evitar uma situação adversa através da supressão ou não emissão de uma

resposta qualquer. Em comparação com outros tipos de aprendizagem, a esquiva passiva

inibitória apresenta algumas características importantes tendo em vista que as respostas

são rápidas fazendo com que a aquisição seja também bastante rápida. Essas respostas

são facilmente mensuráveis e altamente reproduzíveis, além disso, a retenção da

aprendizagem é medida pela comparação entre o comportamento do animal antes e depois

do treino (TOMAZ, et al., 1987).

O teste de esquiva passiva é comumente aplicado em roedores para avaliar

“hipocampo-independente” ou estímulo-resposta aprendizagem (WEHNER, 2003). E

também já foi aplicado para avaliação de aquisição e consolidação de memória em zebrafish

24

obtendo-se excelentes resultados, considerando-se que nesse tipo de ensaio a droga

dissolvida na água é eficientemente absorvida pelo peixe através de suas brânquias,

oferecendo maior rapidez na resposta (WINTER, et al., 2008, BERGHMANS, et al., 2007).

O método de esquiva passiva validado para análise comportamental e avaliação

dacapacidade de aquisição e retenção da memória em zebrafish, consiste num modelo

simples com uso de uma caixa acrílica dividida em dois compartimentos, claro e escuro

contendo um orifício de passagem de luz (Figura 7), dinâmico e bastante eficiente para

estudos dos mecanismos subjacentes à aprendizagem e efeitos colinérgicos na avaliação

da memória (KIM, et al., 2010).

Figura 7 – Caixa para teste da esquiva passiva (Fonte: acervo pessoal).

Escopolamina

Escopolamina, Figura 8 é uma substância do grupo dos alcalóides do tipo tropano,

encontrada em plantas da famíla Solanaceae, é também um medicamento anticolinérgico

derivado da tropina, que atua nos receptores muscarínicos, ela produz efeitos pronunciados

SNC, afetando a atividade locomotora, neurotransmissão e perda de memória

(GRYNKIEWICZ e GADZIKOWSKA, 2008). Suas aplicações clínicas incluem pré-medicação

para anestesia obstétrica sedação analgesia, psicose e tratamento contra os tremores

provocados pelo Mal de Parkinson. É também, usada para induzir déficts cognitivos

transientes em casos de demência (CHRISTEN, 2000).

A escopolamina L-(-)-escopolamina [L-(-)-hioscina] inibe competitivamente os

receptores muscarínicos para acetilcolina, atuando como um antagonista não seletivo

muscarínico, produzindo propriedades antimuscarínicas de efeitos sedativos periféricos e

central, antiemético e amnésia, ela é utilizada em condições que requerem a diminuição da

atividade parassimpática, principalmente devido ao seu efeito sobre o olho, o trato

25

gastrointestinal, no coração e glândulas de secreção salivar e brônquica, e, em

circunstâncias especiais ação no SNC, sendo por isso, mais adequada como pré-medicação

antes da anestesia e para efeitos antieméticos. Os parâmetros farmacocinéticos são

dependentes da forma de dosagem. Escopolamina tem uma biodisponibilidade limitada, se

administrada por via oral. A concentração de fármaco máxima ocorre a aproximadamente

0,5 horas após a administração oral (RENNER, et al., 2005).

Antagonistas dos receptores muscarínicos são conhecidos como acetilcolinérgicos

por induzirem deficiências de aprendizagem e memória, a escopolamina é um antagonista

competitivo de receptores muscarínicos e tem demonstrado em estudos recentes com

roedores que diminui a aprendizagem e a memória numa variedade de tarefas

comportamentais, tais como exemplo o teste da esquiva passiva e teste de labirinto de água

(LEE, et al., 2009). Inibidores de AChE, melhoram os déficits de memória em animais e em

humanos, e também são capazes de reduzir os déficits induzidos por escopolamina. A

inibição da AChE quebra a acetilcolina em acetil-CoA e colina, aumentando os níveis de

acetilcolina na fenda sináptica, e, assim, aumentando a transmissão colinérgica, o que leva

a melhoria na aprendizagem e déficits cognitivos (KIM, et al., 2010).

Figura 8 – Estrutura da Escopolamina (Fonte: Jandira 2010).

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CAPÍTULO I

Artigo 1 – Potentes inibidores de butiril e acetilcolinesterase isolados do fungo

endofítico Phomopsis sp. associado à planta medicinal brasileira Hancornia speciosa

Este artigo será submetido ao periódico: FITOTERAPIA

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Potentes inibidores de butiril e acetilcolinesterase isolados do fungo endofítico Phomopsis sp. associado à planta medicinal brasileira Hancornia speciosa Rosiane dos Santosa, Mário Ferreira Conceição Santosb, Geraldo Humberto Silvab, Rosilene

Moretti Marçala*

aDepartamento de Farmácia, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, Sergipe Brasil.

bDepartamento de Química, Universidade Federal de Sergipe, Itabaiana, Sergipe, Brasil

RESUMO

Os inibidores da colinesterase são atualmente a principal classe de droga para o tratamento dos sintomas cognitivos da Doença de Alzheimer (DA). Inibidores da colinesterase duais, ou seja, compostos capazes de inibir tanto acetilcolinesterase (AChE) como a butirilcolinesterase (BuChE) são considerados uma nova abordagem potencial para o tratamento a longo prazo de pacientes com DA. Na busca por novos inibidores duais das colinesterases, avaliou-se o extrato de acetato de etila de Phomopsis sp (PE), um endófito isolado das folhas da planta medicinal brasileira Hancornia speciosa. Quatro compostos foram isolados a partir de PE: 5-metil meleína (1), nectriapirona (2), tirosol (3) e triptofol (4). A atividade anti-ChE foi avaliada em termos de atividade de acetilcolinesterase (AChE) e butirilcolinesterase (BuChE). PE exibiu uma ação dual em AChE e BuChE. 5-metil meleína (1) inibiu apenas AChE. Nectriapirona (2) inibiu a BuChE de uma forma dose-dependente. Tirosol (3) mostrou ação dual com seletividade leve para AChE. Em contraste, e interessantemente, triptofol (4) mostrou ação dual, sendo muito potente (IC50 = XX µM) e seletivo para BuChE. Palavras-chave: endófitos, Doença de Alzheimer; acetilcolinesterase; butirilcolinesterase; triptofol * Autor para correspondência: Rosilene Moretti Marçal. Laboratório de Farmacodinâmica e Etnofarmacologia, da Universidade Federal de Sergipe, CCBS-DFS, São Cristóvão, Sergipe, Brasil 49,100-000. Telefone: +55-79-2105-6345, Fax: +55-79-2105-6641. E-mail: rosilenemoretti@ufs.br; rosilenemoretti@gmail.com

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Potent butyryl- and acetylcholinesterase inhibitors from Phomopsis sp, an endophyte of the Brazilian medicinal plant Harconia speciosa Rosiane dos Santosa, Mário Ferreira Conceição Santosb, Geraldo Humberto Silvab, Rosilene

Moretti Marçala*

aPharmacy Department, Federal University of Sergipe, São Cristóvão, Sergipe, Brazil. bChemistry Department, Federal University of Sergipe, Itabaiana, Sergipe, Brazil,

ABSTRACT Cholinesterase inhibitors are currently the main drug for treating cognitive symptoms of Alzheimer’s Disease (AD). Dual cholinesterase inhibitors, i.e., compounds able to inhibit both acethylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE) are considered a new potential approach for long-term treatment of patients with AD. In a search for new dual cholinesterase inhibitors, we evaluated the ethyl acetate extract of Phomopsis sp (PE), an endophyte isolated from the Brazilian medicinal plant Hancornia speciosa. Four compounds were isolated from PE: 5-methylmellein(1), nectriapyrone (2), tyrosol (3), and tryptophol (4). The anti-ChE activity has been evaluated in terms of acethylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE) activities. PE exhibited a dual action on AChE and BuChE . 5-methylmellein(1) inhibited only AChE. Nectriapyrone (2) inhibited BuChE in a dose-dependent way. Tyrosol (3) showed dual action with slight selectivity for AChE. In contrast, and interestingly, triptophol(4) showed dual action, being very potent (IC50 = 34 μM) and selective towards BuChE. Also, tryptophol inhibited cholinesterases in brain and improved memory acquisition and retention in the scopolamine induced memory impairment in zebrafish. Key words: Endophytes, Alzheimer’s disease; Acetylcholinesterase; Butyrylcholinestrase; Tryptophol *Corresponding author: Rosilene Moretti Marçal. Pharmacodymanic and Ethnopharmacology Laboratory, Universidade Federal de Sergipe, CCBS-DFS, São Cristóvão, Sergipe, Brazil 49.100-000. Phone: +55-79-2105-6345, Fax: +55-79-2105-6641. E-mail: rosilenemoretti@ufs.br; rosilenemoretti@gmail.com

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1. Introdução

Os fungos são considerados atualmente a segunda fonte natural mais promissora e

subexploradas de novos compostos bioativos [1] com exceção dos antibióticos. Dentre as

espécies de fungos, os endofíticos surgem como um novo campo de exploração e de novas

descobertas biotecnológicas [2]. Estudos tem demonstrado que fungos endofíticos são uma

rica fonte de antibióticos e também de compostos com aplicações terapêuticas. Esses

microrganismos são produtores, por exemplo, de enzimas de interesse industrial e

farmacêutico, de agentes antibióticos, antitumorais, imunossupressores e antiparasitários

[3].

