「抗HLA抗体のモニタリング」 PRA 139 (+10%) 125 日本臨床腎移植学会第6回集中セミナー「抗HLA抗体のモニタリング」 2014年3月14日 2014/3/4 13

1

第6回認定医集中教育セミナー

「抗HLA抗体のモニタリング」

広島大学大学院医歯薬保健学研究院応用生命科学部門消化器・移植外科学

大段秀樹

Anti-HLA Abs9 非自己HLA抗原の移入により産生

輸血、妊娠、移植歴など、

9 抗体関連型拒絶反応のハイリスク群

9 グラフト廃絶の主要な原因

日本臨床腎移植学会　第6回集中セミナー 2014年3月14日「抗HLA抗体のモニタリング」

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Cell-Based Assays•Complement-dependent cytotoxicity (CDC)

Methods for HLA-specific Ab screening and donor cross-matching testing

•Complement-dependent cytotoxicity (CDC)

=Lymphocyte cytotoxicity test (LCT)

→Anti-human immunoblobulin-LCT (AHG-LCT)

•Flow cytometry crossmatch (FCXM)

Solid-Phase ImmunoassaysSolid Phase Immunoassays•Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

•Bead-based array assays

(Flow cytometry or Luminex)

Complement-dependent cytotoxicity (CDC)=Lymphocyte cytotoxicity test (LCT)

日本臨床腎移植学会　第6回集中セミナー 2014年3月14日「抗HLA抗体のモニタリング」

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Kidneys transplanted across a positive crossmatch failed immediately.

Higher risk: multiparous females

patients reciving secondary transplants

Immediate failures occurred among transplants from unrelated than

among those from related donors.


The presence of preformed cytotoxic

antibodies against the donor appears to be a

strong contraindication for transplantation

日本臨床腎移植学会　第6回集中セミナー「抗HLA抗体のモニタリング」

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ント血 1 L ナリン 1 Lント血 1 L ナーリン 1 L2000 37℃60 反応

体 25℃120 反応

ン、定



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血 dithi th it l DTT血 dithiothreitol DTT 、IgM抗体の

Anti human immunoglobulin AHGL-chain Type ��L-chain Type� 、

より

Interpretation of crossmatch result

(Mulley WR, Kanellis J. Nephrology. 2011 )


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Points at LCT-XM, AHG-LCT-XM

• 定の主、に

• 抗体なな

• リンのViabilityによ大

• 非抗体によな

• 血中の抗体の、体のに

• IgGのisotypeによ体なに

Flow cytometry crossmatch (FCXM)

ント血 100 L ナーリン 100 L200 000 25℃30 反応200,000 25℃30 反応

Goat F(ab’)2 anti-human IgG-FITC, CD19-PE, CD3-PerCP 4℃30 反応

、フーイトトリー定


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Flow cytometry crossmatch (FCXM)

B-FCXM に、B のBCR抗体 cross reaction 、抗体 cross reaction 、

pronase 反応

pronase BCR 外の抗原ににりな

Points at FCXM• フーイトーター要

• HLA 抗体の、歴のな定要

• 定によな• 、定、によな

ントーナー血 AB型のー血

定

• MFI絶ントー 10 のフト

20 4020 40

• 血のMFI ントーのMFIの

• ナー血、 FCXM 用のB


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• Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

• Bead-based array assays

Solid-Phase Immunoassays

y y

Flow cytometry Luminex

Flow PRA Screening Test LABScreen Mixed

Flow PRA Specific LABScreen PRA

Flow PRA Single Antigen LABScreen Single Antigen

抗体の

%PRA

%PRA

Differences between Flow PRA & LABScreen

Flow PRA LABScreen

体な体な

器要要

定自

自

要要

器要、薬

non-HLA抗体な


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Flow PRA Screening Test

Class I Beads PRA = 99%Class I

Class II Beads

PRA = 66%Class II

Specificity: B57, 58

PRA: 9.4%

Flow PRA Specific

Flow PRA Specific

Flow PRA Single Antigen


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Flow PRA Single Antigen

LABScreen Mixed• HLA抗体・MICA抗体のスクリーニング• Luminex ー 1 り、3 5 の (HLA抗

原 ) のHLA抗原、MICA抗原ーンググ

Class l: 12beads (3 panels/bead)Class ll: 5beads (5panels/bead)MICA-Ag: 2beads (5panels/bead)

