HPLC-foredr-Molde-Vannringen 20140403 fin p · 2015-03-24 · HPLC Litt om Hva, Hvordan ... -"normal fase"-kromatografi : stasjonær fase (SF) = polar jfr. Tsvett mobil fase (MF)

07.04.2014

1

HPLCLitt om Hva, Hvordan

Vannringens Seminar, 4.4.2014, Molde HPLC Rudolf Schmid

Rudolf Schmid, Institutt for kjemi NTNU, Norges teknisk‐naturvitenskapelige universitet

2

HPLC : • High Pressure Liquid Chromatography (historisk)

• High Performance Liquid Chromatography (korrekt i dag)

• High Price Liquid Chromatography (av og til korrekt også)

Vannringens Seminar 2014 Molde HPLC Rudolf Schmid

HPLC : på Norsk (bokmål) de facto:

ca. Høytoppløsende (instrumentell) kolonne‐væskekromatografi

07.04.2014

2

3

HPLC :


Definisjon : IUPAC (1993) :

"Chromatography is a physical method of separation in which the components to be separated are distributed between two phases, one of which is stationary (stationary phase) while the other (the mobile phase) moves in a definite direction. "

International Union of Pure and Applied Chemistry, Nomenclature for chromatography (IUPAC Recommendations 1993). Pure & Appl. Chem. 65, 819 (1993)

" Kromatografi er en fysikalsk separasjonsmetode der komponentene som skal separeres fordeles mellom to faser, hvorav den ene er stillestående (den stasjonære fasen) mens den andre forflytter seg i en bestemt retning (den mobile fasen). "

(Uautorisert norsk oversettelse v. Rudolf Schmid, 2008)

4

HPLC :


• Kromatografi: barn av det 20. århundre

• Omkring 1905: Teknikk og navn introdusert ved Michail Semenovitsj Tsvett (1872-1919, russisk botanikker).

• Tswett systematisk brukte adsorpsjons-kolonne-kromatografi til analyse/karakterisering av plantepigment-ekstrakter.

Registrerte mønstre av fargede bånd – "fargeskriving/ -tegning" – kromatografi .

07.04.2014

3

5

HPLC : Chromatography = Kromatografi


Illustrasjon: Eluerings‐kromatografi, vist på en kromatografikolonne:

A.D.C. Skoog & al. : Fundam. of. Analyt. Chem., 8th ed.(2004) : P. 922 - Ch. 30.E.

Kromatografikolonne:(pakket type) porøse partikler pakket i et rør, gjennomstrømmet av en "mobil fase" -(væske, gass, s.f. )

Deteksjonspunkt

"Kromatogram" av denne separasjonen/ analysen

"Bremsvirkningen" av den stasjonære fasen på prøve-komponentenes (analyttenes) framdrift kalles:

Retensjon (eller retardering)

Utviklingen av et kromatogram (generelt) og

framdriften av analyttene (prøve-komponentene) takket være den mobile fasens forflytting (spesielt) kalles :

Eluering

6



Kromatografi er en samlebetegnelse på teknikker for separering av stoffer

• Klassifisering av kromatografi-teknikker .

Etter fasenes natur

Stasjonær fase (SF)

Mobil fase (MF)

Forkortelse (fra eng.)

Navn

gass GSC adsorpsjons-gasskromatografi,gass-faststoff-kromatografi

fast stoff væske LSC adsorpsjons- (væske-) kromatografi

_ _ _ _ _ _ _ superkritisk fluid SFC Superkritisk fluid kromatografi

væske LLC væskæ-væske-kromatografi

væske gass GLC (GC) Gass- (væske-) kromatografi

07.04.2014

4

7



Kromatografi er en samlebetegnelse på teknikker for separering av stoffer

• Klassifisering av kromatografi-teknikker

Etter separasjonsprinsipp

Metode Natur av hovedprosessen

Adsorpsjons‐kromatografi Adsorpsjon

Fordelings‐kromatografi Fordeling ("ekstraksjon")