Fungos endofíticos compreendem espécies que vivem toda ou uma parte do seu ciclo de

vida no interior de plantas sem causar, aparentemente, sintomas de doenças [4]. Estes

fungos podem habitar seu hospedeiro intracelularmente [5] ou intercelularmente, [6]

podendo estar presentes em quaisquer órgãos das plantas e em todos os estágios de seu

desenvolvimento, colonizando todos os nichos ecológicos existentes [7]. A interação entre

fungos endofíticos e outras espécies, principalmente plantas de famílias produtoras de

metabólitos de interesse químico, é benéfica a ambos, tendo em vista que para proporcionar

um equilíbrio que garanta a sobrevivência tanto da espécie hospedeira quanto do endófito

há produção de metabólitos que funcionam como mecanismo de defesa e desenvolvimento.

A produção dessas substâncias depende do tipo de interação metabólica entre o endófito e

a espécie hospedeira, interação mutualista ou antagonista e também do nincho ecológico no

qual o microrganismo está inserido e das consequentes interações bióticas e abióticas [8]. A

relação desses microrganismos com plantas tropicais vem sendo descrita como sendo uma

excelente estratégia para obtenção de diversos metabólitos secundários com potencial

bioativo para o desenvolvimento de fármacos, incluindo-se os de ação anticolinesterásica

[9].

A AChE é uma enzima importante presente nas fendas sinápticas do sistema nervoso

central dos organismos vivos, ela mantem o equilíbrio dos níveis do neurotransmissor

acetilcolina (ACh), por ser um agente catalizador na hidrólise da ACh em tiocolina,

aumentando a disponibilidade sinápitica do sistema muscular e facilitando a transmissão de

impulsos nervosos para as sinapses colinérgicas [10]. A inibição da AChE é considerada

uma estratégia promissora para o tratamento de desordens neurológicas tais como

miastenia gravis, demência senil, ataxia e doença de Alzheimer (DA). A Da é uma das

formas mais comuns de demência, ela acomete a maioria dos pacientes idosos, sendo

caracterizada pela perda de memória, distúrbios na linguagem, deficiência na habilidade

visual e espacial e problemas comportamentais [11]. Além das características

35

neuropatológicas da doença, placas neurofibrilares e nódulos neuríticos, ela se caracteriza

neuroquimicamente pelo déficit consistente na transmissão colinérgica, afetando

particularmente os neurônios do prosencéfalo basal [12]. Atualmente, o tratamento

farmacológico mais utilizado para inibir os déficits cognitivos no início da DA consiste em

aumentar a função colinérgica usando inibidores das colinesterases (AChEI), os quais

aumentam a meia vida da acetilcolina (ACh) propiciando um maior tempo de atuação da

mesma nos receptores colinérgicos [13, 14, 15, 16].

Estudos que evidenciam a ação seletiva para as enzimas AChE e butirilcolinesterase

(BuChE) são de grande importância como alternativa terapêutica no tratamento de doenças

neurodegenerativas como por exemplo a Doença de Alzheimer, tendo em vista que

pesquisas nesse campo têm demonstrado que com o progredir da patologia reduz-se a

expressão da AChE enquanto que a expressão da BuChE aumenta no sistema nervoso

central de pacientes com DA. Uma vez que diminui a atividade da AChE e aumenta a

atividade da BuChE com a progressão da doença, a inibição da BuChE pode tornar-se alvo

terapêutico cada vez mais importante em demências como a DA [17] Tem também sido

postulado e parcialmente comprovado que inibidores com ação dual sobre a AChE e a

BuChE apresentam eficácia em reduzir os sintomas cognitivos por tempo maior do que os

que atuam apenas como AChEI [18,19].

Tendo estes fatos em vista, o presente trabalho teve como objetivo investigar a atividade

anticolinesterásica do extrato bruto do fungo endofítico Phomopsis sp. (PE) associado à

planta Hancornia speciosa bem como dos seus compostos isolados 5-metil meleína (1),

nectriapirona (2), tirosol (3) e triptofol (4). A atividade anticolinesterásica dos extratos brutos

dos fungos e dos seus compostos isolados foi avaliada frente às enzimas AChE e BuChE.

2 Parte Experimental

2.1 Material Fúngico

Foram selecionadas e coletadas folhas aparentemente saudáveis da planta Hancornia

speciosa (manganbeira) no povoado de Santa Rita em São Cristóvão-SE (11º 00’53’’ S;

37º12’23’’ W). Exsicatas de partes de cada individuo de Hancornia speciosa foram

identificadas pela Drª Ana Paula do Departamento de Biologia – Universidade Federal de

Sergipe – UFS e depositadas no Herbário da UFS. O fungo endofítico Phomopsis sp. foi

identificado e classificado pelo Dr. João Basílio Mesquita, professor do Departamento de

Engenharia Agronômica da UFS, e depositados na micoteca do Departamento de Química

Campus Itabaiana – UFS tendo o seguinte código de depósito: P2P2F2.

36

2.1.1 Assepsia e tratamento do material vegetal

A superfície do material vegetal (folhas) foi esterilizada por imersão desta em hipoclorito de

sódio (2%) por 5 minutos e em etanol 70% por 1 minuto e lavagem duas vezes em água

estéril por 10 minutos em seguida as folhas foram colocadas para secar a temperatura

ambiente, por 24h.

Pedaços de folhas cortados assepticamente (3 a 4) foram colocados para crescer em placas

de Petri contendo os meios de culturas ágar batata dextrose (ABD) todos contendo

antibiótico (Sulfato de Gentamicina 1mL/250 mL de ABD) para evitar o crescimento

bacteriano. O crescimento do fungo foi monitorado diariamente, até cada fungo atingir 1-2

cm em diâmetro. A seguir foram realizadas repicagens sucessivas até a obtenção das

linhagens puras. A pureza do isolado foi determinada pela aparência uniforme nas placas

com os meios próprios. Esse processo resultou no isolado fúngico Phomopsis sp..

2.2 Extração e Isolamento

2.2.1 Fermentação, extração e isolamento do Phomopsis sp.

O fungo PE foi cultivado em cinco litros de meio líquido Caldo Batata Dextrose (CBD) e ME

(Extrato de Malte). Após o período de fermentação líquida, o caldo foi separado do micélio

por filtração, extraído três vezes com metade do volume do cultivo usando AcOEt e seco em

evaporador rotatório, fornecendo o respectivo extrato bruto AcOEt-PDB (446,0 mg) e o

extrato bruto AcOEt-ME (400,0 mg).

O extrato bruto AcOEt-CBD foi fracionado em coluna cromatográfica (CC) (coluna 15 x

2,5cm, sílica gel) usando um gradiente Hex/AcOEt nas seguintes proporções: 90/10, 80/20,

70/30, 55/45, 50/50, 40/60, 30/70, 20/80, 10/90 e 0/100, usando100 mL de cada sistema de

solvente. Foram Coletadas duas frações de 50 mL para cada proporção. Após evaporação

do solvente (T = 40ºC) as frações foram avaliadas por cromatografia de camada delgada

comparativa (CCDC), resultando no isolamento da 5-metil meleína (1) (fração 4; 80/20

Hex/AcOEt) e nectriapirona (2) (fração 7; 55/45 Hex/AcOEt).

O extrato bruto AcOEt-ME foi fracionado em CC (coluna 15 x 2,5cm, sílica gel) usando um

gradiente CH2Cl2/AcOEt nas seguintes proporções: 100/0, 95/5, 90/10, 85/15, 80/20, 75/25

e 70/30, usando 100 mL de cada sistema de solvente. Coletando duas frações de 50 mL

para cada proporção. As frações obtidas foram avaliadas por CCDC, resultando no

isolamento do tirosol (3) (fração 5; 90/10 CH2Cl2/AcOEt) e do triptofol (4) (fração 10; 80/20

CH2Cl2/AcOEt).

37

2.3 Análise Química

Experimentos de RMN de 1H e 13C uni e bidimensionais foram realizados em espectrômetro

Varian INOVA-500 operando a 500 MHz para o núcleo de 1H e em 125 MHz para o núcleo

de 13C. TMS (Trimetilsilano) foi utilizado como referência interna. Os espectros de massas

foram obtidos em espectrômetro de massas de alta resolução da Micromass TOF-MS-ES.

As análises em cromatografia em camada delgada foram feitas em placas de sílica gel 60

com indicador de fluorescência UV254 da Merck. As revelações foram efetuadas com

irradiações UV de 254nm e 360nm e exposição a iodo sublimado.

2.3.1 Identificação de compostos dos fungos

Os compostos conhecidos 5-metil meleína (1), nectriapirona (2), tirosol (3) e triptofol (4),

isolados da cultura líquida de Phomopsis sp. (Figura 1) foram identificados por meio das

técnicas espectroscópicas RMN de 1H e 13C, gHMBC, gHSQS, gCOSY, espectrometria de

massas e comparação com as dados da literatura [20, 21, 22, 23].