Class II: Class I:


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LABScreen PRA• HLA抗体の PRA 定• Luminex ー 1 り、1 ののHLA抗

原ーングClass I 55 のー、Class II 35 のーに、

HLA抗原ーング

LABScreen Single Antigen• HLA抗体の定• ー 1 り、1 の HLA抗原ーング


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ICFA (Immunocomplex Capture Fluorescence Analysis )

HLA HLA Ab non-HLA Ab

Ag Ab reaction Solubilization

+

DonorLymphocyte Patient serum

Immune Complex

Anti-HLA class I or II Ab

CaptureWash

HLA class I or II specific beads

PE labeled anti-human IgG AbSecond Ab reaction

Analysis by Luminex

Determination by index (Positive >2.0)

Variation in Results by Choice of Anti-HLAAntibody Detection Technique

Method Positive NegativeMethod Positive Negative

CDC 102 162

AHG-CDC 116 (+13%) 148

ELISA 127 (+10%) 137

(Gebel, HM & Bray, RA. Transplantation. 2000)

Flow PRA 139 (+10%) 125


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Preformed DSA

Preformed DSA class I/IIに関廃絶の因

Lefaucheur C, et al. J Am Soc Nephrol 2010; 21: 1398


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ハイタイターpreformed抗HLA-DSA移植廃絶のリスク

Lefaucheur C, et al. J Am Soc Nephrol 2010; 21: 1398

IgG クラスの

Complement fixing subclass C1 complex

IgG3 >> IgG1 > IgG2 > IgG4

Complement tivati

Fc-receptor binding properties

IgG3 > IgG1 >> IgG2 > IgG4 Cell mediated cytotoxicity


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Pretransplant IgG subclasses of donor-specific HLA Abs and development of AMR

Hönger G, et al. (University Hospital Basel, Switzerlan)

Transplantation 2011; 92(1):41

ニンIgG2/IgG4 subclass DSAのント AMR グラフト生

Hönger G, et alTransplantation 2011; 92(1):41


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Preformed DSAに関ンセンス

• Preformed DSA class I/IIに関廃絶の因

• Cross Reactive Epitope Group (CREG) AbsのAMRの (Nainani N, et al. Transpl Immunol 2009; 20:113)

• ハイタイターpreformed DSA 、廃絶のリスク

• IgG2/IgG4 subclass DSAの、

グラフト生

De novo DSA


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DSA 生 --グラフトスのハイリスク

De novo DSAAMRの因

Non-DSA因な

Wiebe C, et al. Am J Transplant 2012;12(5):1157

De novo DSA の因に

Significant association between chronic AMR and DR-DSA in renal transplantation

1. Iniotaki-Theodoraki AG, et al. Transplantation 2003; 75(9): 1601.2. Zhu L, et al. Clin Transpl 2008: 171.3 K b hi T l H I l 2011 2(1) 11

De novo DQ-DSA are associated with a significant risk of AMR and transplant glomerulopathy

3. Kobayashi T, et al. Hum Immunol 2011; 72(1): 11.4. Wiebe C, et al. Am J Transplant 2012;12(5):1157.

glomerulopathy1. Worthington JE, et al. Transplantation 2003; 75(7): 1034.2. Willicombe M, et al. Transplantation. 2012;94(2):172-7.3. Devos JM, et al. Kidney Int 2012;82(5):598-604.


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De novo DSAに関ンセンス

• De novo DSA AMR/グラフトスの因

• Non-DSA HLA抗体因な

• HLA class II >> class IDR? DQ? DP?DR? DQ? DP?

• De novo DSAの生に ?

