TESIS

HUBUNGAN POSITIF EKSPRESI

CYCLOOXYGENASE-2 DENGAN MICROVESSEL

DENSITY

PADAUNDIFFERENTIATEDCARCINOMANASOPHAR

YNXDI RSUP SANGLAH DENPASAR

MADE DWI HARTAYATI

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR

2015

i

TESIS

HUBUNGAN POSITIF EKSPRESI

CYCLOOXYGENASE-2 DENGAN MICROVESSEL

DENSITY PADA UNDIFFERENTIATED CARCINOMA

NASOPHARYNX DI RSUP SANGLAH DENPASAR

MADE DWI HARTAYATI

1014098103

PROGRAM MAGISTER

PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR

2015

ii

HUBUNGAN POSITIF EKSPRESI

CYCLOOXYGENASE-2 DENGAN MICROVESSEL

DENSITY PADA UNDIFFERENTIATED CARCINOMA

NASOPHARYNX DI RSUP SANGLAH DENPASAR

Tesisuntuk Memperoleh Gelar Magister pada ProgramMagister, Program Studi Ilmu Biomedik

Program Pascasarjana Universitas Udayana

MADE DWI HARTAYATI

1014098103

PROGRAM MAGISTER

PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR

2015

iii

Lembar Persetujuan Pembimbing

TESIS INI TELAH DISETUJUI

PADA TANGGAL 20 OKTOBER 2015

Pembimbing I Pembimbing II

Dr.dr.I Gusti Ayu Sri Mahendra Dewi, Sp.PA(K) dr. Moestikaningsih, Sp.PA(K)

NIP 196502011996012001 NIP 194508020969022001

Mengetahui

Ketua Program Studi

Pendidikan Dokter Spesialis-1 Patologi Anatomi

Fakultas Kedokteran Universitas Udayana/RSUP Sanglah Denpasar

DR. dr. I Gusti Ayu Sri Mahendra Dewi, Sp.PA (K)

NIP 196502011996012001

iv

Lembar Penetapan Panitia Penguji

Tesis Ini Telah Diuji

Pada13 Oktober 2015

Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana,

Ketua : DR. dr. I Gusti Ayu Sri Mahendra Dewi, Sp.PA (K)

Anggota :

1. dr. Moestikaningsih, Sp.PA (K)

2. dr. AAAN. Susraini, Sp.PA (K)

3. dr. Luh Putu Iin Indrayani, Sp.PA (K)

4. Prof. dr. N. Tigeh Suryadhi, MPH, PhD

Surat Pernyataan Bebas Plagiat

v

Nama : dr. Made Dwi Hartayati

NIM : 1014098103

Program Studi : Magister Ilmu Biomedik (Combine-Degree)

Judul : Hubungan positif ekspresi cyclooxygenase-2 dengan

microvessel density pada undifferentiated carcinoma

nasopharynx di RSUP Sanglah Denpasar

Dengan ini menyatakan bahwa karya ilmiah Tesis ini bebas plagiat.

Apabila di kemudian hari terbukti terdapat plagiat dalam karya ilmiah ini, maka

saya bersedia menerima sanksi sesuai peraturan Mendiknas RI No. 17 tahun 2010

dan peraturan perundang-undang yang berlaku.

Denpasar, Oktober 2015

Yang membuat pernyataan,

(dr. Made Dwi Hartayati)

vi

UCAPAN TERIMA KASIH

Pertama-tama perkenankanlah penulis memanjatkan puji syukur kepada Tuhan Yang

Maha Esa atas semua berkat, rahmat dan anugerahNya sehingga penulis dapat

menyelesaikan tesis ini.Penulis sangat menyadari bahwa penulis tidak mungkin dapat

menyelesaikan tesis ini tanpa bantuan banyak pihak. Pada Kesempatan ini,

perkenankanlah penulis menghaturkan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya dan

penghargaan kepada Dr. dr. I Gusti Ayu Sri Mahendra Dewi, Sp.PA (K) selaku

pembimbing I dan Ketua Program Studi Ilmu Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran

Universitas Udayana periode 2014-2018 yang telah memberikan kesempatan

mengikuti program pendidikan spesialisasi, memberikan bimbingan, masukan dan

pengarahan dan koreksi selama menjalani pendidikan spesialisasi maupun dalam

penyelesaian tesis ini, dr.Moestikaningsih, Sp.PA (K) selaku pembimbing II dan

Ketua Program Studi Ilmu Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas

Udayana Periode 2009-2014 yang telah memberikan kesempatan mengikuti program

pendidikan spesialisasi, memberikan petunjuk, nasehat serta bimbingan selama

menjalani pendidikan spesialisasi maupun dalam penyelesaian tesis ini. Penulis juga

menyampaikan rasa terima kasih yang tidak terhingga dan penghargaan kepada dr.

AAAN. Susraini, Sp.PA (K) sebagai Kepala Bagian/SMF Patologi Anatomi Fakultas

Kedokteran Universitas Udayana/RSUP Sanglah Denpasar Periode 2014-2018

sekaligus tim penguji yang telah memberikan kesempatan mengikuti program

pendidikan spesialisasi, memberikan bimbingan, masukan dan pengarahan selama

vii

menjalani pendidikan spesialisasi maupun dalam penyelesaian tesis ini. Penulis juga

menyampaikan rasa terima kasih yang tidak terhingga dan penghargaan kepada dr.