2.3.1.1 Composto 1

5-metil meleína (1) (7,9 mg), sólido cristalino HRMS: m/z 193,0879 [M+H]+ Calcd for

C11H13O3, (193,0854). RMN de 1H, 500 MHz, CDCl3, δ: 4,60 (m, H-3) , 1,48 (d, 6,5 Hz, H-3’)

, 2,80 (dd, 16,5 e 3,0 Hz, H-4), 2,60 (dd, 16,5 e 12,0 Hz, H-4’), 2,12 (s, H-5’), 6,75 (d, 8,5

Hz, H-6), 7,21 (d, 8,5 Hz, H-7), 10,92 (s, OH), RMN de 13C, 125 MHz, CDCl3, δ: 170,5 (C-1) ,

75,5 (C-3) , 18,3 (C-3’) , 32,1(C-4), 115,9 (C-5) , 21,1 (C-5’), 138,1 (C-6), 125,1 (C-7), 160,7

(C-8), 108,3 (C-9), 137,2 (C-10)

2.3.1.2 Composto 2

Nectriapirona (2) (12,0 mg), sólido amorfo HRMS: m/z 195,1054 [M+H]+ Calcd for C11H14O3,

(195,1010). RMN de 1H, 500 MHz, CDCl3, δ: 6,03 (s, H-5), 6,61 (q, 7,3 Hz, H-8), 1,76 (d, 7,3

Hz, H-9), 1,82 (s, H-10) , 1,86 (s, H-11) 3,83 (s, H-12), RMN de 13C, 125 MHz, CDCl3, δ:

165,4 (C-2), 102,1(C-3), 166,3 (C-4), 91,7 (C-5), 160,4 (C-6), 127,1 (C-7), 129,9 (C-8), 14,4

(C-9), 8,8 (C-10), 12,3 (C-11), 56,3 (C-12)

2.3.1.3 Composto 3

Tirosol (3), (13,0 mg), sólido amorfo HRMS: m/z 121,0668 [M+H-H2O]+ Calcd for C8H10O3K,

(121,0687). RMN de 1H, 500 MHz, CDCl3, δ: 3,44 (t, 7,2 Hz,H-1), 2,52 (t, 7,2 Hz, H-2), 6,94

(d, 8,5 Hz, H-4 e H-8), 6,58 (d, 8,5 H z, H-5 e H-7), RMN de 13C, 125 MHz, CDCl3, δ: 63,2

(C-1), 38,9(C-2), 130,1(C-3), 130,3(C-4 e C-8), 115,6 (C-5 e C-7),156,1(C-6)

38

2.3.1.4 Composto 4

Triptofol (4) (3,4 mg), sólido amorfo HRMS: m/z 200,0777 [M+K]+ Calcd for C10H11NO,

(200,0472). RMN de 1H, 500 MHz, CD3OD, δ: 2,97 (t, 6,2 Hz, H-1’), 3,84 (t ,6,2 Hz, H-2’),

8,10 (s, H-1), 7,00 (s, H-2), 7,54 (d, 7,5 Hz, H-4), 7,06 (t, 7,5 Hz, H-5), 7,14 (t, 8,0 Hz, H-6),

7,29 (d ,8,0 Hz, H-7), RMN de 13C, 125 MHz, CD3OD, δ: 29,9 (C-1’), 62,8 (C-2’), 121,7 (C-2),

111,4 (C-3), 128,0 (C-3a), 119,0 (C-4), 118,4 (C-5), 122,1 (C-6), 110,8 (C-7) 136,6 (C-7a)

2.5 Avaliação Biológica

2.5.1 Drogas e reagentes

Neostigmina (RBI). Acetilcolinesterase (AChE) isolada de enguia elétrica (EC 3.1.1.7); iodeto

de acetiltiocolina (ACTI); butirilcolinesterase (BuChE) de soro equino (EC 3.1.1.8); 5,5 '-

Ditiobis-(2-nitrobenzóico) (DTNB); Tris-HCl, utilizado no preparo do tampão foram obtidos da

Sigma_Adrich. Outros reagentes foram utilizados em grau comercial.

2.5.2 Avaliação da atividade anticolinesterásica

Os extratos e compostos isolados foram diluidos em metanol/H2O 1:1 na primeira diluição

seguido de diluições sucessivas em água destilada. A atividade inibitória das enzimas AChE

e BuChE para os extratos e também para os compostos individuais, foi determinada

utilizando-se o método colorimétrico de Ellman [24] com pequenas modificações.

Neostigmina, composto de referência foi obtido da Research Biochemicals-Internacionais

(RBI), foi utilizado como inibidor de colinesterase padrão (controle positivo). As absorbâncias

lidas em 405 nm, a cada 15 min durante 60 min, num leitor de microplacas Multiskan FC

(Thermo Scientific). Foram pipetados em triplicata 62μL de DTNB (2,98 mM), 50 µL de ACTI

(7,91 mM), 50 µL de AChE ou BuChE (0,002 e 0,001 U/mL, respectivamente) e

concentrações crescentes dos extratos (10-7 - 10-2 mg/mL), dos compostos isolados (10-7 -

10-2) M ou de neostigmina (10-9 - 10-4) M. Foram construidas curvas controle para a inibição

das enzimas pelo veículo utilizado.

2.6 Análise matemática

Os valores de potência (IC50) e inibição máxima (Emax) foram calculados a partir da

regressão não linear utilizando a equação da sigmoide. Os dados de Emax foram expressos

como média ± EPM (erro padrão da média) e os resultados de IC50 foram expressos como

média e intervalo de confiança. A razão entre as potências (IC50 AChE/IC50 BuChE) foram

utilizadas na avaliação da seletividade. O software GraphPad® Prism 5 foi utilizado em

todas as análises.

39

3 Resultados e Discussão

3.1 Atividade inibitória das colinesterases

No presente trabalho, encontramos compostos que inibem de forma concentração

dependente as enzimas AChE e BuChE, evidenciando o potencial para novos fármacos

anticolinesterásicos e também compostos que são seletivos para a BuChE como excelentes

alternativas para fármacos a serem indicados no tratamento em fase avançada da DA.

Ainda, comprovamos o potencial anticolinesterásico do extrato bruto do fungo Phomopsis

sp. associado a espécies tropicais.

Dentre os fungos endofíticos, o Phomopsis sp tem sido objeto de estudo como fungo

produtor de metabólitos bioativos. Em estudos recentes, foi isolado um novo composto, o

policetídeo 2 - (7'-hidróxi oxioctil)-3-hidróxi-5-éster etílico do ácido metoxibenzenoacético a

partir do fungo endofítico Phomopsis sp. de manguezais do Mar da China Meridional e

testada a sua eficiência contra células HEp-2 e HepG2 tendo este composto mostrado

resultado citotóxico contra as células avaliadas [25]. Em outra pesquisa, estudos feitos a

partir de um total de 39 fungos endofíticos associados a algumas espécies de plantas

tropicais e tendo avaliado seus extratos em base acetato de etila quanto à ação

antiparasitária, antitumoral e antimicrobiana obtiveram-se excelentes resultados,

evidenciando assim os fungos endofíticos como fontes promissoras de produtos bioativos

naturais [26]. HOUGHTON e colaboradores [27] apresentaram resultados obtidos a partir de

ensaios realizados com compostos isolados de fungos endofíticos onde foi possível

observar que duas acridonas, quinolactacina A1 e quinolactacina A2, isoladas de fungos

Penicillium citrinum apresentaram efeito inibitório da AChE, no mesmo trabalho, um

composto isolado a partir do fungo Fusarium tricinctum, a vizoltricina nitrogenada,

apresentou atividade contra a AChE em soro humano. Em algumas pesquisas, a avaliação

da atividade anticolinesterásica utilizando-se extrato de fungos endofíticos têm demonstrado

que os fungos Phomopsis sp. são seletivos para a enzima butirilcolinesterase [1]. Os

ensaios realizados em nosso estudo, mostraram que o extrato bruto do fungo Phomopsis sp.

associado à espécie Hancornia speciosa apresenta ação inibitória dual. Os extratos brutos

de Phomopsis sp. inibiram as colinesterases de forma concentração dependente com

valores das potências de 0,469 mg/mL [0,304 – 0,725 mg/mL] e R2 = 0,92 para AChE e

0,295 mg/mL [0,224 – 0,389 mg/mL] e R2 = 0,96 para BuChE (Figura 2A) extrato bruto em

ME e inibição máxima de 74,52% e 66,65% para AChE e BuChE, respectivamente. A razão

entre as potências indicou seletividade de 1,62 vezes para a BuChE ao inibir as

colinesterases (IC50AChE/IC50BuChE = 1,62), enquanto o extrato bruto em CBD apresentou

40

valores de potências de 4,687 mg/mL [1,268 – 17,32 mg/mL] e R2 = 0,99 para AChE e 0,305

mg/mL [0,216 – 0,429 mg/mL] e R2 = 0,95 para BuChE (Figura 2B). A inibição máxima foi de