Ionebytter‐kromatografi Elektrostatisk tiltrekning, kompleksering

Eksklusjons‐kromatografi (Hindret) diffusjon

(Bio‐)affinitets‐kromatografi (Bio‐)spesifikke vekselvirkninger mellom prøve og "selektiv ligand"

8


Enda litt mer klassifisering

.... bl.a. etter utformingen av systemet :

NB.: Ikke HP-, men LP-LC

• kolonnekromatografi (søylekromatografi)

Bilder fra "Google pictures"

• planar kromatografi (tynnsjikt-, papirkromatografi)


07.04.2014

5

9



Repetisjon:

Eluering =

"Lagingen" / "utviklingen" av et kromatogram (generelt) ogframdriften av prøvekomponentene på grunn av mobil-fasens forflytting (spesielt).

Retensjon (eller retardering) = "Bremsvirkningen" av stasjonærfasen på prøvekomponentenes framdrift.

Enda litt mer klassifisering

.... bl.a. etter fasenes polaritet :

- "normal fase"-kromatografi : stasjonær fase (SF) = polar jfr. Tsvett

mobil fase (MF) = upolar"separerer etter polaritet"

- "omvendt fase"-kromatografi: stasjonær fase (SF) = upolarmobil fase (MF) = polar

"separerer etter hydrofobisitet"

10

HPLC :


• Den mobile fasen er en væske !!

• … de fleste separasjonsmekanismer er i bruk, der

prøve-komponenter separeres v.h.a.

• Adsorpsjon (Adsorption, LSC),

• Fordeling (Partition, LLC),

• Ionebytting (Ion-exchange, IEC),

• Eksklusjon (Size exclusion, SEC),

• de viktigste, pluss litt til

Valget bestemmes av prøven - separasjonsproblemet:

07.04.2014

6

11

HPLC :


• Adsorpsjon (Adsorption) og fordeling (Partition), finnes

- med Normal fase (Normal phase = NP ) og - med Omvendt fase (Reverse(d) phase = RP )

Kontakten med stasjonærfasen (= SF) er ved ….

Fordeling, gjennom ABsorpsjon Ved adsorpsjon gjennom ADsorpsjon

Fra: James M. Miller "Chromatography, Concepts & Contrasts" , Wiley (2005 )

12

Et konstruert (?) eksempel • Takker Youtube.com , og Phenomenex (video clip produsent)• http://www.youtube.com/watch?v=mPO7Tv2mIJU

Hoste- og forkjølelses-medisin analysert ved HPLC:

1. chlorpheniramine maleate(antihistamin)

2. aspirin (smertedempende)

3. dextromethorphan HBR (hostedempende)

07.04.2014

7

13

HPLC :


Grunnleggende : 2 hovedfaktorer for vellykket separasjon:

• (Forskjell i) vandrings-lengde/-hastighet /-tid av analyttene:

(forskjell i) retensjon

• Hvor samlet (eller hvor spredd) analytten er etter separasjonen:

sonespredning

• Sammen beskriver de "oppløsningsevnen" for separasjonen av to topper.

14

HPLC :


Kolonne-kromatogram

Separasjon alene(viser kun retensjon, antyder

"separasjonspotensialet")

Separasjon med sonespredning

(viser faktisk mulig oppløsning / separasjon)

Typisk for reelle topper (med sonespredning): Bredden øker med økende retensjonstid (ved konstante analysebetingelser)

07.04.2014

8

15

HPLC :


• (Forskjell i) vandrings-lengde / hastighet /-tid av analytter: retensjon - utrykkes som :

• retensjonstid tR , • som retensjonsvolum VR , eller som • retensjonsfaktor k (analytt-eluering uavh. av hastighet & dim.; målt i forh.t. MF-"eluering")

• Hvor samlet (eller hvor spredd) analytter er etter separasjonen: sonespredning - måler spredning (som toppbredde) i forhold til retensjonen

