昭和55年10月20日 529

原 著

Co-agglutination Testに よ る リ ン 菌 の 同 定

神奈川県衛生研究所細菌病理部

小原 寧 山井 志 朗 下 田 祐 子

新 川 隆康 宮本 泰

町田市民病院

富 田 清 一

(昭和55年6月6日 受付)

(昭和55年7月22日 受理)

Key wards: Neisseria gonorrhoeae, serological identification, co-agglutination test.

は じめ に

一 般 に ナイ セ リア,と くに リ ン菌 は 生 物 活 性 が

弱 い た めに,し ば しぼ 通 常 の炭 水 化 物分 解試 験 や

そ の他 の生 化 学 的 性 状 検 査 では 同 定 困 難 な こ とが

あ る.し か も,こ れ ま で は リ ン菌お よび 髄 膜 炎 菌

の蛍 光 抗 体 法 と,髄 膜 炎 菌 の凝 集 反 応 に よる群 別

を 除 い て は,一 般 に用 い うる ナ イ セ リア の血 清 学

的 同定 法 は な かつ た.そ の理 由 は,ナ イ セ リアそ

の もの が 本 来 自己 凝 集 を お こ しや す い菌 で あつ

て,こ の こ とが本 菌 属 の血 清 凝 集 反 応 を 困 難 に し

て い るた め で あ る.

最 近,Danielson & Kronvall 1)は,迅 速 な リン菌

の ス ライ ド凝 集反 応 と して,co-agglutimation test

を 開 発 した.こ れ は,は じめKronvall 2)に よつ て

肺 炎 双球 菌 の型 別 に用 い られ,そ の後Christensen

ら 3)に よつ て レ ンサ球 菌 の群 別 に用 い ら れ た方 法

を リン菌 の同 定 に 応 用 した もの で あ る.そ の原 理

は,黄 色 ブ ドウ球 菌 が 産 生 す るprotein Aと,

IgGのFc部 分 が 非 免 疫 反 応 に よつ て 特 異 的 に

結 合 す る性 質 を利 用 した もの で あ る.従 つ て,ブ

ドウ球 菌 に 吸 着 し た 特 異 抗 体IgG分 子 の抗 原 反

応 基Fab部 分 は フ リーな 状 態 に あ り,対 応 す

る抗 原 菌 と出 会 うと,両 者 が 結 合 し て 共 同凝 集

(co-agglutination.以 下COA)反 応 が お こ り,

この 際,菌 の もつ 自己 凝 集 性 は 本反 応 に あ ま り影

響 しないといわれる.

わたしたちは,最 近既製のリン菌用COA試 験

試薬を入手する機会をえ,保 存中あるいは新 しく

分離した Neisseria gonorrhoeae と, Neisseria menin-

gitidis, Neisseria subflava, Neisseria mucosa, Neiss-eria flavescens, Neisseria lactamica4)5), Branhamella

catarrhalis および Haemophilus influenzae の分離保

存株を用いて,集 落直接法および煮沸集落浮遊液

法によるCOA試 験を行い,そ の成績を比較 した

ので報告する.

材料および方法

使用歯株

N. gonorrhoeae 既知株 として は, Statens Seru-

minstitut (Copenhagen) のA.Reyn博 士 か ら分

与を受けた.WHOの ペニシリン感受性標準株

III,V,VIIの3株 と, University of Texas, South

Western Medical School (Dallas) op R.A. Fink-

elstein教 授 か ら分 与 を受 けた.F62T2と 同T4お

よびBowden T2と 同T4の4株,計7株 を 用 い

た.ま た分 離 株 は,昭 和52年 か ら同53年 ま でに分

離 し保存 中 の73株 と,54年 中 に新 し く分 離 した40

株 を,そ れ ぞ れ保 存 株 お よび新 鮮 株 と して使 用 し

た. N. meningitidis 既知株としては, Czechoslov-

ak National Collection of Type Culture (Prague)