83,33% e 45,01% para AChE e BuChE, respectivamente. A razão entre as potências indicou

seletividade de 15,39 vezes para a BuChE ao inibir as colinesterases (IC50AChE/IC50BuChE

= 15,39). O veículo utilizado não inibiu as enzimas AChE e BuChE. A neostigmina é um

agente da classe dos anticolinésterásicos, fármacos utilizados clinicamente no tratamento

do íleo paralítico, atonia vesical, glaucoma e miastenia gravis, bem como na reversão do

bloqueio neuromuscular proporcionado pela administração de agentes curarizantes durante

a anestesia. Os fármacos dessa classe atuam ao inibir reversivelmente a ação da

acetilcolinesterase, causando acúmulo de acetilcolina em glânglios autonômicos, receptores

muscarínicos do sistema nervoso autônomo, receptores nicotínicos na placa motora e

receptores colinérgicos no sistema nervoso central [28]. No presente trabalho, a

neostigmina, inibiu as enzimas AChE e BuChE (Figura 2C) de forma concentração-

dependente tendo apresentado IC50 de 143,4 nM [114,0 – 180,4 nM] e de 52,06 nM [46,14 –

58,74 nM], para AChE e BuChE, respectivamente. A razão entre as potências indicou

seletividade de 2,75 vezes para a BuChE ao inibir as colinesterases (IC50AChE /IC50BuChE

= 2,75).

O composto (1) 5-metil meleína isolado do extrato bruto AcOEt-CBD uma

dihidroisocumarina amplamente encontrada em compostos fúngicos e conhecida por sua

atividade antifúngica e também antibacteriana [29], em nosso trabalho, inibiu a AChE de

forma concentração dependente com valor de potência de 184,1 µM [101,6 – 333,8 µM], a

inibição máxima foi de 25,75% e R2 = 0,90. Porém a 5-metil meleína não inibiu a enzima

BuChE na forma concentração dependente, o percentual máximo de inibição foi de 4,52%

na concentração 10-2 M, resultados mostrados na Figura 3A.

A Nectriapirona (2), também isolada do extrato bruto AcOEt-CBD, inibiu a enzima BuChE de

forma concetração-dependente, com potência de 290,5 µM [127,2 – 663,3 µM] e inibição

máxima de 61,83% e R2= 0,84. No entanto, quando testado frente à enzima AChE, este

composto não mostrou inibição na forma concentração-dependente. O percentual máximo

de inibição foi de 17,26% apenas na concentração mais alta do composto (10-2M) conforme

demonstrado na figura 3B.

A nectriapirona tem sido investigada como antibiótico contra Staphylococcus aureus [31],

como composto antimicrobiano e como agente leishmanicida. Além disso, apresentou

relevante atividade citotóxica especifica contra células alvo quando avaliada sua ação

antitumoral contra células leucêmica humana JURKAT T e células de melanoma B16F10,

sendo considerado seu potencial em induzir a produção de melanina em linhagens de

41

células de melanoma B16-F1 [26, 32, 33]. No entanto seu potencial como inibidor das

colinesterases não tem sido demonstrado na literatura, aqui avaliamos a sua atividade

anticolinesterásica e os resultados encontrados revelam que este composto pode ser

excelente alternativa como fármaco anticolinesterásico seletivo butirlcolinesterase.

O tirosol (3) (2-(4-hidroxifenil)) isolado do extrato bruto AcOEt-ME nesse trabalho inibiu a

enzima AChE na forma concentração dependente com valores das potências de 482,5 µM

[281,6 – 826,7 µM], a inibição máxima foi de 42,91% (R2 = 0,84). No entanto, o mesmo não

inibiu a enzima BuChE de forma concentração dependente esses resultados estão

expressos na figura 3C.

O tirosol é um composto fenólico muito conhecido devido a suas propriedades antioxidantes,

ele está presente em vinhos e azeite como um componente importante por seu efeito de

eliminação de oxigênio reativo e de espécies de azoto que estão implicados em algumas

patologias humanas tais como, doenças cardiovasculares e tromboses [34, 35]. Este

composto teve sua ação neuroprotetora comprovada em teste realizados em ratos e como

consequência disto, tem sido considerado excelente alternativa em terapia para pacientes

que sofreram acidente vascular cerebral [36]. Devido às suas propriedades antioxidantes, o

tirosol pode ser também, um fármaco bastante promissor a ser indicado no tratamento de

pacientes portadores de doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson,

esclerose lateral amiotrófica e DA, tendo em vista que essas patologias são agravadas pelo

stress oxidativo provocado pela presença de radicais livres, implicando na progressão da

doença. O stress oxidativo é o resultado de um desequilíbrio na homeostase pró-

oxidante/antioxidante que conduz à geração de espécies reativas de oxigênio tóxico para

diversas células [37, 38].

O composto (4) o triptofol, alcalóide indólico também isolado do fungo Phomopsis sp.,

extrato AcOEt-CBD mostrou-se potente inibidor da enzima BuChE, inibindo esta de forma

concentração-dependente com potência de 34,15 µM [28,12 – 41,47 µM] e inibição máxima

de 67,5% (R2 = 0,98). Apesar de não inibir a AChE de maneira concentração-dependente

nas concentrações testadas, conforme mostrado na figura 3D. O percentual máximo de

inibição foi de 23,17%, na concentração mais alta do composto (10-2M). O triptofol vem

sendo investigado devido às suas propriedades antiparasitárias, em estudos recentes esse

composto foi testado in vitro contra células de protozoários parasitas: Trypanosoma brucei

rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani e Plasmodium falciparum, sendo

contra todas elas potencialmente ativo o que o qualifica como excelente candidato a novo

fármaco antiprotozoário considerando que doenças protozoárias continuam sendo um dos

principais problemas de saúde pública em todo o mundo e tendo em vista que alguns destes

42

protozoários desenvolvem resistência rápida aos medicamentos disponíveis atualmente.

Assim, torna-se urgente a descoberta de novas alternativas terapêuticas [39]. Estudos

recentes avaliaram o triptofol quanto a sua ação antibacteriana e obtiveram rlevantes

resultados deste composto sobre culturas de bactérias gram-positivas e Candida albicans

[40].

O triptofol é um metabólito produzido no fígado de mamíferos pela triptamina, também foi

identificado in vivo como sendo um metabólito de serotonina (5-hidroxitriptamina) em ratos e

também nos seres humanos. É um composto que induz o sono em mamíferos de laboratório

tendo em vista sua propriedade de atravessar com facilidade a barreira hematoencefálica, é

considerado responsável pela síndrome da doença do sono provocada pelo parasita

tripanossoma [41] essa característica pode ser benéfica quando aplicada como medida

terapêutica em paciente com DA, pois o seu efeito sonífero proporcionaria bem estar e

descanso, melhorando a qualidade de vida desses pacientes.

Conclusão

Os resultados desse trabalho ao avaliarmos a atividade anticolinesterásica dos extratos

bruto dos fungos endofíticos associados à planta mangabeira e também os seus respectivos

compostos isolados foram motivadores tendo em vista que foram encontrados compostos

inibidores para a AChE e também para a BuChE. Os valores de potências inibitórias

encontrados, tanto para os extratos brutos quanto para os compostos puros quando

comparados com o controle positivo, mostraram que as amostras analisadas possuem

atividade relevante frente às enzimas, qualificando o extrato bruto do fungo Phomopsis sp.,

bem como seus compostos 5-metil meleína, nectriapirona, tirosol e triptofol como

promissores para estudos quanto ao seu potencial para o desenvolvimento de novos

fármacos anticolinesterásicos, corroborando com os estudos realizados com esse fungo e

publicados por outros grupos de pesquisa. O triptofol foi o mais promissor, uma vez que este

composto possui ação dual, sendo seletivo BuChE.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por subvenções e bolsas do CNPq e da FINEP do Ministério da

Ciência e Tecnologia. Os autores são gratos aos Professores, Ana Paula Prates pela

identificação do material vegetal e João Professor Basílio Mesquita pela identificação do

fungo.