• Som 'platehøyde', H (= prop. (bredde/ret.-tid)2 , eller

• Som 'platetall', N (= prop. (ret.-tid/bredde)2 )

• Samlet beskriver de "oppløsningsevnen" i en separasjon, RS (eng.: Resolution):numerisk:

RS = ∆tR / ½(wb,A+ wb,B) = toppavstand delt med toppbredde (gjennomsnitt)

i eksempelet over: RS = ca. 2 N.B.: ang. RS og platetall:

16

HPLC :


• For god oppløsning kan vi :

• Øke separasjonen for analyttene -mest mulig ulike tR, VR, k

Tiltak: endring av analyttenes fordeling mellom MF og SF ("kjemiske endringer" (mest))

• Reduseres sonespredningen (høyest mulig N, lavest mulig H)

Tiltak: endring av stoffspredningen under elueringen (fysiske parametere i kolonnen (mest))

For øvrig:Oppløsningen RS øker med N½ , d.v.s. det trengs 4 x større N for å doble RS .

↑2 topper "basislinje-separert"

(ved RS = 1,5 )

07.04.2014

9

17

HPLC :


• Krav om god oppløsning viktigere når :

• Topper har ulik størrelse Vanskelig identifisere og (særlig kvantifisere den minste av toppene

Haledannelse, 'tailing' 'Fronting'

• Topper er asymmetriske

• haledannelse - "tailing" el.

• "fronting"

18

HPLC :


• Sonespredning (og asymmetri) er alltid uønsket

Smalere topper gir

• større sikkerhet ved identifisering,

• Enklere, sikrere kvantifisering

• mindre fare for topp-overlapp

• Å bekjempe spredning koster innsats: kunnskap og 'cash'

07.04.2014

10

19

HPLC : High Performance / High Pressure LC


Viktigste parametere som har effekt på sonespredning:

Diameter av SF-partiklene: mindre spredning med mindre partikler.

Mobilfase-hastighet (lineær hastighet), u • avhengighet jfr. van Deemter kurver (rød)

Diffusjonskonstanten, D, av analytten i MF og i SF : 2 sprikende effekter, hhv. ved høy og ved lav hastighet.(ofte lite å gjøre med D)

20

HPLC :


Balansering mellom 'High Performance' og 'High Pressure', i HPLC :

For HPLC: partikler på 3-5 μm (10 μm "på vei ut")

- HPLC : opptil ca. 350 bar kolonneinngangstrykk.

For UHPLC (Ultra HPLC) : partikler på 1,5 – 2,5 μm- UHPLC: > 1000 bar inngangstrykk, teknisk/praktisk noe mer krevende.

• Diameter av SF-partiklene: Enda en fordel :

• Mindre partikler tillater høyere elueringshastigheter

Etter: Lundanes & al., "Chromatography, …" Wiley VCH, 2014.

Ad: Viktigste parametere som bidrar / har effekt på sonespredning:

• Diameter av SF-partiklene: mindre spredning med mindre partikler

Begrensing: små partikler gir stor motstand mot gjennomstrømning av MF(økende med 1/dp

2 )

'High Performance'–partikler (små partikler) kan bare brukes ved … 'High Pressure', for å kunne oppnå akseptabel retensjonstid / mobilfase-

hastighet)

Derfor HPLC !!.

07.04.2014

11

21

HPLC :


Parametere som bidrar / har effekt på sonespredning:

• Diameter av SF-partiklene: Enda en fordel med mindre partikler• Mindre partikler tillater høyere elueringshastigheter/kortere analysetider:

"Fast, Faster, Ultrafast; Optimization…", Agilent Techn., LC-GC; Feb.2005

Partikkel- Kolonne-diameter [μm] lengde [mm]

5 (HPLC) 250

3,5 (HPLC) 100

1,8 (UHPLC) 30

1,8 (UHPLC, rask) 30

22

HPLC : (ca. Høytoppløsende (instrumentell) kolonne‐væskekromatografi )


Det allermeste er instrumentstyrt,

"Manuelt system" Fra Google.com HPLC pictures

07.04.2014

12

23



Det allermeste er instrumentstyrt, manuell aktivitet er uønsket (!)

maskinene leverer mer nøyaktig og mer reproduserbar. Fordel (krav) for sertifisering og GLP (?)