のJ.Sourek博 士 か ら分 与 を受 け た,髄 膜 炎 菌 群

530 感 染症学雑 誌 第54巻 第10号

別 用Neotype strain3/59(A群),5/59(B群),

8/59(C群),11/59(D群)お よび18/68(X群),

19/68Y群),20/68(Z群)の7株 を,ま た 分 離

株 と して は 当所 保存 の健 康 者 咽 頭 由来30株,患 者

髄 液 由来4株,膣 由来1株 の 合 計35株 を 使 用 し

た.分 離 株 の血 清 群 は,B群24株,Y群4株 お よ

び群 別 不 能7株 で あ る.非 病 原 性 ナ イ セ リア と し

て,N.Lactamicaは 咽 頭 由来7株 を,N.mucosaは

患 者 由来1株 と咽 頭 由来2株 の計3株 を,N.sub-

flavaは 咽 頭 由 来4株 を,N.flavescensは 咽頭 由来

5株 を使 用 した.こ の ほか,ナ イ セ リア以 外 の菌

と してB.catarrkalisは 咽 頭 由来4株 と泌尿 生 殖

器 由来2株 の計6株 を,H.influenzaeは 髄 液 由来

の2株 を 用 い た.こ れ らの菌 株 は,新 鮮分 離 株 を

除 きす べ て ゼ ラチ ン ・デ ィス ク法6)で 保存 した 。

使 用 培 地

リン菌,髄 膜 炎 菌 お よびN.lactamicaの 分 離 培 地

と して は,Thayer-Martin培 地7)ま た はTransgrow

培 地8)を,そ の他 の非 病 原 性 ナ イ セ リア の分 離 培

地 と し て はGCチ ョ コ レー ト ・カ ンテ ン培 地 を

用 い た.リ ン菌 の集 落 型 確 認 用,リ ン菌 とそ の他

の ナ イ セ リア お よびBarnkamellaのCOA用 前 培

養 に はKelloggら9)のGCB-2DS培 地 を,ま た

HaemopkilusのCOA用 前 培 養 に は5% Fildes

液(Difco)加 トリプ チ ケ ー ス ・ソイ ・ カ ンテ ン

培 地(BBL)を 用 い た.培 養 は,い ず れ も35℃ で

18～20時 間 ロ ー ソ ク法 で行 い,室 温 放 置5時 間 以

内 に使 用 した.な お,リ ン菌 の集 落 型 はKellogg

ら9)の定 義 に従 つ て判 定 した.!

ナ イ セ リア の分 離 お よ び 同定

選 択 培 地 ま た はGCチ ョコ レー ト培 地上 の 疑

わ しい集 落 の うち,オ キ シ ダ ー ゼ反 応 陽 性 で グ ラ

ム陰 性 の球 菌 を,Catlin 10)に 従 つ て 同 定 した.炭

水 化 物 分 解 試 験 は,糖 を1%に 加 えたCTA培 地

(BBL)を 用 いて,Shitibel & Toma 11)に 従 つ て

実 施 した.

COA試 薬 お よびCOA試 験

COA試 薬 は, Pharmacia Diagnostic AB (Sw-

eden)のPhadebact(R) Gonococcus Test試 薬(Lot,

No.0756)を 使 用 し た.本 試 薬 は リ ン菌 試 薬(Gono-

coccus reagent)と,対 照 試 薬(Control reagent)

お よび洗 滌 と試 薬 調 製 用 の緩 衝 剤 粉 末 か らなつ て

お り,使 用 説 明書 に従 つ て 調 製 した.

COA反 応 は, Direct colonies method (以下直

接法)ま たは Boild colonies suspension method

(以下加熱法)で 行つた.す なわち,清 浄なスラ

イ ド・ガラスに,ガ ラス鉛筆で適当に間隔をあけ

て円を二つ書き,そ れぞれに リン菌試薬 と対照試

薬を1滴 ずつ置 く.直 接法は,培 地上の集落を細

菌用ループで約1cmず つかき取 り,そ れ ぞれの

試薬 とよく混合して均等な菌液 とし,約2分 間,

数秒毎にスライ ド・ガラスを前後に傾けながら,

黒色背景に対 して人工光線を透過 させ て 観察 し

た.加 熱法は,集 落を0.2mlの 精製水に加え て

よく混和 し,Mc Faland No.4ま たはNo.5に 相

当する濁度の菌液を作つた.ゆ るく栓を して沸騰

水浴中で5分 間加熱 し,冷 後試薬と同量の菌液を

それぞれの試薬と混合して,直 接法 と同様に反応

を行つて観察した.判 定は,リ ン菌試薬のみが凝

集するか,ま たは対照試薬に比べて リン菌試薬の

凝集が著明に強いものを陽性,両 試薬 とも凝集が

認められないものを陰性,両 試 薬に同程度の凝集

が認められるものを判定不能 とした.な お,直 接

法で判定不能の場合はMenck 12)に従っ て トリプ

シン処理を行い,陰 性の場合はスライ ド・ガラス

をガスバーナーの火焔上で軽 く加温 してもう一度

観察 した.