Luh Putu Iin Indrayani Maker, Sp.PA(K) selaku Kepala Instalasi Laboratorium

Patologi Anatomi Rumah Sakit Sanglah Denpasar sekaligus tim penguji yang telah

memberikan kesempatan mengikuti program pendidikan spesialisasi, memberikan

bimbingan, petunjuk, nasehat selama menjalani pendidikan spesialisasi dan

memberikan fasilitas dan ijin kepada penulis untuk melakukan penelitian ini. Ucapan

terima kasih juga penulis sampaikan untuk Prof. dr. N. Tigeh Suryadhi, MPH, PhD

selaku tim penguji yang telah banyak sekali membantu penulis dengan memberikan

bimbingan, dorongan, semangat, masukan, saran dan koreksi dari awal pendidikan

hingga selesainya tesis ini. Selain itu penulis juga menyampaikan rasa terima kasih

kepada :

1. Rektor Universitas Udayana, Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, SpPD-KEMD,

FINASIM dan Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Udayana, Prof. Dr. dr.

Putu Astawa, SpOT (K), M.Kes yang memberikan kesempatan dan fasilitas untuk

mengikuti dan menyelesaikan Program Magister Pascasarjana dan Program

Pendidikan Dokter Spesialis I di Universitas Udayana.

2. Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana, Prof. Dr. dr. A. A. Raka

Sudewi, SpS (K), atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan untuk menjadi

mahasiswa Program Pascasarjana Universitas Udayana.

viii

3. Dr. dr Gede Indraguna Pinatih, MSC, SpGK selaku Ketua Program Studi Ilmu

Biomedik (Combined Degree) Program Pascasarjana Universitas Udayana yang

telah memberikan kesempatan mengikuti program pendidikan Combined Degree.

4. Direktur RSUP Sanglah Denpasar, dr. Anak Ayu Saraswati, M.Kes atas

kesempatan dan fasilitas yang diberikan untuk melanjutkan pendidikan di Bagian

Ilmu Patologi Anatomi dan melakukan penelitian di RSUP Sanglah Denpasar.

5. dr. Ni Wayan Winarti, Sp.PA, sebagai Kepala Bagian/SMF Patologi Anatomi

Fakultas Kedokteran Universitas Udayana/RSUP Sanglah Denpasar periode

2009-2014 yang telah memberikan kesempatan mengikuti program pendidikan

spesialisasi dan memberikan bimbingan selama menjalani pendidikan spesialisasi.

6. Seluruh staf dosen/pengajar di Bagian/SMF Patologi Anatomi Fakultas

Kedokteran Universitas Udayana/RSUP Sanglah dan seluruh dosen Pascasarjana

Program Magister Ilmu Biomedik Combined Degree, yang telah membimbing,

memberikan masukan, nasehat, petunjuk dan bekal pendidikan dari awal

pendidikan hingga terselesaikannya tesis ini.

7. dr. Kadek Pramesti Dewi, Sp.PA yang telah banyak memberikan masukan dan

saran serta dorongan semangat selama penulis menyelesaikan tesis ini.

8. Drs. I Ketut Tunas, Msi, yang telah membantu dan memberi masukan saran

dalam pengolahan data dan statistik dari awal hingga akhir penulisan tesis ini.

9. Seluruh rekan-rekan sejawat residen dan senior residen Patologi Anatomi

Universitas Udayana atas bantuan, bimbingan dan kerjasamanya selama ini serta

ix

kepada seluruh staf karyawan di Bagian/SMF Patologi Anatomi FK Unud/RSUP

Sanglah Denpasar atas bantuan dan kerjasamanya selama ini.

Penulis memohon maaf yang sebesar-besarnya apabila selama menjalankan

pendidikan spesialisasi dan selama proses penyelesaian tesis ini penulis banyak

membuat kesalahan yang membuat pembimbing, tim penguji dan seluruh staf

dosen merasa tidak nyaman.

Rasa syukur, terima kasih yang sebesar-besarnya dan sujud penulis

persembahkan kepada orangtua tercinta, Drs. I Nengah Musta (Alm) dan Ni

Wayan Sukardi, BA yang dari lahir hingga sekarang selalu merawat, memberikan

doa, perhatian, kasih sayang, bekal pendidikan serta semangat dan dukungan yang

luar biasa kepada penulis. Terima kasih pula atas doa dan dukungannya kepada

kakak Gede Adi Hartana, SE. Akhirnya, penulis menyampaikan rasa terima kasih

yang sebesar-besarnya kepada suami tercinta dr. I Komang Budi Lastiawan,

Sp.An dan anak-anakku tercinta Gede Danendra Nayottama, Made Astaka

Widyadana, Nyoman Aldea Listiaputri atas doa, cinta kasih, semangat, dukungan,

perhatian dan pengertiannya kepada penulis setiap saat. Tak lupa penulis juga

mengucapkan terima kasih atas doa dan dukungannya kepada seluruh keluarga

besar penulis dan seluruh pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

Semoga Tuhan Yang Maha Esa selalu melimpahkan rahmat-Nya kepada kita

semua.