Variasjonen i teknikken / anvendelsen : Er bestemt av valg av stasjonærfase - seprarasjonsprinsippet- kolonnen

De mest-brukte separasjonsprinsipp:

• Kjemisk bundne omvendt-fase-kolonner

• Ionebytterkromatografi for biomolekyl-separasjoner,

• og for ionanalyse (ionekromatografi)

• Ekslusjonskromatografi for syntetiske og bio-polymerer

(delvis mitt subjektive inntrykk, muligens ikke helt korrekt) "Manuelt system" Fra Google.com HPLC pictures

24



• Det meste er instrumentstyrt, manuell aktivitet er uønsket (!)

maskinene leverer mer nøyaktig og mer reproduserbar.

Oversikt over instrumentering

"Manz & al. "Bioanalytical Chemistry", Imp.CollegePress, 2004

Her vises skjematisk : Høytrykks-blandende to-løsningsmiddel-system, programmerbar for å endre MF-sammensetning underveis (gradient-analyse)

07.04.2014

13

25



Instrumentering:

"Manz & al. "Bioanalytical Chemistry", Imp.College Press, 2004

Løsningsmiddel: Valget sterkt avhengig av separasjonsproblemet: prøve & kolonne

Generelle ønskede egenskaper: • Rene: partikkelfrie, ikke forstyrrende i detektoren• Lav viskositet• Miljø- og HMS-messig akseptable• Kjemisk inert under analysebetingelsene • Fri for gass (luft) • Nøyaktig blandet, hvis MF er en blanding. • Riktig pris• Evt. temperert

• Skal levere separasjon med passe (ikke for stor retensjon / retensjonstid / retensjonsvolum).

Kanskje mest brukt : Vann, acetonitril, metanol, ("omvendt fase–løsningsmidler")

26



Instrumentering:


Skal gi separasjon med passe (ikke for stor retensjon / retensjonstid / retensjonsvolum).

• Retensjonen reguleres av mobilfasens / løsningsmiddelets " styrke":

• Styrke er evnen til å forflytte analytten raskt.

• Sterke MF gir lav retensjon, korte retensjonstider, • Svake MF gir høy retensjon, lange retensjonstider

Om en MF er sterk eller svak avhenger av separasjonsmekanismen

For "Normal fase" : sterk MF = polar, svak MF = upolar (f.eks. alifater)For "Omvendt fase": sterk MF = lite polar, svak MF = sterkt polar (f.eks. vann) s.o.

Kanskje mest brukt : Vann, acetonitril, metanol, ("omvendt fase–løsningsmidler")

07.04.2014

14

27



Instrumentering:


Driftsmuligheter :

Isokratisk : Konstant mobilfase-sammensetningoptimal oppløsning - for prøver med noenlunde lik retensjon

Gradient-eluering: MF-endres, fra svakt til sterkt for prøver med sprikende retensjon kan analyseres i samme analyse

28



Instrumentering:


Pumpe(r ): avhengig av bruken: (konstant MF (=isokratisk analyse), eller varierende MF (gradient analyse)

Typisk brukt i dag: • ("resiprokerende") stempelpumper (rel. lite slagvolum, mye mindre enn retensjonsvolumet) • sprøytepumper (stort volum i forhold til retensjonsvolm, brukt for små trange kolonner)

Generelle ønskede egenskaper: • Tåler de fleste aktuelle mobilfaser (polar, upolar, sur, basisk, salt)• Presise, driftssikre, pulserer lite • Lett regulerbare / programmerbare • Stort reguleringsområde for pumpehastighet og kan pumpe mot høyt trykk • Lite dødvolum• Riktig pris.• Eventuelt med avgasser / fjerner luft fra MF, og mikser (blander blandinger homogent)

Konstruksjon i rustfritt stål (evt. titan), teflon, PEEK-plast, bl.a.