43

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46

FIGURAS CAPÍTULO I

FIGURA 1 – Estruturas dos Compostos 1 – 4 isolados do PE extrato AcOEt-ME e AcOEt-

CBD

FIGURA 2 – Inibição da atividade da AChE e BuChE pelo PE (A) e neostigmina (B) . Os

dados representam inibição na forma concentração-dependente medida no tempo 60

minutos após a adição do substrato. Os pontos nos gráficos representam média e E.P.M. de

dois experimentos independentes em triplicata

FIGURA 3 – Inibição da atividade da AChE e BuChE pela 5-metil meleína (1); nectriapirona

(1); tirosol (3) e triptofol (4). Os pontos nos gráficos representam média e E.P.M. de dois

experimentos independentes em triplicata

47

Figura 1

48

Figura 2

10 -10 10-8 10 -6 10 -4 10 -2

0

20

40

60

80

100

AChE

BuChE

(A)

Log PE-ME (mg/mL)

Ati

vid

ad

e (

%)

10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 10 -2

0

20

40

60

80

100

AChE

BuChE

(B)

Log PE-CBD (mg/mL)

Ati

vid

ad

e (

%)

10-10 10-8 10-6 10-4

0

20

40

60

80

100

AChE

BuChE

(C)

Log Neostigmina (M)

Ati

vid

ad

e (

%)

49

Figura 3

10 -10 10 -8 10 -6 10 -4 10 -2

0

20

40

60

80

100

AChE

BuChE

(1)

Log 5-metil meleína (M)

Ati

vid

ad

e (

%)

10 -10 10 -8 10 -6 10 -4 10 -2

0

20

40

60

80

100

AChE

BuChE

(2)

Log Nectriapirona (M)

Ati

vid

ad

e (

%)

10 -10 10 -8 10 -6 10 -4 10 -2

0

20

40

60

80

100

AChE

BuChE

(3)

Log Tirosol (M)

Ati

vid

ad

e (

%)

10 -10 10 -8 10 -6 10 -4 10 -2

0

20

40

60

80

100

AChE

BuChE

(4)

Log Triptofol (M)

Ati

vid

ad

e (

%)

50

CAPÍTULO II

ARTIGO 2 – Efeito do mentol na aquisição e consolidação da memória em zebrafish

Este artigo será submetido ao periódico: BEHAVIOURAL BRAIN RESEARCH

51

Efeito do mentol na aquisição e consolidação da memória em zebrafish Rosiane dos Santosa, Péricles Barreto Alvesb, Rosilene Moretti Marçala* aDepartamento de Farmácia, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, Sergipe Brasil. bDepartamento de Química, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, Sergipe, Brasil Resumo Demência e perda de memória são alguns dos problemas enfrentados por pacientes com doença de Alzheimer (DA). Fármacos desenvolvidos com base na hipótese colinérgica para a causa da DA, são a principal alternativa para o tratamento dos sintomas cognitivos desta doença. Tendo em vista estes fatos, avaliou-se o efeito do mentol sobre a aprendizagem e consolidação da memória em zebrafish com o objetivo de identificar o potencial dessa substância como candidato a fármaco anticolinesterásico, uma vez que testes realizados in vitro demonstraram que o mentol tem potente ação inibitória das colinesterases. Quatro doses desse composto foram testadas e observou-se que o mentol produz efeito sobre a memória de zebrafish adulto, revertendo amnésia induzida por escopolamina. Palavras chave: Doença de Alzheimer; mentol; zebrafish * Autor para correspondência: Rosilene Moretti Marçal. Laboratório de Farmacodinâmica e Etnofarmacologia, da Universidade Federal de Sergipe, CCBS-DFS, São Cristóvão, Sergipe, Brasil 49,100-000. Telefone: +55-79-2105-6345, Fax: +55-79-2105-6641. E-mail: rosilenemoretti@ufs.br; rosilenemoretti@gmail.com

52

Effect of menthol on the acquisition and consolidation of memory in zebrafish Rosiane dos santosa, Péricles Barreto Alvesb, Rosilene Moretti Marçala*

aPharmacy Department, Federal University of Sergipe, São Cristóvão, Sergipe, Brazil. bChemistry Department, Federal University of Sergipe, São Cristóvão, Sergipe, Brazil,

Abstract Dementia and memory loss are some of the problems faced by patients with Alzheimer's disease (AD). Drugs developed based on the cholinergic hypothesis for AD is the main alternative for the treatment of cognitive deficits of this disease. This work we evaluated the effect of menthol of learning and memory consolidation in zebrafish in order to identify the potential of this compound as a drug candidate anticholinesterase, since in vitro tests showed that menthol has potent inhibitory action of cholinesterase. Four doses of compound were tested and it was observed that menthol produces an effect on the memory of adult zebrafish, reversing amnesia induced by scopolamine. Keywords: Alzheimer's disease; menthol; zebrafish *Corresponding author: Rosilene Moretti Marçal. Pharmacodymanic and Ethnopharmacology Laboratory, Universidade Federal de Sergipe, CCBS-DFS, São Cristóvão, Sergipe, Brazil 49.100-000. Phone: +55-79-2105-6345, Fax: +55-79-2105-6641. E-mail: rosilenemoretti@ufs.br; rosilenemoretti@gmail.com

53

1 Introdução

Produtos naturais, devido à sua diversidade química são uma rica fonte de potenciais

inibidores das colinesterases. Dentre os compostos naturais, destacam-se os terpenos como

alternativas para o desenvolvimento de novos fármacos anticolinesterásicos [1]. Pesquisas

tem demonstrado in vivo que monoterpenos são bons agentes inibidores das colinesterases,

proporcionando melhora na função cognitiva após a sua administração como componente

de óleo essencial ou em extratos de plantas [2]. O mentol (Figura 1) é um álcool cíclico

monoterpênico encontrado em óleos essenciais de plantas, principalmente da Menta

piperita. Seu uso é bastante difundido em produtos cosméticos e alimentícios devido a sua

ação refrescante, mas também tem ampla aplicação na indústria farmacêutica por possuir

complexos efeitos periféricos, é considerado seguro e tem sido aprovado como contador

externo de substâncias irritantes [3].

Alguns estudos tem demonstrado a ação analgésica central do mentol por indução do

receptor GABAA. O efeito do mentol sobre os canais de Na+ e Ca2+ também foi

anteriormente descrito [4]. O mentol também aumenta a inibição tônica medidada pela

modulação dos receptores GABA em neurônios piramidais da região CA1 no sistema

nervoso central de ratos, levando à inibição in vitro da excitabilidade neuronal e in vivo da

rede de hiper-excitabilidade do hipocampo [5, 6]. Recentemente, o efeito do mentol sobre os

receptores nicotínicos colinérgicos (nAChRs) foi demonstrado. O mentol age inibindo

reversivelmente, os nAChRs, expressos por neurônios sensoriais por meio do mecanismo

de modulação alostérica de nAChR [7].

Em trabalho recente do nosso grupo de pesquisa, o mentol apresentou potente atividade

inibitória da butirilcolinesterase apresentando IC50= 1480 µM [968 – 2269 µM], agindo como

inibidor competitivo para esta enzima, este composto inibiu também a enzima

acetilcolinesterase, esses resultados motivaram novos estudos para avaliar o seu efeito

sobre o cérebro de zebrafish em relação à aquisição e retenção da memória, como também

a capacidade de reverter a amnésia induzida por escopolamina, qualificando o mentol como

possível fármaco para o tratamento de doenças neurodegenerativas como no caso da

doença de Alzheimer (DA).

Demência e perda de memória são alguns dos problemas enfrentados por pacientes

portadores da DA, essa doença degenerativa e progressiva que acomete, na maioria dos

casos, pessoas idosas e está relacionada com a deficiência nos processos sinápticos

provocados por uma série alterações genética, neuropatológicas e fisiológicas que resultam

na redução dos níveis de acetilcolina no cérebro. Do ponto de vista neuropatológico, a DA é

resumida pela presença de placas amiloides que são constituídas principalmente de

peptídeo amiloide-β (Aβ), emaranhados neurofibrilares intraneuronais e perda dos

54

processos sinápticos e marcadores pré-sinápticos do sistema colinérgico observadas em

áreas específicas do cérebro [8].

As bases bioquímicas e celulares dos sintomas cognitivos e comportamentais da perda de

memória observada com a idade avançada e na DA tem recebido grande atenção no campo

científico e, embora não estejam completamente elucidadas, proporcionam um ponto de

partida para a compreensão das modificações que aparecem durante o envelhecimento

normal e patológico. Determinar processos bioquímicos e moleculares envolvidos com

aprendizado e com as diferentes etapas (aquisição, consolidação, evocação e extinção) e

formas de memória em modelos animais de envelhecimento ou modelos relevantes para a

DA é de extrema importância para o desenvolvimento de novos fármacos e para o

tratamento de alterações bioquímicas que influenciam na patogenia dessa doença [9].

Nesse ponto de vista o zebrafish surge como um excelente modelo para avalição de

comportamento e estudos de aprendizagem e consolidação de memória, tendo em vista a

organização do seu genoma e os caminhos genéticos que controlam a transdução de sinal e

desenvolvimento serem altamente conservadas em relação ao humano [10]. Em termos de

neuroanatomia, apesar de algumas diferenças entre teleósteos e mamíferos, tais como a

disposição do prosencéfalo (revisto por [11]) bem como a estrutura e função do tecto ótico

[12], a organização global do cérebro do zebrafish é semelhante a outros vertebrados, até

mesmo estruturas abrangentes do pálio lateral que parecem ser homólogos estrutura do

hipocampo dos mamíferos, qualificando os zebrafish para a utilização como modelo útil para

avaliar o comportamento dos vertebrados e compreensão dos mecanismos de distúrbios

cerebrais que levam a déficits funcionais e comportamentais. [13]. Um modelo de análise

comportamental eficiente para avaliar aquisição e retenção da memória em zebrafish, foi

validado por Kim e colaboradores. Nesse trabalho, eles avaliaram o efeito de um

antagonista do receptor muscarínico colinérgico, a escopolamina, droga conhecida por

induzir défictis de mémoria em animais e também em humanos, e de um agente inibidor da

acetilcolinesterase, a fisostigmina, sobre a capacidade de aprendizagem e de consolidação

da memória em zebrafish [14].

