Determinação da concentração e da pureza do DNA por

espectroscopia UV e gel de agarose

GeneQuantDeterminação da concentração e da

pureza do DNA

Determinação da concentração

Nanodrop

104,5ng/l = 0,104g/ l

Determinação da concentração do DNA extraído por espectroscopia

• As amostras de DNA obtidas no laboratório devem ser avaliadas quanto à sua concentração e à sua pureza por meio da densidade óptica (DO) em espectrofotômetro.

• O DNA absorve luz no comprimento de onda de 260 nm e as proteínas, de 280 nm.

• Para leitura no espectrofotômetro as amostras de DNA são preparadas (diluídas) com água ultrapura: ex: 10 L de DNA em 490 l de água (diluição 1:50) ou 5 L de DNA em 495 l de água (diluição 1:100) ou de acordo com o volume necessário para leitura no equipamento.

Determinação da concentração do DNA extraído

• Para estimar a concentração de DNA, utiliza-se a seguinte relação: 1 DO 260nm = 50 g de DNA de dupla fita*.

• A concentração de DNA na amostra pode ser obtida pelo seguinte cálculo:

Concentração de DNA = leitura da DO260nm x 50 x fator de diluição (usado na leitura).

• *50 g/ml tem DO de 1 a 260 nm

• DNA fita simples: 37g

• RNA fita simples 40 g

Determinação da concentração do DNA extraído através de gel de agarose

• O DNA pode ser quantificado e analisado quanto à sua qualidade, por meio da análise em gel de agarose ( gel de agarose entre 0,8% e 1% )

• Com as amostras de DNA, é aplicada também uma amostra cuja concentração é conhecida.

• O DNA do bacteriófago Lambda () em concentrações conhecidas de 20, 50, 100 e 200 ng/mL é geralmente utilizado.

• Após a eletroforese, o gel é corado com brometo de etídio, visualizado em luz ultravioleta.

• As amostras são comparadas aos padrões, determinando-se dessa maneira as concentrações aproximadas de DNA em cada amostra.

Extração de DNA observado em gel de agarose 1%

Amostras de DNA extraídas de swab oral utilizando NaCl (colunas 1–11) oukit comercial (12–17) em gel de agarose 1%. Observar presença de maior concentração de

massa em torno de 12.000pb em ambos os métodos.

Gel de agarose 1% com 3 l de DNA genômico

M 1 2 3

M - Marcador

1, 2 e 3 - amostras de DNA genômico

Estimativa do grau de pureza

• A relação entre a quantidade de DNA e de proteína é usada como parâmetro para avaliação da qualidade do DNA extraído grau de pureza =

• OD 260nm /OD280nm Razão = 1,7 – 2,0 • Amostras cujos valores são acima de 2,0

muito RNA; • Amostras cujos valores são abaixo de 1,8

contaminação com proteína • O DNA pode ser quantificado e analisado

quanto à sua qualidade, por meio da análise em gel de agarose: entre 0,8% e 1% .