実験成績

1.保 存菌株の直接法COA試 験

WHOペ ニシリン感受性標準株3株 お よび当

所で分離,保 存中の61株 の合計64株 の リン菌 と,

42株 の髄膜炎菌を含む69株 の リン菌以外の菌株に

ついて,直 接法COA試 験を行つた.こ の うち

リン菌は,保 存ディスクから増殖用培地に発育 さ

せたのち,集 落選択を行つてできるだけT1集 落

を選んで反応に用いたが,T1集 落のえられ なか

つた菌株はそれぞれ主体 となる集落型をそのまま

用いた.

結果 はTable 1の ようで,リ ン菌64株 中54株

(84.4%)が 陽性,4株(6.3%)が 陰性,6株

昭和55年10月20日531

Table 1 Results of testing N. gonorrhoeae and other related organisms by direct co-agglution test.

Figures in parentheses indicate percentage of results.

(9.4%)が 判 定 不 能 で あ つ た.リ ン菌 以 外 の 菌

で 陽 性 と判 定 され た もの は な か つ た が,表 に示 し

た よ うにH.influenzaeを 除 い て判 定 不 能 が高 率 に

認 め られ た.リ ン菌 で 本法 陰 性 で あ つ た もの は総

べ てT4集 落 の み か らな る菌 株 で,ま た判 定 不 能

で あつ た も のはT2集 落 主 体 の菌 株 で あ つ た.

2.リ ン歯 の集 落 型 別 直 接 法COA試 験

F62T2, T4株 とBowden T2, T4株 お よびT2集

落 主 体 の分 離 株6株 とそ れ に 由来 す るT4株6株

の計16株 につ い て,リ ン菌 の集 落 別 反 応 性 を しら

べ た.結 果 はTable 2の よ うで,既 知 株 お よび分

離 株 の別 に 関係 な く,T2株 で は2株(25%)が

判 定 不 能,T4株 で は5株(62.5%)が 陰 性 で あ

つ た.実 験1と2を 合 計 す る と,直 接 法 で は,リ

ン菌80株 中63株(78.8%)が 陽 性,9株(11.3

%)が 陰 性,8株(10%)判 定 不 能 で あつ た が,

この成 績 はTable 4のD欄 に示 した.

Table 2 Marked difference in percent results

between colonial types of N. gonorrhoeae by

direct co-agglutination test.

Figures in parentheses indicate percentage of

results.

3.加 熱 法 用 抗 原 の濃 度 とそ の 保 存 性

1979年8月 改 定 のPhadebact (R) Gonocccus Test

使 用 説 明書 で は,そ れ 以 前 は 血 清 含 有培 地 発 育菌

につ い て の み行 う よ うに 指 示 され て い た 加 熱法 が

推 奨 され て い る.し か し,抗 原 液 の濃 度 に つ い て

は,単 に十 分 量 の集 落 を か き取 つ て0.2mlの 精 製

水 と混 和 し濃 厚 な菌 液 を作 る,と の み記 載 さ れ て

Table 3 Stability of antigen by boiled colonies method when stored at 5 •Ž

Antigens are heated in boiling water bath for 5 minutes.a) Strain No.b) Graduatiou of reactionc) Non-interpretable reaction

532感 染症学 雑誌 第54巻 第10号

Tanle 4 Comparative results of COA test of N. gonorrhoeae and other related

organisms between direct and boiled colonies method .