07.04.2014

15

29



Instrumentering:


Injektor: (i dag praktisk alltid en ventil-injektor) • Doserer prøvemengde i en rørstrekning "off-line (en "loop"), • som så svitsjes in i MF-strømmen (som tar med prøven) til kolonna.

Loop-volum kan velges tilpasset analysen. "Lading av loop" Injeksjon til kolonna

i automatiske prøvegivere ("Autosamplere"), er ventilinjektoren innebygget. Den ordner prøve-dosering, -injeksjon og analysestart automatisk, også for lange serier. Ventil-svitsjing skjer som regel elektrisk.

Loopen kan fylles delvis (< 50% av loopen) (volum-kontroll gjennom sprøyta), eller

loppen kan fylles/skylles med prøve (> 200%) (fast volum bestemt av loopens interne volum)

30



Instrumentering:

"Manz & al. "Bioanalytical Chemistry", Imp.College Press, 2004Filtrering: Systemet tåler ikke partikler: • Filtrering av MF før bruk• Filtrering av prøver før injeksjon • Inntaksfiltre for MF til pumpen (beskyttelse av pumpa),• Ofte in-line filtre mellom injektor og kolonna (evt. erstattet med beskyttelseskolonne).

Partikler av kritisk størrelse kan akkumuleres på kolonna, evt. delvis trenge inn i kolonnepakningen og plugge den igjen over tid (trykkøkning)

Termostatering ("kolonneovn"): I dag ganske vanlig: temperaturkontroll for HPLC-kolonna (f.eks. v. Peltier-elementer). Mest normalt med noe økt temperatur : • Reduserer viskositeten av MF – mindre mottrykk • Kan for noen analytter øke løseligheten i MF • Kan forbedre analysen: reduserer retensjonen (retensjonsfaktoren minker med økende temp.) • Kan forbedre analysen: endret relativ retensjon for analytter ved endret temp.

07.04.2014

16

31



Instrumentering:

"Manz & al. "Bioanalytical Chemistry", Imp.College Press, 2004Detektor: Skal detektere analyttene : • Finnes som selektive og som generelle/universelle.• Finnes i variert følsomhet (i dag typisk uttrykt v.hj.av deteksjongrense)• Finnes som robuste og mer delikate (f.eks. ikke kompatible med gradient) • Finnes som relativt enkle billige, og som avanserte kostbare (f.eks. MS-detektor)

Andre vanlige HPLC-detektorer: o Brytningsindeks-detektor univ.o Elektrokjemisk e detektorer selekt.o Ledningsevne-det. selekt.o Fluorescens-det. selekt.o Fordampings-lysspredn.-det. univ.o M.fl.

Mest vanlig brukt detektorermed noe selektivitet: Mest brukt / kjent: UV-detektoren: detekterer bare UV-absorberende stoffer.

UV/Vis.-"Photo Diode Array"-detektor for HPLC:Detekterer ved flere λ samtidig, svitjser λ veldig fort, tar opp hele UV-spektrum kontinuerlig.

32



Instrumentering:


Detektor: Mer avansert: spektroskopiske detektorer - her spesielt massespektrometri

Gir tilleggs-identifikasjon for kromatografiske topper: karakterisering ved MS-data i tillegg.

MS er mye brukt som detektor i dag fordi ……den er ofte er både selektiv, gir identifikasjonshjelp fra MS data OG har høy følsomhet.

MS kan være ganske/veldig selektiv : • vurdering av selektive masser(-områder) eller • fragmenterings-reaksjoner (masse-overganger , v. MS/MS)

Alternativt: MS kan skanne bred og registrere total-ionestrøm (som er relativ universell deteksjon).