Denpasar, Oktober 2015

Penulis

x

ABSTRAK

HUBUNGAN POSITIF EKSPRESI CYCLOOXYGENASE-2 DENGAN

MICROVESSEL DENSITY PADA UNDIFFERENTIATED CARCINOMA

NASOPHARYNX DI RSUP SANGLAH DENPASAR

Tumor memerlukan pembentukan pembuluh darah baru atau angiogenesis

untuk dapat tumbuh dan bermetastasis. Angiogenesis dapat dinilai dengan

menghitung microvessel density (MVD). Salah satu cara untuk menentukan

microvessel adalah dengan pengecatan imunohistokimia CD31. Cyclooxygenase-2

(COX-2) adalah faktor potensial penting pada angiogenesis. Tujuan penelitian ini

adalah mengetahui hubungan ekspresi COX-2 dengan MVD pada undifferentiated

carcinoma nasopharynx di RSUP Sanglah Denpasar.

Penelitian ini menggunakan metode analitik potong lintang. Sampel penelitian

adalah sediaan blok parafin penderita undifferentiated carcinoma nasopharynx yang

diperiksa secara histopatologi pada Bagian/SMF Patologi Anatomi FK UNUD/RSUP

Sanglah Denpasar dan Laboratorium Patologi Anatomi FK Universitas Gadjah

Mada/RSUP dr.Sardjito, Yogyakarta dari 1 Januari 2014 sampai dengan 31 Agustus

2014. Diagnosis ulang sediaan histopatologi dilakukan dengan pengecatan rutin H&E

untuk mendapatkan sampel yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi sehingga

tercapai jumlah 31 sampel.Selanjutnya dilakukan pulasan imunohistokimia COX-2

dan CD 31 untuk menentukan microvessel pada seluruh sampel.Kemudian hasil

dianalisis dengan uji Pearson.

Ekspresi COX-2 positif ditemukan pada 24 (77,42%) subyek dan dijumpai

negatif pada 7 (22,59%). Ditemukan 22 (70,97%) kasus undifferentiated carcinoma

nasopharynx dengan MVD tinggi dan 9 (29,03%) dengan MVD rendah. Ditemukan

adanya korelasi positif ekspresi COX-2 dengan MVD (r = 0,868; p = 0,001).

Pada penelitian ini, ditemukan adanya hubungan positif antara ekspresi COX-

2 dan MVD pada undifferentiated carcinoma nasopharynx.

Kata kunci :undifferentiated carcinoma nasopharynx, Cyclooxygenase-2, Microvessel

density.

xi

ABSTRACT POSITIVE CORRELATION BETWEEN EXPRESSION

CYCLOOXYGENASE-2 AND MICROVESSEL DENSITY IN UNDIFFERENTIATED CARCINOMA NASOPHARYNX AT RSUP

SANGLAH DENPASAR

Tumors require new blood vessel formation or angiogenesis in order to grow and metastasize. Angiogenesis can be assessed by counting the microvessel density (MVD). One way to determine microvessel is the CD31 immunohistochemical staining. Cyclooxygenase-2 (COX-2) is a potentially important factor in angiogenesis.The aim of this study was to prove the correlation between expression COX-2 and MVD in undifferentiated carcinoma nasophrynx at RSUP Sanglah Denpasar.

This study used cross-sectional analytic method . The sample were paraffin block preparation of patients with undifferentiated carcinoma of the nasopharynx were examined by histopathology in Pathology Anatomy Departement, Medical Faculty Udayana University/RSUP Sanglah Denpasar and Laboratory of Anatomical Pathology, Faculty of Medicine, University of Gadjah Mada/DR.Sardjito Hospital, Yogyakarta from January 1, 2014 to August 31, 2014. Histopathological diagnosis performed on preparations with routine H & E staining to obtain samples that met the inclusion and exclusion criteria in order to reach the number of 31 samples. Subsequently immunohistochemical staining was performed for COX-2 and CD 31 to determined microvessel on the entire sample. Then the results were analyzed by Pearson test. COX-2 positive expression were found in 24 (77.42%) subjects were found negative in 7 (22.59%). Twenty two cases (70.97%) cases of undifferentiated carcinoma of the nasopharynx with high MVD and 9 (29.03%) with low MVD. There was positive correlation expression of COX - 2 with MVD ( r = 0.868 ; p = 0.001 ) . In this study , found a positive correlation between the expression of COX- 2 and MVD in undifferentiated carcinoma nasopharynx Keywords: undifferentiated carcinoma nasopharynx, cylooxygenase-2, microvessel density

xii

DAFTAR ISI

halaman

SAMPUL DALAM .................................................................................. i

PRASYARAT GELAR ............................................................................ ii

LEMBAR PENGESAHAN ...................................................................... iii

LEMBAR PENETAPAN PANITIA PENGUJI ....................................... iv

SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT .......................................... v

UCAPAN TERIMA KASIH .................................................................... vi

ABSTRAK............................................................................................... x

ABSTRACT ............................................................................................ xi

DAFTAR ISI .......................................................................................... xii

DAFTAR TABEL ................................................................................... xvi