De novo DSA

Antibody-mediated rejection—an ounce of prevention

is worth a pound of cureozの lbのに

Bradley JA, Baldwin WM, Bingaman A, Ellenrieder C, Gebel HM, Glotz D, Kirk AD. Am J Transplant 2011;11(6):1131

ozの lbのに


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Functional properties of IgG isotypes

Complement fixing subclass C1 complex

IgG3 >> IgG1 > IgG2 > IgG4

Complement tivati

Fc-receptor binding properties

IgG3 > IgG1 >> IgG2 > IgG4 Cell mediated cytotoxicity

IgG3 subclass

に


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TH によ IgGクラススイのターン

TH1-biased isotype (IFN-γ, TGF-β)

→ IgG2, IgG3

TH2-biased isotype (IL-4)

→ IgG1, IgG4

MMF/mTORi 、STAT1のリン化、STAT5のリン化

TH 応応な

IgG3 subclass の

CNIのminimizationに IgG3-DSAの、MMF/mTORi


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Algorithmic approach to sensitized patients

(Marfo K, et al. Clin J Am Soc Nephrol. 2011)

Basic Concepts in Desensitization

Depletion of antibody

producing cells

Removal of existing

antibodies• y B –

Rituxim ( ti-CD20)

• - B

)

Suppression of the T cell

•

•

Inhibition of residual antibody

response•

•T wi

MMF t

and Complement system

cascade• t ( V

• (C5 )


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移植 48 1回2g/BWのグリン 4

→ placebo群に PRA に→ placebo群に PRA に

移植 placebo群 17%、IVIG群 35%placebo群 10.3 、IVIG群 4.8

2 生 placebo群75%, IVIG群80% な

移植 20IVIG (2g/kg×2 dose) + Rituximab (1g×2 dose)IVIG (2g/kg 2 dose) Rituximab (1g 2 dose)→ PRA 77±19% 44±30%

移植の 144±89 5±6 移植 80% IVIGの 35% 1 生 100%, 1 生 94%


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Outcomes in Kidney Recipients ReceivingDesensitization Treatment 2000-2010

りFCXM (++)CDC-T (++)

りFCXM (-~+)CDC-T (-~+)

広島大学院に

りFCXM (-)HLA (+)

なFCXM (-)HLA (-) CDC-T (++)

DSA (+)

Rituximab&

Bortezomib

CDC-T (- +)DSA (+)

Rituximab&

DFPP

HLA (+)DSA (-)

HLA (-)DSA (-)

な

Bortezomib&

DFPP

DFPPDSA(+): MFI>1000

Rituximab リン® よ Bortezomib イ ® の用に学の認


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Follicular B cell

Germinal Center

B の化リ抗HLA抗体産生に関主な

Plasma blast cell

Long-lived Plasma cell

Memory B cell

Naïve B cell

Short-lived Plasma cellPlasma blast cell

Follicular B cell

Germinal Center

ミ抗HLA抗体産生に関主な

Plasma blast cell

Long-lived Plasma cell

Memory B cell

Naïve B cell

Short-lived Plasma cellPlasma blast cell


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42 血型、輸血により

HLA typing: Full mismatch

CDC T-warm 、B-warm 、B-cold

T-cell FCXM

LABScreen® Single AntigenLABScreen® Single Antigen

Class I 抗体 : HLA-B*1501 (MFI: 12966) 34

Class II 抗体 : 3

CFSE-MLR: の抗ナー応

血型移植にクス化

MFI 3.43 MFI 2.84 MFI 2.93

移植 5 0AMR( ), ( )S-Cr 1.20 mg/dl

DSA( ), NDSA(+)Control

Patient

Anti human IgG-FITC

Cel

l num

ber

MFI 13.06 MFI 9.54 MFI 4.15


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58 血型、移植



T-cell FCXM

LABScreen® Single AntigenSc ee ® S g e t ge

Class I 抗体 : HLA-A2 (MFI: 14958) 11

Class II 抗体 : 6


血型移植に、クス化な

Control

Anti human IgG-FITC

Patient


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血中に B 、Memory B な認、

ミ

ミ 1 イク 1.3mg/m2 体 2回、2 1, 4, 8, 11 タン用、2 にDFPP

ミ、CDC / FCXM 化

移植 3 0AMR( ), ( )S-Cr 1.27 mg/dl

DSA( ), NDSA( )