a) Direct colonies methodb) Boiled colonies method

い る.そ こで,新 鮮 分 離 の同 一 菌 株 由来T2集 落

優 位 菌 と,T4集 落 の み の菌 を用 い て,抗 原濃 度 の

違 いに よる反 応 の差 を しらべ た.す なわ ち,1ml

の精 製 水1本 ず つ に そ れ ぞ れ の菌 を 大量 に 混和 し

て 濃 厚 菌 液 を 作 り,精 製 水 で10-5ま で10倍 連 続 希

釈 した.全 部 の菌 液 を 同 時 に 沸騰 水 浴 中 で5分 間

加 熱 し,直 ち に 流 水 で冷 却 して抗 原 と した.こ の

原 液 の 菌 量 は,両 菌 株 と も1010/m1で あつ た.各

抗 原 液 に つ い てCOA試 験 を行 つ た と ころ,T2

株 の 原液 は 加 熱 に よつ て ゲル状 を呈 し,ま た原 液

お よび10-1希 釈 液 と試 薬 を 混 合す る と,両 試 薬

に繊 維 状 の凝 集 塊 が生 じて判 定 が 困難 で あつ た .

ま た,10-4希 釈 抗 原 で は 凝 集 が 著 し く弱 く,さ

らに10輔5希 釈 で は か え つ て 両試 薬 と も中 等度 の

凝 集 が み られ る よ うに な り,判 定 不 能 と なつ た .

しか し1042と10-3希 釈 抗 原 で は,リ ン菌試 薬 の

み に はつ き り した 凝 集 が 認 め られ,明 か に 陽 性 と

判 定 さ れ た.ま たT4株 も,10-2お よび10-3希

釈 抗 原 で リ ン菌試 薬 のみ に,T2株 よ りも弱 い が,

は つ き り した 凝 集 が 認 め られ た.菌 量 は,T2株

お よ びT4株 と も10胴2希 釈 液 が108/m1で,Mc

Faland No.4～No.5相 当 の濁 度 で あ つ た .な お,

同 時 に行 つ た 直 接 法 で は,T2株 が 判 定 不 能,T4

株 が 陰 性 で あ つ た.さ ら に,1042希 釈 加 熱 抗 原

の3,000rpm 15分 遠 沈 上 清 でCOA試 験 を行 つ た

と ころ,両 菌 株 と も陽 性 反 応 を 呈 した こ とか ら,

Table 5 Comparative results of testing 120

strains of N. gonorrhoeae between COA test

and carbohydrate degradation test.

Figures in parentheses indicate percentage of

results

本 抗 原 は遠 沈 上 清 に も存 在 す る こ とが 明 らか に な

つ た.

また,抗 原 の安 定 性 を み る た め に,リ ン菌 の

T2集 落 主 体 菌3株 ,T4集 落 菌1株,髄 膜炎 菌2

株 お よびB.catarrhali 51株 の,Mc Faland No.

4相 当 濁 度 の菌 液 で 加 熱 抗 原 を 作 り,5℃ の 氷 室

に保 存 して 経 時 的 に 同 一 ロ ッ トの試 薬 で反 応 を し

らべ た とこ ろ,そ の結 果 はTable3の とお りで あ

つ た.す なわ ち,抗 原 調 製 直 後 のCOA反 応 は リ

ン菌 では す べ て 陽 性,髄 膜 炎 菌 は2株 と も陰 性 ,

B.catarrhalisは 判 定 不 能 で あ つ た が,5ヶ 月 保

存 後 の検 査 で もす べ て の 菌 種 お よび 菌株 が,ま つ

た く調 製 当 初 と等 しい反 応 を 呈 し,加 熱 抗 原 は5

℃ で数 ケ月 間 安 定 に 保 存 可 能 な こ とが わ か つ た.

4.直 接 法 お よ び加 熱 法CAO試 験 成 績 の 比 較

Table1お よびTable2に 示 した全 菌 株 に つ い

昭和55年10月20日533

て,加 熱法COA試 験を行つて直接法の成績と比

較 した.Table4のB欄 に示す ように,加 熱法で

は80株 の リン菌すべてが陽性反応を示 し,陰 性お

よび判定不能のものはなかつた.一 方,リ ン菌以

外の菌では,直 接法と同様に陽性反応を呈 したも

のはな く,さ らにN.mucosaを 除いて判定不能が

著明に減少 した.こ のほか,昭 和54年 に分離 した

新鮮分離 リン菌40株 に つ い て,そ のつど加熱法

COA試 験を行つた ところ,全 株陽性で あつた.