Mest vanlig MS-ioniseringsmetode for HPLC : ESI (elektrospray-ionisering). Mest brukte masseanalysatorer for LC/MS: enkel-kvadrupol (lineær el. ionefelle), trippel-kvadrupol MS/MS, Time-Of-Flight.

07.04.2014

17

33



Instrumentering:


Dataanalyse / systemkontroll:

Rel. avansert programvare • kontrollerer instrumentet (ønskelig for større nøyaktighet og pålitelighet) og • samler inn, • lagrer og • analyserer data (etter digitalisering av kromatogrammet).

Mulighet for, langt på vei, automatisk kvantifisering av (rutine-) analyseserier.

Viktig med etterkontroll av integrering og kalibreringer m.m.

34



Instrumentering: Kolonnen

07.04.2014

18

35




Ett rør (stål, PEEK) • med SF-pakningsmaterialet inn i• med end-koblinger med sinterplater ("filter-skiver" ,holder pakningsmaterialet på plass) og for tilkobling av ledninger.

Dimensjoner typisk: • Lengde inntil ca. 25-30 cm, men nyere ned til 3-5 cm• Diameter klassisk 4,6 mm i.d. (1/4" o.d.), men nyere ned til 3 - 2,5 mm i.d.• Ekstra-tynne: "micro-bore"-kolonner (ca. 1 mm) og kapillærkolonner (< 0,2-0,5 mm)

Inneholdet: pakningsmaterial:

Kjemisk egenskaper : avhengig av separasjon-mekanisme

Fysiske egenskaper: porøse partikler, irregulære eller sfæriske, dia. 3–5 μm (HPLC), 1,5–2,5 μm (UHPLC).Men også: overflateporøse partikler y.d. 3,5 - 5 μm (kjerne-diam. 2,5 – 5,3 μm);

kompakte partikler 1,8-2,5 μm; Monolitt-kolonner (ikke-partikulært porøst SF-"blokk" som fyller hele røret).

(Mikro-)Porestørrelser i partiklene varierer, 40 -300 nm (snittverdier).

Basismaterialer: uorganiske oksider (mest silikagel), syntetiske polymerer (sterkt kryssbundne, makroporøse).

36




Spesielle formater:

Patron-kolonner (Cartridge columns) Sparer penger og ressurser

dyrt kolonne-"innpakkingsmaterial" (spesielt end-koblingene)kan brukes om igjen når pakningsmaterialet blir dårlig (uten å måtte pakke kolonnen om selv).

Forkolonner (Guard columns)plasseres mellom injektor (el. ”in-line”-filter) og hovedkolonna: brukes for å beskytte hovedkolonnen (Den Kostbare) :

Små korte (1 - 3 cm) rel. effektive kolonner med lignende eller lik pakningsmaterial som hovedkolonnen,

som kobles mellom injektoren og (hoved-) kolonnen.

07.04.2014

19

37




Stasjonærfaser for HPLC:

Enormt utvalg p.g.a. mange separasjonsmekanismer

Praktisk sett skilles det også ofte mellom "Bonded Phase"- og "non-bonded phase"-materialer, i dag dominer bonded phase (BP) materialer.

Hoved-HPLC-kolonnetyper systematisert ved US Pharmacopeia (USP): 60 typer pr. 2009(men for hver type ofte dusinvis av (lignende) alternativer)

USP Designations

USP Packing Materials Teknikk

(Gjettet v. R.Sch., )

L1 Octadecyl silane chemically bonded to porous silica or ceramic micro-particles, 1.5 to 10 µm in diameter

RP-HPLC

L3 Porous silica particles, 5 to 10 µm in diameter NP-HPLC

L6 Strong cation-exchange packing: sulfonated fluorocarbon polymer coated on a solid spherical core, 30 to 50 µm diameter

IEC(HPLC / MPLC )

