BAB I PENDAHULUAN

1.1 Tujuan Percobaan Memahami prinsip analisa dengan menggunakan HPLC Mampu mengoperasikan alat HPLC Membuat kurva standar Menentukan konsentrasi sampel

1.2 Dasar Teori Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah menisahkan setiap komponen dalam sampel untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut

(kuantitatif).Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi poin penting dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan, dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini menjadi factor yang sangat penting dalam keberhasilan analisa. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya.Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrate (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobile. Setelah komponen dalam sampel berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalm bentuk signal kromatogram. Untuk jenis senyawa yang berbeda akan memberikan kromatogram yang berbeda. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang

menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sampel. Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu kromatogram yang terdiri atas banyak peak. Untuk mengetahui peak mana yang merupakan milik analat (zat

target analisa), kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standar.Disinilah kadang analis sedikit ceroboh.Cara yang palin umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention Time (RT), yaitu waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detector.Retention Time diukur berdasarkan waktu di mana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan puncak yang maksimum dari senyawa itu. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan tergantung pada : Tekanan yang digunakan Kondisi fase diam/fase stasioner Komposisi yang tepat dari pelarut Temperature pada kolom

Peak yang mempunyai Retention Time sama dengan standar umumnya akan langsung divonis sebagai peak milik analat. Memang senyawa atau zat yang sama akan mempunyai Retention Time yang sama, dengan catatan sampel dan standar dijalankan dengan kondisi dan system HPLC yang sama. Namun bukan berarti Retention Time yang sama pasti merupakan senyawa atau zat yang sama. Melihat Retention Time sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu senyawa atau zat. Hal lain yang perlu dilihat adalah spectrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spectrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spectrum 3D antara dua zat beda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan meskipun memiliki Retention Time sama. Tapi, spectrum 3D hanya dapat ditampilkan oleh HPLC yang telah menggunakan DAD (Diode Array Detector) sebagai detector.Sedangkan HPLC yang masih menggunakan detector UV tidak dapat melihat spectrum 3D.Namun demikian, konfirmasi masih dapat dilakukan dengan melhat spectrum UV. Prinsipnya sama, jika spectrum UV keduanya sama, maka kedua zat adalah sama. Tapi jika spectrum UV sampel berbeda dengan standar, maka kedua zat adalah zat yang berlainan meskipun Retention Time sama. Selain identifikasi senyawa, HPLC juga digunakan untuk analisa kuantitatif, yaitu penentuan konsentrasi dari komponen yang telah diketahui senyawanya dalam suatu sampel. Luas puncak atau tinggi puncak kromatogram berbanding lurus dengan massa komponen tersebut dalam campuran. Bila HPLC digunakan

untuk analisa secara kualitatif dari suatu senyawa, maka perlu ada data kurva standar yang menyatakan hubungan antara konsentrasi komponen (ppm) dengan luas puncak kromatogram yang terbentuk. Pembuatan larutan standar dilakukan dengan cara menginjeksikan senyawa murni dalam berbagai nilai konsentrasi yang sudah diketahui, kemudian akan diperoleh luas puncak masing-masing konsentrasi standar melalui alat HPLC. Dengan cara ini bias dibuat kurva standar, yaitu konsentrasi (ppm) versus luas puncak seperti pada gambar berikut :

Luas Puncak

Konsentrasi (ppm)Gambar 1. Kurva Standar

1.2.1 Fase Stasioner Dalam kromatografi cair-cair seperti HPLC, fase stasioner merupakan cairan yang dilapiskan pada permukaan zat padat penyangga yang dipakai sebagai bahan isian (packing material) untuk kolom.Ikatan antara zat padat penyangga dan fase stasioner dapat berupa ikatan fisik atau kimiawi.Karena dalam kromatografi partisi cair-cair baik fase stasioner maupun fase mobile berupa cairan atau pelarut yang tidak harus bercampur.Pelarut yang lebig polar biasanya digunakan sebagai fase stasioner.Oleh karena itu, system ini dinamakan kromatografi fase normal.Sebagai contoh, misalnya air dapat dipakai untuk fase stasioner, yang merupakan lapisan tipis pada silica gel. Air dapat teradsorbsi sampai 50 % dari berat silica gel. Bila fase stasioner yang

dipakai senyawa non polar, sedangkan fase mbile nya polar atau kebalikan fase normal, maka sistemnya disebut kromatografi fase terbalik.Untuk ini, penyangga padat yang bersifat non polar dapat dipakai, misalnya bubuk karet dengan lapisan benzene sebagai fase mobile.