Tendo estes fatos em vista, no presente trabalho foi investigado o efeito do mentol sobre a

capacidade de aprendizagem e consolidação da memória em zebrafish adulto, utilizando-se

o teste da esquiva passiva validado por Kim e colaboradores como modelo simples e

eficiente para análise neurocomportamental em peixes [15].

2 Metodologia

2.1 Tratamento da água

A água utilizada foi de fonte municipal (torneira); traços de cloro e de metais pesados foram

neutralizados e removidos utilizando-se o Aqua Safe Plus (Tetra®). O pH foi ajustado para a

55

faixa de 6,5 a 7,5.

2.2 Drogas e sais

Escopolamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e neostigmina (RBI Research

Biochemicals-Internacionais) foram dissolvidas em concentrações de 0,2 M e 0,02 M,

respectivamente em 1000 µL de água destilada, e depois diluídas em água tratada (veículo)

para 200 µM de escopolamina e 20 µM de neostigmina. O mentol foi dissolvido na

concentração de 0,2 M em água destilada e posteriormente diluída nas concentrações de

[0,02; 0,2; 2,0 e 20 µM] em veículo. Para melhor diluição do mentol, utilizava-se de banho

ultrassom com aquecimento de 50°C durante 20 minutos. No processo de administração dos

fármacos, os animais foram colocados individualmente em béquer de 250 mL, contendo 100

mL de água tratada (controle veículo), ou mentol, neostigmina (controle positivo) ou

escopolcamina (controle negativo), todos diluídos em água tratada até as concentrações

finais citadas.

2.3 Ensaios in vivo

2.3.1 Animais

Os procedimentos foram adaptados de Kim e colaboradores [13] e realizados em

conformidade com a legislação “Canadian Council on Animal Care. Guidelines on: the care

and use of fish in research, teaching and testing” e com aprovação do Comitê de Ética em

Pesquisa com Animais da UFS (No. 75/2011). Os peixes adultos foram mantidos em aquário

com capacidade para 37 litros.

Foram utilizados peixes adultos de ambos os gêneros, adquiridos de um pet local,

submetidos a um ciclo de luz de 14 horas e alimentados com ração específica (Spirulina

Alcon Gold) duas vezes ao dia. O aquário foi mantido em temperatura entre 26 e 29°C.

2.3.2 Câmara experimental

Uma câmara de acrílico (18,5 cm de comprimento x 7,0 cm de largura x 10,0 cm de altura)

subdividida em dois compartimentos por uma porta deslizante com um orifício de 3,0 cm de

diâmetro. Um compartimento permaneceu escuro e outro compartimento transparente que

permitia a passagem da luz intermitente pelo orifício de 3 cm de diâmetro através da porta

deslizante (adaptado de Kim e colaboradores [14].

2.3.3 Teste da resposta de esquiva passiva

Cada zebrafish foi colocado no compartimento escuro da câmara experimental. Depois de 3

min de aclimatação, a luz intermitente se revelou pela porta aberta. O tempo necessário

para o peixe atravessar a porta foi cronometrado a partir do momento em que esta foi

56

aberta, até o momento em que o peixe ultrapassou a porta. Como um estímulo nocivo ou

desagradável uma pequena pedra de aproximadamente 0,98 g foi abandonada em frente ao

peixe 3 s após passagem pela porta. Então, o zebrafish era conduzido de volta para o

compartimento escuro através da porta usando uma rede de pesca de pequeno porte. Este

procedimento foi repetido por mais duas vezes com intervalo de três minutos. Cada

cruzamento foi considerado um ensaio e uma sessão de treinamento foi composta de 3

ensaios. Em todos os experimentos, o tempo de travessia foi medido até 300 s. Zebrafish

com tempo de travessia maior que 300s no primeiro ensaio foi descartado. Para uma sessão

de teste, uma prova única foi realizada 2 h após o término de uma sessão de treino,

seguindo o mesmo procedimento. Os treinos foram utilizados para verificar a aprendizagem

e o teste para verificar a consolidação da memória.

2.3.4 Procedimento experimental

2.3.4.1 Grupo Controle veículo (Figura 2A): Cada Zebrafish foi exposto ao veículo por 2 h,

com mudança de béquer a cada hora para que o animal passasse pelo mesmo estresse que

os demais grupos antes da sessão de treino. Em seguida, o peixe era colocado na câmara

para experimentação. Posteriormente a sessão de treino, o animal retornava para o béquer,

onde permanecia por 2 h antes da realização do teste.

2.3.4.2 Grupo Controle neostigmina (Figura 2B): Cada Zebrafish foi exposto ao veículo

por 1 h. Em seguida cada animal foi colocado em outro béquer contendo neostigmina (20

µM) por mais 1 h antes de ser colocado na câmara de experimentação para sessão de

treino. Posteriormente o animal foi recolocado no béquer com neostigmina, onde

permanecia por 2 h antes do teste.

2.3.4.3 Grupo Tratado com escopolamina (Figura 2C): Cada Zebrafish foi exposto ao

veículo por 1 h. Em seguida cada animal foi colocado em outro béquer contendo

escopolamina (200 µM) por mais 1 h antes de ser colocado na câmara de experimentação

para a sessão de treino. Posteriormente ao treino, o animal foi recolocado no béquer com

escopolamina, onde permanecia por 2 h antes do teste.

2.34.4 Grupo Tratado com mentol: Cada Zebrafish foi exposto ao veículo por 1 h. Em

seguida cada animal foi colocado em outro béquer contendo mentol (0,02 a 20 µM) por mais

1 h antes de ser colocado na câmara de experimentação para sessão de treino.

Posteriormente o animal foi recolocado no béquer com mentol (0,02 a 20 µM) onde

permanecia por 2 h antes do teste. Esse processo foi realizado para concentração de

57

mentol.

2.3.4.5 Grupo Reversão controle: Cada Zebrafish foi pré-tratado com a neostigmina (20

µM) por 1 h. Em seguida cada animal foi colocado em outro béquer contendo escopolamina

(200 µM) por 1 h antes de ser colocado na câmara de experimentação para sessão de

treino. Posteriormente ao treino, o animal passava para outro béquer contendo uma

associação de neostigmina e escopolamina (20 µM e 200 µM respectivamente), onde

permanecia por 2 h antes do teste.

2.3.4.6 Grupo Reversão mentol: Cada Zebrafish foi pré-tratado com mentol (0,00002 a

0,02 mM) por 1 h. Em seguida cada foi colocado em outro béquer contendo escopolamina

(200 µM) por 1 h antes de ser colocado na câmara de experimentação para sessão de

treino. Posteriormente ao treino, o animal passava para outro béquer contendo uma

associação de mentol e escopolamina (0,02 a 20 µM e 200 µM respectivamente), onde

permanecia por 2 h antes do teste.

A câmara de experimentação, durante a sessão de treino e de teste, continha a substância

na concentração a ser testada, ou a associação desta com a escopolamina no processo de

reversão ou água tratada no caso do grupo controle veículo.

2.4 Análise Matemática

Todas as análises matemáticas foram realizadas no software Prisma® 4.03 (GraphPad

Software Inc.). Os dados foram analisados por meio da análise de Friedman para medidas

repetidas de variância e pelo teste de Kruskal – wallis para comparar amostras

independentes. Os gráficos foram expressos como média ± erro padrão da média. Foi

utilizado intervalo de confiança de 95%.

3 Resultados e discussão

Durante as sessões de treinos houve um aumento no tempo de latência, tempo de

permanência do peixe no interior do compartimento escuro da câmara. Esse tempo

corresponde ao período esperado para aquisição de aprendizagem numa sessão completa

de três treinos (Figura 3). No controle veículo (CV) houve aumento significativo do tempo de

latência (p < 0,001) no treino 3 (T3) quando comparado com o treino 1 (T1) indicando

aquisição de aprendizagem. Decorridas 2 horas após a sessão de treinos não houve

diferença significativa entre o treino 3 e o teste (TS) evidenciando consolidação da memória

(Figura 4). No controle positivo (CP) (Figura 2B) houve também aumento significativo do

tempo de latência com o passar dos treinos com p < 0,05 entre T1 e treino 2 (T2) e p <

0,001 entre os treinos 2 e 3 e assim como em CV não houve diferenças significativas entre

T3 e TS. Comparando os tempos desempenho dos zebrafish nos grupos CV e CP os

58

resultados não apresentaram diferenças significativas nos tempos de latência.

A escopolamina é um antagonista competitivo de receptores muscarínicos, e tem

demonstrado em estudos recentes com roedores seu pontencial em reduzir a aprendizagem

e a memória, numa variedade de tarefas comportamentais, tais como exemplo o teste da

esquiva passiva e teste de labirinto de água [16]. Nesse trabalho, a escopolamina

administrada na concentração de 200 µM, induziu amnésia em zebrafish (Figura 2C),

reduzindo significativamente o tempo de latência entre os treinos T3 e o teste quando

comparados com o controle veículo, evidenciando assim o efeito na droga no

comprometimento da memória tendo em vista que não houve aquisição nem retenção da

memória.