Etc. … L60

38




Mindre brukt enn RP i dag

Silika (silikagel), (sjeldent aluminiumoksid) - LSC

Brukes typisk med ganske upolare mobilfaser

Retensjon av silikagel varierer med adsorbert fuktighet ("aktivitet")Varierende aktivitet vanskeliggjør reproduserbarhet og bruk av gradienter

NB: når silika brukes med vannholdige MF fås trolig fordeling (LLC) – ikke adsorpsjon (LSC)

(i) Adsporpsjon: Normalfase (NP-LSC) :

Alternativt: polare kjemisk bundne faser brukt m. upolare MF ( NP).cyanopropyl-, -CH2-CH2-CH2-CN

diol-, -(CH2)3-O-CH2-CH(OH)-CH2OH

amino-, -CH2-(CH2)n-NH2 (n = 2, 3)

Mye lettere ”resirkulering” ved gradient-analyser.

07.04.2014

20

39




I HPLC viktig : Overflatemodifiserte materialer - ”Faste kjemisk bundne stasjonærfaser "

Viktig - basismaterialer:Trenger gode fysiske egenskaper, lett og variert (og stabilt) derivatiserbar.

Aller-viktigst i dag : Silikagel (s.n.)

HPLC-egnede alternativer: organiske polymerer : spesielt styren/divinylbenzen kopolymerer (PS/DVB) også : polyakrylaterogså : poyvinylalkoholer

40




For Omvendt-fase kolonner :

Aller-viktigst i dag : Silikagel - kan derivatiseres på silanolgruppene (-OH-gruppene)

mest kjent silikagel med oktadekyl-gruppene -n-C18H37

(typiske forkortelser : "RP18", "C18", "ODS" (for OctaDecyl Silica)).

Silika – O – Si(R’)2 – n-C18 H37 (R' = vanligvis methyl)

Popularitet skyldes : • rask ekvilibrering, • gradient-dugandes, • greit (grov-)regulerbar retensjon , • rel. lett forutsigbar retensjon (kan vurderes ut fra analyttens: andel hydrofobisk

overflateareal, eller fra dens vannløselighet). • lite uønsket kraftige interaksjoner med analytter. Viktig ! Silikagel er kjemisk labil i basisk miljø (pH < ca. 5-7) går i oppløsning !!

Eluering med basiske MF må unngås hvis mulig.

Omvendt-fase-silka finnes som "monomer", ”oligomer”, "polymer", "end-capped" (s.n.).

07.04.2014

21

41




For Omvendt-fase kolonner :

SiOH + ClSi(CH3)2C18H37 SiOSi(CH3)2C18H37

Monomere faser ("brushes") :

Ulike derivatiseringsmåter gir utslag i noe varierende retensjon og noe ulik selektivitet.

42




Teoretisk modellerte (del-)strukturforslag for polymere C18-faser (på silikaoverflate, (nederst i figurene), her med litt atypisk mye orden (p.g.a. høy C18-tetthet) i kontakt med organiske MF-komponenter (i fra MF-blandingen med vann). (Pemberton &al. Anal.Chem.(2003), 75, p.3360ff; strukturene baserte på ”Molecular Mechanics”-regninger)

Strukturer av SF (på eksempelet "polymer oktadekyl-silika fase")

SF-lagets sammensetning, og tykkelse, varierer med

type og andel organisk modifikator i den vandige MF,

modifikator som løser seg i/assosierer seg med ”RP-ligand-fasen”,

(el. modifikator-molekylen solvatiserer alkyl-kjedene)

Spørsmål om mekanisme adsorpsjon eller absorpsjonadsorpsjon eller fordeling fortsatt under diskusjon (?!)

07.04.2014

22

43




• Retensjon er sterkt avhengig av ”mengde” organiske substituenter

• RP-ligandens kjedelengde (f.eks. C8, C18, C30) bestemmer også retensjonen, • og litt selektiviteten: • Retensjonen øker med økende kjedelengde (omtrent inntil kjeden er lengre enn de analytten).