1.2.2

Susunan Peralatan Susunan alat-alat yang dipakai untuk HPLC tidak banyak berbeda

dengan krmatografi gas-cair, hanya disesuaikan dengan sifat khusus dari kromatografi cairan. Komponen utama alat yang dipakai adalah : a) Reservoir Pelarut Zat pelarut yang digunakan polaritasnya dapat bervariasi bergantung dari senyawa yang dianalisis, yang harus diperhatikan ialah, bahwa tempat pelarut tersebut harus memungkinkan untuk proses penghilangan gas atau udara yang ada dalam pelarut tersebut. Cara yang dilakukan bermacammacam, misalnya dengan pemanasan, perlakuan vakum, atau dengan mengalirkan gas inert seperti helium.Menghilangkan gas atau udara tersebut perlu dilakukan karena pada waktu dialirkan dengan memompa, dapat terbentuk gelembung gas dalam aliran pelarut tersebut.Sehingga dapat menyebabkan aliran menjadi diskontinyu, yang seterusnya dapat mengganggu kromatogram yang dihasilkan. b) Pompa Pompa diperlukan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase mobile dengan kecepatan dan tekanan tetap.Gangguan pada pompa biasanya karena perawatan yang kurang teratur, yang disebabkan karena gangguan pelarut yang tidak difiltrasi dengan baik, adanya elektrolit yang mengandung klorida tinggi dan pH rendah, dan terjadi endapan dalam pompa.Tekanan yang diperlukan tergantung dari ukuran kolom dan viskositas pelarut. c) Injector Pada waktu sampel diinjeksikan ka dalam kolom, diharapkan agar aliran pelarut tidak mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom.Sampel dapat langsung diinjeksikan ke dalam kolom (on Column Injection) atau digunakan katup injeksi, di mana sampel diinjeksikan ke

dalam holding loop. Aliran pelarut dari pompa kemudian dialirkan melalui loop yang seterusnya akan mendesak sampel masuk ke ujung kolom. d) Kolom Ukuran kolom yang umumnya dipakai ialah dengan panjang 10-25 cm dan berdiameter 4.5-5.0 mm, yang diisi dengan fase stasionet berukuran ratarata 5-10 m, dan dibuat dari stainless steel. Efisiensi kolom salah satunya sangat bergantung dari besarnya partikel fase stasioner. Oleh karena itu, bila ukuran fase stasionernya lebih kecil, maka tinggi plat teoritik akan berkurang, sehingga jumlah plat teoritik akan bertambah, yang meningkatkan efisiensi kolom. Dengan kolom yang efisien dan pendek, pemisahan akan berjalan dengan cepat. Banyak analisis yang dilakukan pada suhu kamar, suku kolom sering dapat diatur supaya konstan dengan cara pemanasan. Sering dibutuhkan suhu kolom yang lebih tingga dari suhu kamar untuk mengatasi masalah daya larut solute yang dianalisis dan viskositas fase mobile yang agak tinggi. e) Detector Untuk memenuhi semua persyaratan dalam mendeteksi suatu zat memang sukar, namun sifat-sifat detector yang diperlukan ialah : Mempunyai sensitivitas tinggi Bersifat linier untuk jangka konsentrasi tertentu Dapat mendeteksi eluen tanpa mempengaruhi resolusi kromatogram Tidak harus peka terhadap perubahan berbagai parameter utama seperti suhu dan tekanan. Beberapa detector untuk HPLC diantaranya detector UV, detector flouresensi, detector konduktivitas, detector indeks refraksi, FID. Detector UV Banyak senyawa-senyawa organic menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika sinar UV disinarkan pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detector pada sisi yang berlawanan, maka akan didapatkan pembacaan langsung berupa besar sinar yang diserap.