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61 血型、妊娠によ


A A B B DRB1 DRB1

R i i t 0201 0201 3901 1510 0401 0801


T-cell FCXM

LABScreen® Single Antigen

Recipient 0201 0201 3901 1510 0401 0801

Donor 2402 2402 0702 5201 0101 1501

LABScreen® Single Antigen

Class I 抗体 : HLA-B7 (MFI: 5317) 16

Class II 抗体 : な


血型にクス化、な

移植 1 2AMR( ), ( )S-Cr 0.88 mg/dl

DSA( ), NDSA( )

ミ、クス、DSA 消


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ミ DSAな

移植移植1 移植6 移植1移植移植1 移植6 移植1

スイスIgG 2.0 87.9 80.2 120 81.8 78.2

イスIgG 2.0 9.2 67.5 23.3 26.3 26.9

イスIgG 2.0 25.5 8.7 19.6 14.2 9.8

イスIgG 2.0 128 128 128 128 128

ンスイスIgG 2.0 3.7 2.0 3.7 2.5 2.9

イトイスIgG 4.0 70 65 53 76 67

中、な認な

EB イス抗VCA IgG 10 80 20 20 20 40

Possible cause of differential depression of antibody DSA vs. protective immunity

Everly MJ, et al. Transplantation 2010; 90:1493


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Technical Group

(a) SPI must be used for the detection of pretransplantation HLAantibodies in solid organ transplant recipients and, in particular, the use of the single-antigen bead assay to detect antibodies to HLA loci, such as Cw, DQA, DPA, and DPB, which are not readily detected by other methods.

(b) The use of SPI for antibody detection should be supplemented with cell-based assays to examine the correlations between thewith cell-based assays to examine the correlations between the two types of assays and to establish the likelihood of a positive crossmatch.

(c) There must be an awareness of the technical factors that can influence the results and their clinical interpretation when using the Luminex bead technology, such as variation in antigen density and the presence of denatured antigen on the beads.

Pretransplantation Group

(a)Risk categories should be established based on the antibody and the XM results obtained. (b)DSA detected by CDC and a positive XM should be avoided due to their strong association with antibody-mediated rejection and graft loss. (c)A renal transplantation can be performed in the absence of a prospective XM if singleantigen bead screening for antibodies to allprospective XM if singleantigen bead screening for antibodies to all class I and II HLA loci is negative. This decision, however, needs to be taken in agreement with local clinical programs and the relevant regulatory bodies. (d)The presence of DSA HLA antibodies should be avoided in heart and lung transplantation and considered a risk factor for liver, intestinal, and islet cell transplantation.


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Posttransplantation Group

(a)High-risk patients (i.e., desensitized or DSA positive/XM negative) should be monitored by measurement of DSA and protocol biopsies in the first 3 months after transplantation.(b)Intermediate-risk patients (history of DSA but currently negative) should be monitored for DSA within the first month. If DSA is present, a biopsy should be performed. (c)Low-risk patients (nonsensitized first transplantation) should be(c)Low-risk patients (nonsensitized first transplantation) should be screened for DSA at least once 3 to 12 months after transplantation. If DSA is detected, a biopsy should be performed. In all three categories, the recommendations for subsequent treatment are based on the biopsy results.

• DSA に、short-lived plasma cell long lived plasma cellののplasma cell long-lived plasma cellのの

要

• Rituximab Bortezomib 段ににより、な認な

• に


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「抗HLA抗体のモニタリング」 PRA 139 (+10%) 125 日本臨床腎移植学会 第6回集中セミナー 「抗HLA抗体のモニタリング」 2014年3月14日 2014/3/4 13

「抗HLA抗体のモニタリング」 PRA 139 (+10%) 125 日本臨床腎移植学会第6回集中セミナー「抗HLA抗体のモニタリング」 2014年3月14日 2014/3/4 13