DAFTAR GAMBAR .............................................................................. xvii

DAFTAR SINGKATAN ......................................................................... xix

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................... xxiii

BAB I PENDAHULUAN .................................................................... 1

1.1 Latar Belakang .................................................................. 1

1.2 Rumusan Masalah ............................................................. 5

1.3 Tujuan Penelitian ............................................................... 6

1.3.1 Tujuan Umum ........................................................... 6

1.3.2 Tujuan Khusus .......................................................... 6

1.4 Manfaat Penelitian .............................................................. 6

xiii

1.4.1 Manfaat Akademik ................................................... 6

1.4.2 Manfaat Praktis ......................................................... 6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................... 7

2.1 Anatomi Nasofaring .......................................................... 7

2.1.1 Anatomi .................................................................... 7

2.1.2 Sistem Aliran Darah dan Sistem Saraf ....................... 9

2.1.3 Sistem Limfatik ........................................................ 11

2.2 Undifferentiated Nasopharynx Carcinoma ......................... 12

2.2.1 Epidemiologi ............................................................ 12

2.2.2 Etiologi ..................................................................... 13

2.2.3 Klasifikasi ................................................................. 17

2.2.4 Gambaran Klinis ........................................................ 18

2.2.5 Gambaran Morfologi ................................................. 20

2.2.5.1 Makroskopis ................................................... 20

2.2.5.2 Mikroskopis ................................................... 20

2.2.6 Pemeriksaan Penunjang ............................................. 22

2.2.6.1 Pemeriksaan klinis ......................................... 22

2.2.6.2 Radiologi ....................................................... 22

2.2.6.3 Serologi .......................................................... 23

2.2.6.4 Pemeriksaan patologi ..................................... 24

2.2.7 Penatalaksanaan ......................................................... 24

2.2.7.1 Radioterapi ..................................................... 24

2.2.7.2 Kemoterapi .................................................... 25

xiv

2.2.7.3 Operasi ........................................................... 25

2.2.7.4 Imunoterapi .................................................... 26

2.2.8 Prognosis ................................................................... 26

2.3 Cyclooxygenase-2 ................................................................ 27

2.3.1 Biologi cyclooxygenase ............................................. 27

2.3.2 Cyclooxygenase, prostaglandin, karsinoma ................ 29

2.3.3 Peranan Cox-2 pada karsinoma nasofaring ................. 30

2.3.4 Peranan Cox-2 pada angiogenesis .............................. 31

2.3.5 Ekspresi Cox-2 pada karsinoma nasofaring ................ 33

2.4 Imunohistokimia .................................................................. 35

BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS

PENELITIAN ......................................................................................... 39

3.1 Kerangka Berpikir ............................................................. 39

3.2 Konsep Penelitian .............................................................. 42

3.3 Hipotesis Penelitian ........................................................... 43

BAB IV METODE PENELITIAN .......................................................... 44

4.1 Rancangan Penelitian ........................................................ 44

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian ............................................ 45

4.3 Ruang Lingkup Penelitian ................................................. 45

4.4 Penentuan Sumber Data ..................................................... 45

4.4.1 Populasi .................................................................... 45

4.4.2 Sampel Penelitian ..................................................... 46

4.4.3 Kriteria Inklusi .......................................................... 46

xv

4.4.4 Kriteria Eksklusi ....................................................... 46

4.4.5 Besar Sampel ............................................................ 47

4.4.6 Teknik Pengambilan Sampel ..................................... 48

4.5 Variabel Penelitian ............................................................ 48

4.5.1 Klasifikasi Variabel .................................................. 48

4.5.2 Definisi Operasional Variabel ................................... 48

4.6 Bahan Penelitian ................................................................ 49

4.7 Instrumen Penelitian .......................................................... 50

4.8 Prosedur Penelitian ............................................................ 50

4.8.1 Cara Pengumpulan Data ............................................ 50

4.8.2 Prosedur Pemeriksaan Bahan .................................... 51

4.8.3 Alur Penelitian .......................................................... 56

4.9 Analisis Data ..................................................................... 57

BAB V HASIL PENELITIAN ................................................................. 58

5.1 Karakteristik Subyek Penelitian .......................................... 58

5.2 Ekspresi COX-2 dan MVD ................................................. 59

5.3 Uji Normalitas antara COX-2 dengan MVD ....................... 61

BAB VI PEMBAHASAN HASIL ............................................................ 66

6.1 Karakteristik Subyek Penelitian .......................................... 66

6.2 Hubungan antara COX-2 dengan MVD .............................. 67

BAB VII SIMPULAN DAN SARAN ...................................................... 71

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................. 72

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ 80

xvi

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Formula Digby ................................................................................. 19

Tabel 5.1 Distribusi Sampel berdasarkan jenis kelamin ..................................... 58

Tabel 5.2 Distribusi Sampel berdasarkan umur .................................................. 59

Tabel 5.3 Distribusi Sampel berdasarkan persentase sel dan ekspresi COX-2 .... 59

Tabel 5.4 Interpretasi Ekspresi COX-2 .............................................................. 60

Tabel 5.5 Microvessel Density sesuai dengan Ekspresi CD 31........................... 60