UV DETEKTOR

OUTPUT from the column

UV diserap oleh komponen dalam campuran sinar UV

Gambar 2. UV Detektor

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantng pada jumlah senyawa tertentu yang melewati berkas pada waktu itu. Pelarut yang digunakan sepertinya tidak menyerap sinar UV, padahal sebenarnya pelarut juga menyerap sinar UV tapi dalam jumlah kecil.Misalnya, methanol menyerap pada panjang gelombang di bawah 205 nm dan air pada panjang gelombang di bawah 190 nm.Jika ingin menggunakan pelarut methanol-air, sebaiknya menggunakan panjang gelombang di atas 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.

1.2.3

Diagram Alir HPLCReservoir Pelarut

Display

Injektor

HPLC tube

Detektor

Pembuangan

Signal

Pompa

BAB II METODOLOGI

2.1

Bahan dan Alat A. Bahan yang digunakan 1. Larutan induk Paracetamol 2. Aquabides 3. Methanol 4. Membran B. Alat yang digunakan 1. Neraca digital 2. Tabung sampel 3. Pompa vakum 4. Ultrasonik 5. Shearing 6. Labu ukur 50 ml 3 buah 7. Gelas kimia 100 ml 1 buah 8. Pipet volume 10 ml 2 buah 9. Satu set alat HPLC

2.2

Prosedur Kerja A. Membuat larutan standar dan sampel 1. Menimbang Paracetamol murni sebanyak 30 mg lalu melarutkannya dalam labu ukur 50 ml menggunakan methanol. 2. Memasukkan kedalam ultrasonik selama 10 menit. 3. Menyaring dengan menggunakan shearing holder. 4. Memasukkan filtrat kedalam vial(tabung kecil). 5. Melakukan analisis dengan menggunakan HPLC. 6. Melakukan perlakuan diatas dengan sampel yang sama tetapi berbeda konsentrasi. 7. Mencatat waktu retensi, luas area, tinggi puncak dan konsentrasi.

B. Kondisi Operasi HPLC 1. Eluen 2. Laju Alir 3. Panjang Gelombang 4. Tekanan Maksimal C. Persiapan 1. Menyiapkan eluen yang digunkan. 2. Menghubungkan kabel power ke sumber listrik. 3. Menghidupkan DGU, LC, SIL, SPD, dan SCL. Kemudian menghidupkan PC dan printer. D. Instrumentasi 1. Mengklik dua kali icon Class VP pada desktop, lalu mengklik dua kali icon Instrument 1, menunggu hingga terdengar bunyi dan akan muncul Class VP. 2. Mengklik File, Method, New. 3. Mengklik Method, Instrument Setup. 4. Klik pump. Isi parameter pompa (flow, pmax, dll) 5. Klik SPD 10 AVP (Det. A). Isi parameter detector (D2, wavelength, chl, acquistion) chanel on, Run, Time dll. 6. Mengklik File, Method, Save as, dan memilih folder method, mengisi nama file, dan mengklik Save. 7. Mengklik Download, Ok. 8. Mengklik tombol Instrument On/Off. 9. Menunggu selama 15 menit. 10. Mengklik Control, Preview Run, bila ada pertanyaan mengklik Yes. 11. Memperhatikan base line hingga lurus, jika belum lurus menunggu hingga lurus, lalu mengganti scale to dengan user defined, mengisi Y min dengan 0,1 dan Y max dengan 0,4 lalu klik Apply OK, lalu klik Xeros SPD. 12. Mengetahui derajat Base Line, klik icon threshold, klik batas waktu yang diinginkan dengan nilai slope akan muncul, klik cancel, klik control, stop Run. : methanol / air = 70 / 30 : 1 ml/menit : 254 nm : 250 kgf/cm2