5.リ ン菌の加熱法COA試 験と糖分解試験の

成績の比較

ナイセ リア同定のための生化学的試験 として糖

分解パターンが重要視されているが,リ ン菌には

ブ ドウ糖非分解のものが通常数%認 められるとい

われる.そ こで,120株 の リン菌について,加 熱

法COA試 験と糖分解試験の成績を比較 しTable

5に 示 した.加 熱法COA試 験では,上 述のよう

にすべての菌株が陽性であつたが,糖 分解試験で

は2株(1.7%)が ブ ドウ糖お よび しらべ たすべ

ての糖を 分解 しなかつた.こ の2株 は,い ずれ

も男性の急性尿道炎分泌物 から分離 されたもの

である.オ キシダーゼ反応陽性のグラム陰性球菌

で糖非分解の菌は,と くにN.flavescensお よび

B.catarrhalisと の鑑別が 重要であるが,2株 と

も5%白 糖加培地に発育せず,亜 硝酸塩非還元性

なのでN.flavescensは 否定され,ま た22℃ でふつ

う寒天培地に発育せず,硝 酸塩を還元しないこと

で.B.catarralisと も区別され,リ ン菌であるこ

とが生化学的に同定された.こ の結果,120株 の

リン歯 こついてのCOA試 験陽性率は100%,糖

分解試験陽性率は98.3%で あつた.

考 察

リン菌感染症は,諸 外国では生殖可能年齢層に

おける最もひん度の高い細菌性疾患 ともいわれ,

また最近,こ れまで治療の主流となつていたペニ

シリンに対する耐性菌が出現 し13)14),その正確な

同定は治療上も疫学上 も重要性を増 してきた.そ

のうえ,分離培地の改良に よつて,これまで困難で

あつた咽頭や直腸などからも高頻度に本菌が分離

されるようになつたが,同 時にこれらの部位に炎

症起因菌または常在菌 として存在する髄膜炎菌,

およびいわゆる非病原性ナイセ リアとの鑑別が慎

重に行われなければならな くなつた.し かし,リ

ン菌を含むナイセリア分類の重要な指標である糖

分解試験は,複 雑な基礎培地,正 確な手技お よび

多大の労力を必要 としながら,必 しも常に正常パ

ターンを示すとは限 らない.わ た したちの経験で

も,ブ ドウ糖非分解性 リン菌は1～2%の 割合に

認められた.ま た,髄 膜炎菌は,通 常健康保菌者

の咽頭に存在するほか,最 近は リン菌 と同様に泌

尿生殖器や直腸から分離 される例が増加 し15),両

者の確実な鑑別が必要である.し かし,髄 膜炎菌

のなかには,'マ ル トース分解能を欠 くものがある

といわれ,こ の場合その糖分解パターンは リン菌

のそれと一致する.こ の両菌を糖分解能以外で区

別することは非常に困難で,蛍 光抗体法以外では

オ レイン酸カソテン培地上での発育試験16)がある

が,両 法とも我国ではほとんど行われていないも

のと思われる.さ らに,一 般に多 くの病原細菌で

は,生 化学的方法 と同時に血清学的同定が行われ

る.リ ン菌の血清学的同定法 として蛍光抗体法が

あるが,高 価な顕微鏡 と熟練 した技術者を必要と

し,ま た試薬の入手 も困難である.そ のうえ・本

法はある程度の髄膜炎菌 との交差反応が避けられ

ず,特 に咽頭分離菌の同定は生化学的性状検査が

必要 といわれる.

こうい つ た ことから,簡 単で しかも確実な リ

ン菌同定のための血清反応の出現が 望ま れ て い

た が,1974年 にDanielson&kronvall1)は,co4

agglUtinationと 呼ばれるリン菌のスライ ド凝集反

応を発表 した.今 回,こ の方法を利用 した リン菌

同定試薬Phadebact(R)Gonococcus test試 薬を入

手する機会をえたので,そ の実用性を検討した.