Tabel 5.6 Hubungan antara COX-2 dan MVD ................................................... 62

xvii

DAFTAR GAMBAR

halaman

2.1 Anatomi nasofaring ....................................................................... 9

2.2 Pendarahan nasofaring .................................................................. 10

2.3 Persarafan nasofaring ..................................................................... 11

2.4 Pathogenesis karsinoma nasofaring ............................................... 17

2.5 Undifferentiated Carcinoma “Regaud type” .................................. 21

2.6 Undifferentiated Carcinoma “Schmincke type” .............................. 22

2.7 Terapi karsinoma nasofaring .......................................................... 24

2.8 Metabolisme asam arakidonat melalui kerja COX-2 ....................... 28

2.9 Peranan Cox-2 pada perkembangan karsinoma ............................... 30

2.10 Hasil pewarnaan imunohistokimia COX-2 ..................................... 36

2.11 Hasil pewarnaan imunohistokimia CD 31 ...................................... 38

3.1 Bagan konsep penelitian ................................................................. 42

4.1 Rancangan penelitian ..................................................................... 44

4.2 Bagan alur penelitian ..................................................................... 56

5.1 ROC dari ekspresi CD 31 ............................................................... 61

5.2 Hasil pewarnaan imunohistokimia COX-2 pada undifferentiated

nasopharynx carcinoma terpulas pada <10% sel ganas dengan

intensitas kuat ................................................................................ 62

5.3 Hasil pewarnaan imunohistokimia COX-2 pada undifferentiated

nasopharynx carcinoma terpulas pada 10-50% sel ganas dengan

intensitas kuat ................................................................................ 63

xviii

5.4 Hasil pewarnaan imunohistokimia COX-2 pada undifferentiated

nasopharynx carcinoma terpulas pada >50% sel ganas dengan

intensitas kuat ................................................................................ 63

5.5 Hasil pewarnaan imunohistokimia dengan hasil MVD tinggi ......... 64

5.6 Hasil pewarnaan imunohistokimia dengan hasil MVD rendah ........ 64

5.7 Hasil pewarnaan imunohistokimia MVD pada intraitumoral .......... 65

xix

DAFTAR SINGKATAN

AA = Asam Arakhidonat

ACIF = Anticomplement and Immunoflorecent

AJCC = Americant Joint Committee on Cancer

BCl2 = B Cell Lymphoma-2

BFGF = Basic Fibroblast Growth Factor

CD31 = Cluster of Differentiation 31

COX = Cyclooxygenase

COX-1 = Cyclooxygenase-1

COX-2 = Cyclooxygenase-2

COX-3 = Cyclooxygenase-3

CT = Computerized Tomography

DNA = Deoxyribonucleic Acid

EBNA = EBV- determined Nuclear Antigen

EGFR = Epithelial Growth Factor Receptor

FITC = Fluorescein Isothiocyanate

HE = Hematoxillin Eosin

HLA = Human Leukocyte Antigens

IARC = International Agency for Research on Cancer

KNF = Karsinoma Nasofaring

LMP = Latent Membran Protein

xx

MAPK = Mitogen Activated Protein Kinase

MEP = Major Excreted Protein

MMP = Matrix Metalloprotein

MGG = May-Grunwald Giemsa

MRI = Magnetic Resonance Imaging

mRNA = messenger Ribonucleic Acid

MVD = Microvessel Density

PCR = Polimerase Chain Reaction

PG = Prostaglandin

PGD2 = Prostaglandin D2

PGE2 = Prostaglandin E2

PGF2α = Prostaglandin F2α

PGG2 = Prostaglandin G2

PGH2 = Prostaglandin H2

PGHS = Prostaglandin H2 Synthesa

PGI2 = Prostaglandin I2

ROC = Receiver Operating Curve

RNA = Ribonucleic Acid

TXA2 = Tromboxan

UICC = Union International Centre Cancer

VCA = Viral Capsid Antigen

xxi

VEB = Virus Epstein Barr

VEGF = Vascular Endothelial Growth Factor

WHO = World Health Organization

xxii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Penilaian ekspresi COX-2 dan CD 31 ............................................ 80

Lampiran 2. Keterangan kelaikan etik .............................................................. 82

Lampiran 3. Surat ijin ....................................................................................... 83

Lampiran 4. Data subyek penelitian .................................................................. 84

Lampiran 5. Uji Normalitas data umur, COX-2 dan CD 31 ............................... 85

Lampiran 6. Analisis deskriptif Jenis kelamin dan umur .................................... 85

Lampiran 7. Uji korelasi Pearson antara COX-2 dan CD 31 .............................. 86

Lampiran 8. Kurva ROC Data CD 31 ................................................................ 86

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang

Karsinoma nasofaring (KNF) merupakan tumor ganas yang berasal dari epitel

mukosa nasofaring dengan predileksi di fossa Rossenmuller. Kesulitan diagnosis dini

pada karsinoma nasofaring sampai saat ini masih tetap merupakan masalah besar.

Hal ini disebabkan oleh karena gejala penyakit yang tidak khas dan letak tumor yang

tersembunyi sehingga sulit diperiksa.Hampir seluruh penderita datang dengan

stadium lanjut, bahkan sering datang dengan keadaan umum yang jelek.