Quando o peixe é exposto ao mentol puro, observa-se que não há diferenças significativas

entre as sessões de treino (Figura 3 B, C e D), embora quando exposto ao mentol na

concentração de 0,02 µM, no T2 o peixe tenha permanecido tempo maior dentro do

compartimento escuro em relação ao T2 do CV (Figura 3A). No entanto essa diferença

embora estatisticamente significativa, não representa no conjunto, um efeito do mentol sobre

a aquisição e consolidação da memória, tendo em vista que não há diferenças significativas

entre o T3 e TS quando comparados respectivamente com T3 e TS do controle veículo.

Esses resultados indicam que não há efeito da droga pura sobre a memória do peixe.

Estudos realizados por outros grupos de pesquisa revelam que o comportamento de

zebrafish expostos a drogas de ação anticolinesterásica pode sofrer alteração

comprometendo o tempo de natação, mas não influenciando diretamente no processo de

aquisição e consolidação de memória quando avaliados em teste de esquiva passiva [17].

Em todas as sessões de testes observa-se o aumento do tempo de latência indicando que

houve consolidação da memória no tempo esperado de 2 horas. No entanto não há

diferenças significativas entre as doses de mentol utilizadas e o controle aplicado (Figura 4).

Ensaios utilizando-se zebrafish para avaliação da aquisição de aprendizagem e

consolidação da memória oferecem resultados confiáveis, considerando-se que nesse tipo

de ensaio a droga dissolvida na água é eficientemente absorvida pelo peixe através de suas

brânquias, oferecendo maior rapidez na resposta [18, 19]. Animais não vertebrados como o

zebrafish, proporcionam boa oportunidade para observar diretamente os processos de

desenvolvimento neurológico e determinar o impacto de variações de desenvolvimento na

aprendizagem e na memória. Zebrafish são particularmente valiosos do ponto de vista

científico, devido à disponibilidade de técnicas morfológicas de supressão transitória de

partes específicas de expressão do genoma. O desenvolvimento de novos métodos para o

alto rendimento em testes de função cognitiva em peixes podem proporcionar meios para a

detecção rápida de potenciais agentes tóxicos, bem como agentes terapêuticos

promissores. É igualmente importante para o desenvolvimento de testes específicos de

59

vários aspectos da função cognitiva, incluindo a habituação, a aprendizagem associativa, a

memória e atenção, bem como ser capaz de diferenciar alterações na função da cognição

sensório-motora [20].

Nesse trabalho, a avaliação dos animais pré-tratados com o mentol, no processo de

reversão da amnésia induzida por escopolamina, demonstra que o mentol atua no cérebro

do peixe, revertendo a ação da escopolamina e melhorando o déficit de memória do animal

(Figura 5). Esses resultados sugerem que o mentol, por ser uma droga potente na inibição

de colinesterase, atua diretamente no sistema nervoso central do zebrafish, aumentando a

disponibilidade sináptica do neurotransmissor de acetilcolina e reduzindo os déficits

cognitivos que causam amnésia no animal quando exposto à ação da escopolamina. No

entanto, outros estudos devem ainda ser realizados, com a finalidade de investigar o

mecanismo pelo qual o mentol reverte a amnésia induzida pela escopolamina em cérebro de

zebrafish. Estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa mostraram que o mentol inibe in

vitro as enzimas AChE e BuChE de forma concentração dependente [21].

Conclusão

Com base nos resultados alcançados, podemos afirmar que o mentol é um composto

promissor para o desenvolvimento de fármacos anticolinésterásicos e também como

atenuante dos efeitos cognitivos provocados pela DA, como perda de memória e dificuldade

na aprendizagem de novas informações.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por subvenções e bolsas do CNPq e da FINEP do Ministério da

Ciência e Tecnologia.

Referências

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60

Receptor as a Central Target of TRPM8 Agonist Menthol. PLoS ONE 2008; 3(10). [6] Willis DN, LIU B, HA MA, JORDT SE, MORRIS JB. Menthol attenuates respiratory irritation responses to multiple cigarrete smoke irritants. FASEB J 2011; 25: 4434-44. [7] Hans M, Wilhem M, Swandulla D. Menthol Suppresses Nicotinic Acetylcholine Receptor Functioning in Sensory Neurons via allosteric Modulation. Chem Senses 2012; 37: 463-69. [8] Kamal MA, Qu X, Yu QS, Tweedie D, Holloway HW, Greig NH. Tetrahydrofurobenzofuran cymserine, a potent butyrylcholinesterase inhibitor and experimental Alzheimer drug candidate, enzyme kinetic analysis. J Neural Transm 2008; 115: 889-98. [9] Izquierdo I, Prado MA, Ferreira ST, Caramelli P, Cammarota, M. Envelhecimento e memória: foco na doença de Alzheimer. Rev USP 2007; 75: 42-49. [10] Postlethwait JH, Woods IG, Ngo-hazelett P. Zebrafish comparative genomics and the origins of vertebrate chromosomes, Genome Res 2000; 10: 1890-1902. [11] Wullimann MF, Mueller T. Teleostean and mammalian forebrains contrasted: Evidence from genes to behavior. J Com Neurol 2004; 475: 143-62. [12] Luque MA, Pérez PMP, Herrero L, Torres B. Involvement of the optic tectum and mesencephalic reticular formation i the generation of saccadic eye movements in goldfish. Brain Res Rev 2005; 49: 388-97. [13] Tropepe V, Sive HL. Can zebrafish be used as a model to study the neurodevelopmental causes of autismo. Gene Brain Behav 2003; 2: 268-81. [14] Kim Y, Lee Y, Lee H, Jung M, Lee C. Impaired avoidance learning and increased hsp70mRNA expression in pentylenetetrazol-treated zebrafish. Anim Cells Syst 2009; 13: 275-81. [15] Kim Y, Lee Y, Kim D, Jung M, Lee C. Scopolamine-induced learning impairment reversed by physostigmine in zebrafish. Neurosci Res 2010; 67: 156-61. [16] LEE, K. Y.; SUNG, S. H.; KIM, S. H. JANG, Y.P.; OH, T. H.; KIM, Y. C. Cognitive-enhancing activity of loganin isolated from Cornus officinalis in scopolamine-induced amnesic mice Arch Pharm Res 2009, 32: 677-83. [17] Pereira VM, Bortolotto JW, Kist LW, Azevedo MB, Fritsc RS, Oliveira RdaL. Endosulfan exposure inhibits brain AChE activity and impairs swimming performance in adult zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicol 2012; 33: 469-75. [18] Winter MJ, Redfern WS, Hayfield AJ, Owen SF, Valentin JP, Hutchinson TH. Validation of a larval zebrafish locomotor assay for assenssing the seizure liability of early-stage development drugs. J Pharmacol Toxicol Methods 2008; 57: 176-87. [19] Berghmans S, Hunt J, Roach A, Goldsmith P. Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants. Epilepsy Res 2007; 75: 18-28. [20] Levin ED, Cerutti DT. Methods of behavior analysis in neuroscience. 2nd ed Buccafusco JJ, editor Boca Raton (FL): CRC Press 2009. [21] Costa AT, ALVES PB, MARÇAL RM. Avaliação da potência e efeito máximo para a atividade inibitória da butirilcolinesterase pelos terpenos fitol, citronelal, g-terpineno, p-

61

cimeno, mentol e geraniol. In: VII Reunião da Fesbe Regional, Maceió 2012; 1:x-x.

62

FIGURAS CAPÍTULO II

FIGURA 1 – Estrutura do (1R,2S,5R)-2-isopropil-5-metilciclohexanol

FIGURA 2 – Efeito dos controles veículo (V), neostigmina (N) e escopolamina (E) sobre a

aprendizagem e consolidação da memória em zebrafish. Os dados são apresentados como

média do tempo de latência ± E.P.M. (n = 20 – 23)

**: p < 0,01; T3 V vs T3 E

***: p < 0,001; TS V vs TS E

Teste de Kruskal – Wallis

FIGURA 3 – Efeito do mentol sobre a aquisição da memória em zebrafish no teste da

esquiva passiva. Os dados são apresentados como média do tempo de latência ± E.P.M. (n

= 20 – 23)

FIGURA 4 – Efeito do mentol sobre a consolidação da memória. Os dados são

apresentados como média do tempo de latência ± E.P.M. (n = 20 – 23)

FIGURA 5 – Efeito do mentol (M) na reversão da amnésia induzida por escopolamina (E) no

teste da esquiva passiva. Os dados são apresentados como média do tempo de latência ±

E.P.M. (n = 20 – 23)

***: p < 0,001; TS M 0,2 e 20 µM vs TS E 200 µM

* *: p < 0,01; TS M 0,02 e 2 µM vs TS E 200 µM

Teste de Kruskal – Wallis

63

Figura 1

64

Figura 2

T 1 T 2 T 3T S

0

100

200

300

Controle veículo

Latê

ncia

(s)

T 1

T 2 T 3T S

0

100

200

300

Neostigmina 20 M

Latê

ncia

(s)

T 1 T 2 T 3T S

0

100

200

300

* *

* * *

Escopolamina 200 M

Latê

ncia

(s)

(A)

(B)

(C)

65

Figura 3

T 1 T 2 T 3

0

100

200

300

(A)

Mentol 0,02 M

Latê

ncia

(s)

*

T 1 T 2 T 3

0

100

200

300

(B)

Mentol 0,2 M

Latê

ncia

(s)

T 1 T 2 T 3

0

100

200

300

(C)

Mentol 2 M

Latê

ncia

(s)

T 1 T 2 T 3

0

100

200

300

(D)

Mentol 20 M

Latê

ncia

(s)

66

Figura 4

00,

02 0,2 2 20

0

100

200

300

Mentol (M)

Latê

ncia

(s)

67

Figura 5

M

E 2

00 0,

02 0,2 2 20

0

100

200

300

* *

* * *

* * * * *

Mentol (M)

Latê

ncia

(s)

68

CONCLUSÃO

Os resultados expostos no primeiro artigo indicaram que os PE, bem como seus compostos

isolados, possuem atividade anticolinésterásica, sendo o triptofol o composto mais

promissor, uma vez que possui ação dual sobre as enzimas apresentando-se seletivo

BuChE, o que o qualifica como protótipo para o desenvolvimento de novos fármacos

anticolinesterásicos.