E. Memulai Injeksi Tunggal 1. Mengklik Control, Single Run, dan mengisi parameter smpel ID, Data Path (harus diisi C:\Class VP\Data), Data File, Vial (sesuai dengan posisi vial dalam autosampel), dan konsentrasi. Klik start, bila ada pertanyaan klik yes. Analisa akan berlangsung biarkan hingga selesai. 2. Melakukan analisis yang sama pada sampel standar dan sampel yang berbeda konsentrasinya. F. Mematikan HPLC 1. Mengklik icon Instrument On/Off untuk mematikan system instrument. 2. Mengklik File, Method, Open, memilih file, Ok. 3. Mengklik control, download method, OK. 4. Memindahkan selection filter (tubing A) larutan pencuci catatan sebagai larutan pencuci menggunakan larutan buffer, sebelum mencuci dengan methanol kolom harus dicuci dengan menggunakan aquabides. 5. Mengklik icon Instrumen On/Off untuk mengaktifkan sistem instrumen-catatan sebagai larutan pencuci menunggu hingga kurang lebih 30 menit, untuk analisis menggunakan buffer sebelum dicuci dengan metanol, kolom harus dialiri dengan aquabides dengan laju alir 1 ml.menit selama kurang lebih 1 jam lalu dialiri dengan methanol. 6. Menutup semua menu pada PC lalu Shut Down PC.

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Data Pengamatan Tabel 3.1.1 Data Pengamatan Paracetamol Konsentrasi (ppm) 500 400 300 200 100 Retention time 2,208 2,192 2,192 2,192 2,200 Area 80204042 39521739 32069815 29545237 6747805 Height 2196749 1074368 862568 787422 183287

Tabel 3.1.2 Data Pengamatan Biogesic Konsentrasi (ppm) 500 400 300 3.2 Data Perhitungan Konsentrasi sampel Kadar Paracetamol dalam sampel = 178,36 ppm = 35,318 % Retention time 2,183 2,200 2,192 Area 26348836 23812080 24778782 Height 839863 776042 627889

Penentuan konsentrasi sampel dengan menggunakan regresi linear : X = 185,9 ppm 3.3 Pembahasan Pada percobaan ini, HPLC digunakan untuk analisa kuantitatif suatu sampel. Yaitu menentukan konsentrasi dari komponen yang telah diketahui senyawanya dalam sampel. Pada analisa menggunakan HPLC, terdapat kromatogram berupa grafik hubungan antara respon (mV) dan waktu, dimana luas puncak/tinggi puncak kromatogram berbanding lurus dengan massa komponen tersebut dalam campuran.

Untuk mengetahui konsentrasi salah satu komponen dari suatu sampel maka perlu dibuat larutan standar sebagai pembanding, kemudian larutan standar dianalisis dengan HPLC dan menghasilkan suatu kromatogram lalu berdasarkan kromatogram tersebut dibuat kurva standar yang merupakan kurva hubungan antara luas puncak da konsentrasi larutan standar. Pada percobaan ini larutan standar adalah Paracetamol murni dengan konsentrasi 500, 400, 300, 200 dan 100 ppm. Kemudian, setelah dibuat kurva standar, maka untuk mengetahui konsentrasi salah satu komponen salam sampel dihitung dengan interpolasi dan untuk mengetahui kadarnya, menggunakan rumus : Berdasarkan perhitungan, konsentrasi Paracetamol dalam Biogesic adalah 178,36 ppm atau 185,9 ppm. Dan kadar Paracetamol dalam Biogesic adalah 35,318 %.

BAB IV PENUTUP

4.1. Kesimpulan Kadar paracetamol dalam biogesic adalah 35,318%.

DAFTAR PUSTAKA

Harjadi, W. 1990.Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta : PT Gramedia Tim Penyusun. 2009. Penuntun Praktikum Analitik Instrument.Samarinda : Politeknik Negeri Samarinda

PERHITUNGAN1. Menghitung Konsentrasi Sampel Sampel Paracetamol C standar A standar C sampel A sampel = 200 ppm = 29545237 =? = 26348836

Data diatas diambil dari tabel data pengamatan, yang dekat luas puncaknya dengan larutan sampel. C sampel =

Mg sampel

= 178,36 ppm x 0,1 L = 17,836 mg

Kadar Paracetamol dalam sampel

2. Penentuan konsentrasi sampel dengan menggunakan regresi linear diketahui : Y Y1 Y2 X1 X2 Ditanya Jawab = 26348836 = 6747805 = 29545237 = 100 = 200 = X sampel ? =

= =X

== 185,9 ppm

area90000000 80000000 70000000 60000000 50000000 40000000 30000000 20000000 10000000 0 0 100 y = 156889x - 9E+06 R = 0.8588

Area

area Linear (area)

200

300

400

500

600

Konsentrasi (ppm)