Klasifikasi karsinoma nasofaring berdasarkan klasifikasi World Health

Organization (WHO) tahun 2005 adalah keratinizing squamous cell carcinoma,

nonkeratinizing carcinoma dibagi menjadi 2 yaitu differentiated carcinoma

nasopharynx dan undifferentiated carcinoma nasopharynx, dan basaloid squamous

carcinoma. Tipe histologi undifferentiated carcinoma nasopharynx merupakan tipe

yang paling sering diantara tipe yang lain dari karsinoma nasofaring yaitu 92% (Chan

et al., 2005).

Karsinoma nasofaring adalah tumor ganas yang sering terdapat di Asia

Tenggara termasuk Cina, Hongkong, Singapura, Malaysia dan Taiwan dengan

insiden antara 10 – 53 kasus per 100.000 penduduk (Tse et al., 2006). Karsinoma

nasofaring (KNF) merupakan tumor ganas pada kepala dan leher yang terbanyak

ditemukan di Indonesia yaitu sekitar 60% dan menduduki urutan ke-5 dari seluruh

2

keganasan setelah tumor ganas mulut rahim, payudara, kelenjar getah bening, dan

kulit (Chou et al., 2008). Berdasarkan data registrasi kanker tahun 2010 di Bali

karsinoma nasofaring menempati peringkat kelima dari seluruh karsinoma pada laki-

laki dan perempuan dengan jumlah 70 kasus, pada laki-laki menempati peringkat

pertama dengan jumlah 47 kasus dari seluruh karsinoma (Anonim, 2010). Angka

prevalensi KNF di Indonesia adalah 3,9 kasus per 100.000 penduduk per tahun.

Berdasarkan data International Agency for Research on Cancer (IARC) pada tahun

2002 ditemukan sekitar 80.000 kasus baru KNF di seluruh dunia dan sekitar 50.000

kasus meninggal diantaranya adalah berasal dari Cina sekitar 40%. Tingkat ketahanan

hidup lima tahun penderita karsinoma nasofaring di Indonesia hanya sekitar 6,4 %

dan angka harapan hidup rata-rata 5 tahun penderita yang diberikan terapi radiasi

adalah 86%, 59%, 49% dan 29% pada stadium I, II, III dan IV (Chou et al., 2010).

Karsinoma nasofaring mempunyai perangai berbeda dibandingkan dengan

keganasan pada daerah lain di kepala dan leher, karena sifatnya yang sangat invasif

dan sangat mudah bermetastasis sering ditemukan pada stadium yang lanjut

(Brennan, 2006). Diagnosis pasti karsinoma nasofaring memerlukan biopsi

lesi.Faktor yang diduga terkait dengan timbulnya karsinoma nasofaring adalah

genetik, faktor lingkungan dan Virus Ebstein Barr (VEB).Hampir semua karsinoma

nasofaring mengandung VEB. Pada undifferentiated carcinoma nasopharynx, VEB

menginfeksi sel epitel nasofaring bagian posterior fossa Rossenmuller’s di

Waldeyer;s ring. Infeksi VEB dapat terjadi sebelum neoplasma dan berkembang

menjadi keganasan (Mantovani et al., 2008).Pemeriksaan serologi dan

3

imunohistokimia belum rutin dilakukan (Cho, 2007).Hal ini menyebabkan

penatalaksanaan karsinoma nasofaring menjadi sulit dan belum memberi hasil yang

memuaskan (Garden, 2010).Pada stadium dini, radioterapi masih merupakan

pengobatan pilihan yang dapat diberikan secara tunggal dan memberikan angka

kesembuhan yang cukup tinggi.Pada stadium lanjut, diperlukan terapi tambahan

kemoterapi yang dikombinasikan dengan radioterapi (Feng et al., 2010). Salah satu

prognosis buruk pada undifferentiated carcinoma nasopharynx adalah dijumpainya

banyak pembuluh darah kecil (Roezin, 2005).

Angiogenesis merupakan proses pembentukan pembuluh darah baru yang

terjadi secara normal dan sangat penting dalam proses pertumbuhan dan

perkembangan. Pertumbuhan jaringan pembuluh darah baru sangat penting untuk

proliferasi sel kanker, karena proliferasi bergantung pada suplai oksigen, zat makanan

dan pembuangan zat sisa yang adekuat.Angiogenesis juga berperan penting dalam

penyebaran sel kanker. Sel-sel kanker dapat menembus masuk kedalam pembuluh

darah ataupun limfe, bersirkulasi melalui aliran vaskular, dan kemudian berproliferasi

pada tempat yang lain atau metastasis (Nishida et al., 2006). Pendekatan secara

patologis untuk memperkirakan adanya suatu angiogenesis adalah dengan perkiraan

secara mikroskopik densitas pembuluh darah (microvessel density/MVD) dari

jaringan tumor melalui pemeriksaan immunohistokimia (Choi et al.,

2005).Cyclooxygenase-2 (COX-2) merupakan faktor potensial yang penting pada

angiogenesis tumor.Cyclooygenase-2 secara konsisten terekspresi dalam

4

pembentukan pembuluh darah baru dalam tumor dan pembuluh darah disekitar tumor

(Choi et al., 2005).