De acordo como os dados do segundo artigo, pode-se concluir que o mentol

administrado puro não modifica a aprendizagem nem a consolidação da memória. Por outro

lado, reverte a amnésia induzida por escopolamina.

Outros estudos devem ainda ser realizados, com a finalidade de investigar o

mecanismo de reversão da amnésia pelo mentol em cérebro de zebrafish, sabe-se que o

mentol possui atividade inibitória da colinesterase, no entanto é necessário estudos mais

profundos para conhecer sua ação no sistema nervoso central do peixe, justificando a

resposta da esquiva passiva.

69

MATERIAL SUPLEMENTAR

Figura 1: Espectro de RMN de 1H da substância 1 (CDCl3, 500 MHz).

Figura 2: Espectro de RMN de 13C da substância 1 (CDCl3, 126 MHz).

Figura 3: Mapa de contorno gCOSY da substância 1 (CDCl3, 500 MHz).

SpinWorks 2.5: H1 Observe

PPM (F2) 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 PPM (F1)

13.0

12.0

11.0

10.0

9.0

8.0

7.0

6.0

5.0

4.0

3.0

2.0

1.0

0.0

-1.0

file: C:\Documents and Settings\Windows\Desktop\RMN -lnls\p4hcosy.fid\fid expt: "gCOSY"

transmitter freq.: 499.732016 MHz

time domain size: 2048 by 256 points

width: 8000.00 Hz = 16.008580 ppm = 3.906250 Hz/pt

number of scans: 8

F2: freq. of 0 ppm: 499.729016 MHz

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shift: 0.0 degrees

F1: freq. of 0 ppm: 499.729016 MHz

processed size: 2048 complex points

window function: NONE

shift: 0.0 degrees

Figura 4: Mapa de contorno gHSQC da substância 1 (CDCl3, 126 MHz).

SpinWorks 2.5: 13C HSQC

PPM (F2) 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 PPM (F1)

130

120

110

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

file: C:\Documents and Settings\Windows\Desktop\RMN -lnls\p4hsqc.fid\fid expt: "gChsqc"

transmitter freq.: 499.731340 MHz

time domain size: 2048 by 256 points

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number of scans: 6

F2: freq. of 0 ppm: 499.729054 MHz

processed size: 2048 complex points

window function: NONE

shift: 90.0 degrees

F1: freq. of 0 ppm: 125.652820 MHz

processed size: 1024 complex points

window function: NONE

shift: 90.0 degrees

Figura 5: Mapa de contorno gHMBC da substância 1 (CDCl3, 126 MHz).

SpinWorks 2.5: H1 Observe

PPM (F2) 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 PPM (F1)

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

file: C:\Documents and Settings\Windows\Desktop\RMN -lnls\p4hmbc.fid\fid expt: "gHMBC"

transmitter freq.: 499.732016 MHz

time domain size: 2048 by 128 points

width: 7997.60 Hz = 16.003779 ppm = 3.905078 Hz/pt

number of scans: 16

F2: freq. of 0 ppm: 499.729018 MHz

processed size: 4096 complex points

window function: NONE

shift: 0.0 degrees

F1: freq. of 0 ppm: 125.656931 MHz

processed size: 2048 complex points

window function: NONE

shift: 0.0 degrees

Figura 6: Espectro de massa da substância 1.

Figura 7: Espectro de RMN de 1H da substância 2 (CDCl3, 500 MHz).

Figura 8: Espectro de RMN de 1H da substância 2 (CDCl3, 500 MHz).

Figura 9: Mapa de contorno gCOSY da substância 2 (CDCl3, 500 MHz).

SpinWorks 2.5: H1 Observe

PPM (F2) 7.6 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 PPM (F1)

11.0

10.0

9.0

8.0

7.0

6.0

5.0

4.0

3.0

2.0

1.0

file: C:\Documents and Settings\Windows\Desktop\RMN -lnls\p7hcosy.fid\fid expt: "gCOSY"

transmitter freq.: 499.732016 MHz

time domain size: 4096 by 128 points

width: 5996.55 Hz = 11.999535 ppm = 1.464002 Hz/pt

number of scans: 0

F2: freq. of 0 ppm: 499.729018 MHz

processed size: 2048 complex points

window function: NONE

shift: 0.0 degrees

F1: freq. of 0 ppm: 499.729018 MHz

processed size: 2048 complex points

window function: NONE

shift: 0.0 degrees

Figura 10: Mapa de contorno gHMBC da substância 2 (CDCl3, 126 MHz).

SpinWorks 2.5: Watergate TOCSY

PPM (F2) 8.0 7.6 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 PPM (F1)

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

file: C:\Documents and Settings\Windows\Desktop\RMN -lnls\p7hmbc.fid\fid expt: "gHMBC"

transmitter freq.: 499.732016 MHz

time domain size: 4096 by 256 points

width: 5996.55 Hz = 11.999535 ppm = 1.464002 Hz/pt

number of scans: 0

F2: freq. of 0 ppm: 499.729018 MHz

processed size: 4096 complex points

window function: NONE

shift: 0.0 degrees

F1: freq. of 0 ppm: 125.656931 MHz

processed size: 2048 complex points

window function: NONE

shift: 0.0 degrees

Figura 11: Espectro de massa da substância 2.

Figura 12: Espectro de RMN de 1H da substância 3 (DMSO-d6, 500 MHz).

Figura 13: Espectro de RMN de 13C da substância 3 (DMSO-d6, 126 MHz).

Figura 14: Mapa de contorno gHMBC da substância 3 (DMSO-d6, 126 MHz).

SpinWorks 2.5: H1 Observe

PPM (F2) 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 -0.0 PPM (F1)

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

file: C:\Documents and Settings\Windows\Desktop\RMN -lnls\pm7_hmbc_DMSO.fid\fid expt: "gHMBC"

transmitter freq.: 499.734390 MHz

time domain size: 2048 by 128 points

width: 7997.60 Hz = 16.003703 ppm = 3.905078 Hz/pt

number of scans: 8

F2: freq. of 0 ppm: 499.731391 MHz

processed size: 4096 complex points

window function: NONE

shift: 0.0 degrees

F1: freq. of 0 ppm: 125.657528 MHz

processed size: 2048 complex points

window function: NONE

shift: 0.0 degrees

Figura 15: Espectro de massa da substância 3.

Figura 16: Espectro de RMN de 1H da substância 4 (CDCl3, 500 MHz).

Figura 17: Espectro de RMN de 13C da substância 4 (CDCl3, 126 MHz).

SpinWorks 2.5: Std proton

PPM 135.0 125.0 115.0 105.0 95.0 85.0 75.0 65.0 55.0 45.0 35.0 25.0 15.0

136

.395

2

122

.147

2

121

.798

0

121

.789

0

121

.780

3

119

.080

6

119

.062

1

119

.052

9

118

.427

1

118

.418

1

115

.504

1

110

.866

1

110

.852

3

110

.843

8

76.

9914

76.

9837

76.

9654

76.

9571

76.

9521

76.

9430

76.

9323

76.

9079

76.

8809

76.

8745

76.

8667

76.

7180

76.

7058

76.

6980

76.

6904

76.

6829

76.

6743

76.

6525

76.

6290

76.

6107

76.

4348

76.

4220

76.

4146

76.

3964

76.

3753

76.

3692

76.

3579

76.

3500

62.

2356

62.

2259

62.

2186

44.

3945

30.

8440

28.

3510

28.

3409

20.

4543

18.

7643

18.

1404

file: C:\Documents and Settings\Windows\Desktop\RMN -lnls\pm4c.fid\fid block# 1 expt: "s2pul"

transmitter freq.: 125.670125 MHz

time domain size: 78430 points

width: 30154.54 Hz = 239.949964 ppm = 0.384477 Hz/pt

number of scans: 1000

freq. of 0 ppm: 125.657009 MHz

processed size: 131072 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

Figura

18: Espectro de massa da substância 4.