本法に用いる菌は血清含有培地で前培養すると,

血清中のグロブリソが対照試薬のブ ドウ球菌プロ

テインAと 反応 して偽陽性反応を示す12)すことか

ら,血 清不含の一定な培地を用いるように規定 さ

れている.当 所では リソ菌増殖用に,Kelloggら

のGCB-2DS培 地を用いているので,前 培養はす

べてこの培地で行つたが,粉 末入モグロビン1%

534 感 染症学 雑誌 第54巻 第10号

お よびイース ト・エキス0.3%を 加えたGCチ ョ

コレー ト・カンテン培地でも,も ちろん充分使用

に耐える.

諸外国の中には,疑 わ しい集落についてオキシ

ダーゼ反応とグラム染色を行つたのち,蛍 光抗体

法で リン菌を同定 しているところがあるが,COA

試験はこの蛍光抗体法に代わる簡易な同定法 とし

て,多 くの臨床検査室で利用 されはじめているよ

うである.分 離培地上の少数集落そのものを用い

て数分間で結果が判定できる本法の迅速性は,リ

ン菌感染症診断の うえで実用性が高いが,今 回の

直接法の成績では,判 定不能がT2集 落菌でかな

り高率に認められた.こ れは,リ ン菌の凝集性が

その集落型によつて異なり,と くにT2集 落型は

自然凝集性が強いとい う特性17)と関係があるもの

と思われる.Menck12)の 成績とは異つて,ト リプ

シン処理後にもかな りの判定不能株が認められた

が,こ れらの菌株 も加熱法ではすべて陽性反応を

示 した.一 方,T4集 落型菌は直接法では,陰 性

反応のものがあつたが,リ ン菌は不注意に継代培

養すると数代で全集落がT4に なるとい わ れ9),

従つてCOA試 験は新鮮分離株について行 うよう

指示されている.し かし,直 接法では陰性であつ

たT4集 落型菌も,加 報法ではすべて陽性 となつ

た.こ ういつたことから,加 熱法COA試 験は集

落型や保存期間に関係なく,リ ン菌の同定検査に

用いうることが明らかになつた.

加熱法COA試 験 は,分 離培地上に 集落が多

数発育 した場合はそのまま行えるが,集 落数が少

ないときは純培養操作によつて菌数を増やさなけ

ればならない.こ のために,判 定は直接法 より1

日遅れるが,そ れでも糖分解その他の生化学的試

験に比較す ると迅速に同定できる.そ の うえ,加

熱抗原は氷室保存で5ケ 月以上にわたつて反応性

に変化が認められないことが明らかになつた.リン菌の保存はかなり困難なので,加 熱抗原が長期

間保存できるとい うことは,生 きた菌の代わ りに

COA用 加熱抗原を保存 しても,後 でリン菌の同

定を行い うる可能性を示すものと思われる.

さらに,現在使用されている試薬は,リ ン菌の全

菌 体 で免 疫 した ウサ ギ 抗 血 清 を 用 い て い るが1),

加 熱 菌 液 の上 清 に 本 凝 集反 応 に 関与 す る耐 熱 性 抗

原 の存 在 が 明 らか に な つ た の で,よ り精 製 され た

抗 原 に よ る抗 血 清 の作 製,お よび ナ イ セ リア に特

有 な 自己凝 集 に よつ て 阻害 され な い.新 しい血 清

凝 集反 応 開発 の 可 能性 が生 じた.