• Ulik alkylgruppe-tetthet (bl.a. monomer- vs. polymer-faser) skaper selektivitet m.h.t.stereokjemi: (særlig tydelig for polysyskliske aromater.

• Rest-silanolgruppe-mengde er også medbestemmende for selektiviteten av RP-SF’en.

• Porestørrelsen kan også bestemme om eksklusjonseffekter må vurderes Typisk : 100 Å-porer for normal HPLC (”små” molekyler),

300 Å-silikagel for protein-HPLC

For kjemisk bundne omvendt-fase kolonner:

44




Retensjonen blant silika-RP-faser kan variere i stort omfang (her C8 og C18-faser): k (for toluen i MeOH-H2O 50:50 (åpne firekant-symboler))

07.04.2014

23

45




For kjemisk bundne omvendt-fase kolonner:

Og så finnes mange andre substituentgrupper "bonded" til silikagel :

• cyano-faser Si-O-(CH2)3-CN • nitro-faser Si-O -(CH2)n-Ph-NO2

• amino-faser Si-O -(CH2)3-NH2

• diol-faser Si-(CH2)3- O -CH2-CH(OH)-CH2OH • "phenyl", • "nitro", • fluoroakyl, • med (mange) flere

Varierende polaritet, og selektivitet delvis varierende - avhengig av mobilfasen som brukes

46

Extreme High Resolution LC :UHPLC analysis


Reversed phase analysis

Sample: "4 preservatives". Sample: "various steroids"

ANALYSIS time : 10 sec (net) / at 90° C ANALYSIS time : 45 sec (net) / at 90° C

1,8 mL/min (t0 = ca. 1,5 s ), gradient‐analyse (ulike gradienter for (a) og (b)), kolonne 50 mm lang, 2,1 mm i. diameter, 1.7 μm partikler

07.04.2014

24

47

Extreme High Resolution LC :Proteomics : E-Coli proteom

• 41,5 timers hour analysis (gradient) !

• Identified: 16.000 peptides and 2.200 proteins in one single analysis - by LC/MS, i.e. with some extra help from mass spectrometry for the identification job in addition to the HPLC separation.

• Using a ”monolithic porous/packed” capillary column for LC : 0,1 mm i. diam., 35 cm long.


48

Multi-dimensional ChromatographyIn particular "Comprehensive 2-D chromatography"

"1st dimension" column (x-axis): slow separation (nearly 6 hrs). Separation principle: polar/special interaction (argentation) between silver ions and C-C double bonds (Ag+ on a Cation-Exchanger; separates by number of double bonds, unsaturation)

"2nd dimension" column (y-axis): fast separation (every 1.0 min). Separation principle: Reversed phase LC (non-polar SP; separates according to (non-)polarity; for these TAG analytes: approxi-mately. according to molecular weight/no. of methylene groups (homologous series).


Example: Comprehensive 2‐D HPLC of triglycerides (TAC, triacylglycerols) :

Fig. 6. Contour plots of corn oil constructed on the basis of the TIC chromatogram. Dots represent peaks detected automatically by the software. (a) Total contour plot. Dots remaining unlabeled correspond to peaks that could not be identified by manual inspection of the MS. Dashed lines refer to the PN, numbers at the bottom to the DB number; (b) expansion of contour plot in (a). First-dimension from 97.5–115 min, second-dimension from 0.84–1.18 min. Lines linking dots indicate peaks that were pooled by the merging algorithm and are considered to originate from the same compound. Numbers after the name of the TAG correspond with the molecular weight of the TAG.

Adapted from: Van der Klift & al, Journ. Chromatography A 1178, 43‐55 (2008)

Documents

HPLC-foredr-Molde-Vannringen 20140403 fin p · 2015-03-24 · HPLC Litt om Hva, Hvordan ... -"normal fase"-kromatografi : stasjonær fase (SF) = polar jfr. Tsvett mobil fase (MF)