Cyclooxygenase (COX) merupakan enzim penting pada jalur biositetik

prostaglandin, tromboxan dan prostasiklin dari asam arakhidonat.Ekspresi seluler

COX-2 meningkat normal pada stadium awal karsinogenesis dan selama

perkembangan serta pertumbuhan invasif tumor (Xu et al., 2006).Cyclooxygenase-2

terekspresi pada beberapa tumor dan dalam perkembangannya terbukti sebagai

penyebab karsinogenesis. Prostaglandin dan enzim COX-2 merupakan mediator

inflamasi yang terlibat dalam proses angiogenesis. Inflamasi merupakan respon

fisiologis tubuh terhadap iritasi maupun stimuli yang mengubah homeostasis

jaringan. Inflamasi akut dapat mengalami pemulihan sempurna jika tubuh mampu

mengeliminasi penyebabnya, tetapi jika tubuh tidak mampu mengeliminasi akan

berlanjut menjadi inflamasi kronis. Inflamasi kronis menyebabkan kematian sel dan

tubuh mengkompensasi dengan peningkatan pembelahan sel. Bila diakselerasi dapat

memudahkan terjadinya kesalahan pembentukan Deoxyribonucleic acid (DNA) dan

mutasi (mutagen).Reaksi inflamasi dapat meningkatkan pelepasan sitokin dan faktor

pertumbuhan.Secara umum sitokin ikut berperan pada regulasi protein dan

meregulasi COX-2 yang merupakan enzim untuk sintesis prostaglandin (Soo, 2005).

Induksi COX-2 atau ekspresi berlebihan berhubungan dengan peningkatan

produksi prostaglandin-E2 (PGE2).Prostaglandin E2 menunjukkan adanya hubungan

antara perkembangan tumor dan biosintesis prostaglandin.Prostaglandin E2 juga

penting pada invasi tumor. Prostaglandin E2 dapat meningkatkan kadarVascular

5

Endothelial Growth Factor (VEGF). Vascular Endothelial Growth Factor

memproduksi matrix metalloprotein (MMP) untuk memulai suatu proses

angiogenesis. Matrix Metalloprotein memecah ekstraseluler matrix.Hal ini

merangsang migrasi sel endotel.Sel endotel mulai membelah begitu mereka

bermigrasi ke jaringan sekitarnya.Kemudian tersusun menjadi pembuluh darah baru

dan kemudian berkembang menjadi pembuluh darah matur (Nishida et al., 2006).

Penelitian Hasibuan (2014) menemukan adanya korelasi positif sedang antara

ekspresi COX-2 dan MVD pada karsinoma nasofaring dengan koefisien relasi 0,559

dengan tingkat kemaknaan (p=0,005) antara tingkat ekspresi COX-2 dengan

gambaran angiogenesis. Sedangkan pada penelitian Tan dan Putti (2005) menyatakan

microvessel density berkisar antara 1-59 (rata-rata 24,2), namun tidak dijumpai

adanya perbedaan yang bermakna MVD pada kelompok COX-2 positif dengan COX-

2 negatif (p=0,774).

Dengan memperhatikan latar belakang maka peneliti tertarik untuk meneliti

hubungan antara ekspresi COX-2 dengan angiogenesis, yang dinilai melalui MVD

padaundifferentiated carcinoma nasopharynx di RSUP Sanglah Denpasar yang

nantinya diharapkan dapat dipakai sebagai salah satu faktor prediktif.

1.2. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah maka disusun rumusan masalah penelitian

adalah: apakah terdapat hubungan positif ekspresi COX-2dengan MVD

padaundifferentiated carcinoma nasopharynx di RSUP Sanglah Denpasar?

6

1.3.Tujuan Penelitian

Untuk membuktikan adanya hubungan positif antara ekspresi COX-2 dengan MVD

pada undifferentiated carcinoma nasopharynx di RSUP Sanglah Denpasar.

1.4. Manfaat Penelitian

1.4.1. Manfaat akademik

1. Memberikan informasi data epidemiologi tentang ekspresi COX-2dan MVD

pada undifferentiated carcinoma nasopharynx di RSUP Sanglah Denpasar.

2. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan masukan atau tambahan

pengetahuan dalam pemanfaatan COX-2 sebagai faktor prediktif undifferentiated

carcinoma nasopharynx.

1.4.2. Manfaat praktis

Memberikan informasi kepada klinisi bahwa hasil pemeriksaan

imunohistokimia COX-2 dapat digunakan sebagai bahan pertimbangan dalam

pengobatanundifferentiated carsinoma nasopharynxdengan COX-2 inhibitor.

7

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Anatomi Nasofaring

Nasofaring merupakan lubang sempit yang terletak pada belakang rongga

hidung.Bagian atap dan dinding belakang dibentuk oleh basi sphenoid, basi occiput

dan ruas pertama tulang belakang.Bagian depan berhubungan dengan rongga hidung

melalui koana. Orificium dari tuba Eustachian berada pada dinding samping dan pada

bagian depan belakang terdapat ruangan berbentuk koana yang disebut dengan torus

tubarius (Roezin, 2007).