リン菌以 外 の供 試 菌 株 で は,判 定 不 能 が か な り

あ つ た が,陽 性 反 応 を呈 した も の は な く,ま た リ

ン菌 は ブ ドウ糖 非 分 解 株 を含 む120株 す べ て が 陽

性 で あつ た の で,本 反 応 は 鋭 敏 度,特 異 度 と もに

優 れ て い る こ とが 確 か め られ た.最 近,Hampton

ら18)は80～100℃20分 加 熱 抗 原 に よる 実 験 で,78

株 の非 リ ン菌 株 中 判 定 不 能 はN.siccaに1株 認 め

られ た の み で あ つ た が,NsubflavaとMoraxella

sp.の1株 ず つ計2株 が 疑 陽 性 を呈 した と報 告 し

た.わ た した ち の成 績 との差 が,抗 原 の加 熱 法 の

差 に よる ものか ど うか よ くわ か らな いが,今 回 実

験 に用 いた 菌 種 お よび菌 株 数 は限 られ て お り,ま

た 試 薬 も単 一 ロ ッ トのみ を使 用 した ので,さ らに

実 験 を 重 ね る必 要 が認 め られ る.ま た,本 試 薬 は

1瓶20検 体分 が2本,計40検 体分 の 包装 に な つ て

お り,そ の 有効 期 限 は乾 燥 状 態 で1年,浮 遊 液 で

1ケ 月 と短 い.我 国 の現 状 で は,1ケ 月以 内 に20

検 体 の リン菌 同定 検 査 を行 う施 設 は少 な い と思 わ

れ る の で,ロ スが 多 く高 価 な検 査 と な る恐 れ が あ

り,こ れ を 解 決 す るに は 専 門 機 関 に 常 備 す る よ う

な何 らか の手 段 を 講 じる必 要 が あ る.

ま と め

リン菌 の 血 清学 的 同定 用 ス ライ ド凝 集 反 応 試 薬

Phadebact(R)Gonococcus Test(PharmaciaDiagno-

stics AB,Sweden)を 用 い て ,リ ン菌120株,髄 膜

炎 菌42株,そ の他 のナ イ セ リア19株,Branhamella

catarrhalis 6株 お よびHaemophilus influenzae2株

のCOA試 験 を行 つ た .

血 清 不 含 有 培 地 に 発 育 した 少 量 の集落 を ,ト リ

プ シ ン処 理 して そ の ま ま試 薬 と混 合 す るMenck

の 直接 法 で は,80株 の リ ン菌中10%が 判 定 不 能

で,そ れ らの菌 株 はす べ てT2集 落 優 位 株 で あつ

た.ま た本 法 で 陰 性 の リ ン菌 は11%で ,す べ て

T4集 落 のみ の菌 株 で あつ た .

昭和55年10月20日535

一 方 ,試 薬 使 用 説 明書 に 記 され た 新 しい 術 式 で

あ る100℃ で5分 間 加 熱 した 抗 原 を 用 い る加 熱 法

で は,し らべ た120株 の リ ン菌 の す べ て が 陽 性 反

応 を呈 し,判 定 不 能 お よび 陰性 の株 は な か つ た.

69株 の リン菌 以 外 の菌 で,直 接法 お よび 加熱 法 と

も陽 性 を 呈 した も の は な く,ま た 加 熱 法 の方 が直

接 法 よ り判 定 不 能 が 減 少 し,陰 性 が 増 加 した.

COA試 験 とCTA培 地 を 用 い た 糖分 解試 験 に

よ る同定 成 績 とを,120株 の リ ン菌 に つ い て比 較

した.COA試 験 で は す べ て の菌 株 が陽 性 で あ つ

た が,糖 分 解 試 験 で は2株(1,7%)が ブ ドウ糖 を

分 解 しなか つ た.ま たCOA試 験 で は,新 鮮分 離

菌 ば か りで な く実 験 室 保 存 株 も,T4集 落 のみ か ら

な る菌 株 で や や弱 い反 応 を示 す もの もあつ た が,

す べ て陽 性 で あ つ た.

加 熱 法 抗 原 の濁 度 は,Mc Faland No.4～No.5

相 当 が 適 当 で,加 熱 抗 原 の反 応 性 は5℃ に 保存 す

る と5ケ 月以 上 安 定 で あつ た.ま た,加 熱 抗 原 の

遠 沈 上 清 に もCOA活 性 が認 め られ た.

以 上 の結 果,ご く一部 の生 物 学 的 同定 法 を必 要

とす る判 定 不 能非 リン菌 株 を 除 い て,選 択 培 地 上

の オ キ シ ダ ー ゼ反 応 陽 性,グ ラ ム染 色 陰 性球 菌 の

初 代 分 離 集 落,ま た は そ の非 選 択 培 地 純 培 養 菌

は,本 法 の み で簡 単,迅 速 に リン菌 と同定 し うる

こ とが確 か め られ た.本 試 験 法 は,試 薬 の価 格 と

そ の供 給 の面 で 問 題 は あ るが,小 実 験 室 で も利 用

で き る,便 利 で 実 用 的 な 血 清 学 的 リン菌 同 定 法 と

思 わ れ る.

(謝辞 稿 を終 るにあた り,本 実験 に 用 いた 貴重 な

菌株を 分与 していただいたStatens Seruminstitut (Co-

penhagen)のA.Reyn博 士,University of Texas (Dal-

las)のR.A. Finkelstein教 授, Czechoslovak National

Collection of Type Culture(Pragne)のJ.Sourek博

士,お よび安部医院(横 浜),鈴 木医院(横 須賀)・横浜

市民病院,県 立厚 木病院,横 須賀市衛生試験所・東海大

学 医学部附 属病 院,都 立台東病 院,東 京都 防疫課 分室・

国立岡山病 院,中 央労災病院(名 古屋)・ 立川病院 ・ 那

覇中央保健所,東 京都衛生研究所 の 諸先生 に心 から感

謝 します.ま た,COA試 薬 を分与 して載 いた 塩野義製

薬株式会社 の御 好意 に感謝 します.

文 献

1) Danielsson, D. and Kronvall, G.: Slide ag-

glutination method for the serological iden-tification of Neisseria gonorrhoeae with anti-

gonococcal antibodies adsorbed to protein A-containing streptococci. Appl. Microbiol.,27: 368-374, 1974.

2) Kronvall, G.: A rapid slide-agglutinationmethod for typing pneumococci by means ofspecific antibody adsorbed to protein A-con-taining streptococci. J. Med. Microbiol., 6:187-190, 1973.

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昭和55年10月20日537

Identification of Neisseria Gonorrhoeae by Co-agglutination Test

Yasushi OBARA, Shiro YAMAI, Yuko SHIMODA, Takayasu NIKKAWA and

Yasushi MIYAMOTO

Department of Bacteriology and Pathology, Kanagawa Prefectural Public Health Laboratory

Seiichi TOMITA

Medical Laboratory, Machida Shimin Hospital

A slide co-agglutination test was perfomrd, using a serological identification reagent "Phadebact(R)

Gonococcus Test" (Pharmacia Diagnostic AB: Sweden) with 120 strains of Neisseria gonorrhoeae, 42 strains

of N. meningitidis, 19 strains of other Neisseria species, 6 strains of Branhamella catarrhalis and 2 strains of

Haemophilus influenzae.

The Menck's direct colonies method, by which a few trypsin treated colonies of organisms grown on

serum-free medium were mixed directly with the reagent, produced 10% of non-interpretable results

among 80 strains of N. gonorrhoeae . All of the non-interpretable were predominated with T2 colony.

In addition 11% of N. gonorrhoeae produced negative results by this method, and all the neagative strains

were constituted of T4 colony only.

On the other hand, a new procedure of boiling colonies method, described by the manufacturer, by

which the organisms suspended in distilled water were heated at 100•Ž for 5 min prior to testing, produced

positive results in all strains of N. gonorrhoeae examined. No positive results were obtained with 69 sti ains

of non-gonococcal isolate by either method. However the number of non-interpretable was reduced

and that of negative was increased by boiling colonies method.

Using 120 strains of N. gonorrhoeae a comparison was made between co-agglutination (COA) test

and conventional biological identification test by the Cystine Trypticase Agar (CTA) sugar degradation

procedure. All strains of N. gonorrhoeae produced positive results by the COA test, while 2 strains (1.7%

did not degrade glucose by the CTA procedure.

The fresh clinical isolates as well as stock strains of N. gonorrhoeae produced positive results by the

COA test, excepting for some few strains constituting of T4 colony only which produced somewhat weak

postitive reaction.

The turbidity of antigen for boiling colonies method that is, Mc Faland No. 4 or No. 5 was appropriate,

and the reactivity of heated antigen was stable for over a period of five months when stored at 5•Ž. More-

over, supernatant of the heated antigen also showed COA activity.

Using the colonies of oxidase positive and Gram-negative cocci primarily isolated on selective medi-

um, or colonies transferred on non-selective media, a rapid identification by COA test alon was pos-

sible, except for a few non-gonococcal colonies with non-interpretable results which needed biological

identification.

Though there are some problem with respect to price and supply route for the reagent, the COA

test is considered to be a very convenient, practical and accurate serological identification method for

N. gonorrhoeae even for small bacteriological laboratories.