2.1.1 Anatomi

Fossa rossenmuller terletak pada bagian atas dan samping dari torus tubarius

merupakan tempat asal munculnya sebagian besar karsinoma nasofaring dan paling

sensitif terhadap penyebaran keganasan pada nasofaring (Lu, 2006).

Fossa rossenmuler mempunyai hubungan anatomi dengan sekitarnya,

sehingga berperan dalam kejadian dan prognosis KNF. Tepat di atas apeks dari fossa

rossenmulerterdapat foramen laserum, yang berisi arteri karotis interna dengan

sebuah lempeng tipis fibrokartilago. Lempeng ini mencegah penyebaran KNF ke

sinus kavernosus melalui karotis yang berjalan naik (Roezin, 2007).

8

Fossa rossenmuler yang terletak di apeks dari ruang parafaring ini merupakan

tempat menyatunya beberapa fasia yang membagi ruang ini menjadi 3 kompartemen,

yaitu : 1) kompartemen prestiloid, berisi a. maksilaris, n. lingualis dan n. alveolaris

inferior; 2) kompartemen poststiloid, yang berisi sarung karotis; dan 3) kompartemen

retrofaring, yang berisi kelenjar Rouviere. Kompartemen retrofaring ini berhubungan

dengan kompartemen retrofaring kontralateral, sehingga pada keganasan nasofaring

mudah terjadi penyebaran menuju kelenjar limfa leher kontralateral.Lokasi fossa

rossenmuler yang demikian itu dan dengan sifat KNF yang invasif, menyebabkan

mudahnya terjadi penyebaran KNF ke daerah sekitarnya yang melibatkan banyak

struktur penting sehingga timbul berbagai macam gambaran klinis (Lu, 2006).

Lapisan mukosa ialah daerah nasofaring yang dilapisi oleh mukosa dengan

epitel kubus berlapis semu bersilia pada daerah dekat koana dan daerah di sekitar

atap, sedangkan pada daerah posterior dan inferior nasofaring terdiri dari epitel

skuamosa berlapis. Daerah dengan epitel transisional terdapat pada daerah pertemuan

antara atap nasofaring dan dinding lateral (Gambar 2.1). Lamina propria seringkali

diinfiltrasi oleh jaringan limfoid, sedangkan lapisa submukosa mengandung kelenjar

serosa dan mukosa (Roezin, 2007).

9

Gambar 2.1. Anatomi Nasofaring (Nancy, 2005)

2.1.2 Sistem Aliran Darah dan Sistem Saraf

Pembuluh darah arteri utama yang mensuplai daerah nasofaring adalah arteri

faringeal asendens, arteri palatina asendens, arteri palatina desendens, dan cabang

faringeal arteri sfenopalatina (Gambar 2.2).Semua pembuluh darah tersebut berasal

dari arteri karotis eksterna dan cabang-cabangnya. Pembuluh darah vena berada di

bawah membran mukosa yang berhubungan dengan pleksus pterigoid di daerah

superior dan fasia posterior atau vena jugularis interna di bawahnya (Nancy, 2005)

10

Gambar 2.2 Pendarahan Nasofaring (Nancy, 2005).

Daerah nasofaring dipersarafi oleh pleksus faringeal yang terdapat di atas otot

konstriktor faringeus media.Pleksus faringeus terdiri dari serabut sensoris saraf

glossofaringeus (IX), serabut motoris saraf vagus (X) dan serabut saraf ganglion

servikalis simpatikus (Gambar 2.3).Sebagian besar saraf sensoris nasofaring berasal

dari saraf glossofaringeus, hanya daerah superior nasofaring dan anterior orifisuim

tuba yang mendapat persarafan sensoris dari cabang faringeal ganglion sfenopalatina

yang berasal dari cabang maksila saraf trigeminus (V1) (Nancy, 2005).

11

Gambar 2.3. Persarafan Nasofaring (Nancy, 2005)

2.1.3 Sistem Limfatik

Nasofaring mempunyai pleksus submukosa limfatik yang luas.Kelompok

pertama adalah kelompok nodul pada daerah retrofaringeal yang terdapat pada ruang

retrofaring antara dinding posterior nasofaring, fasia faringobasilar dan fasia

prevertebra. Pada dinding lateral terutama di daerah tuba Eustachius paling kaya akan

pembuluh limfe. Aliran limfenya berjalan ke arah anterosuperior dan bermuara di

kelenjar retrofaringeal atau ke kelenjar yang paling proksimal dari masing-masing sisi

rantai kelenjar spinal dan jugularis interna, rantai kelenjar ini terletak di bawah otot

sternokleidomastoid pada tiap prosessus mastoid. Beberapa kelenjar dari rantai

12

jugular letaknya sangat dekat dengan saraf-saraf kranial terakhir yaitu saraf

IX,X,XI,XII. Metastase ke kelenjar limfe ini dapat terjadi sampai dengan 75%

penderita KNF, yang mana setengahnya datang dengan kelenjar limfe bilateral

(Roezin, 2007).

2.2 Undifferentiated carcinoma nasopharynx.

2.2.1 Epidemiologi

Angka kejadian karsinoma nasofaring cukup tinggi tergantung dari letak

geografisnya (Korcum et al., 2006). Berdasarkan data International Agency for

Research on Cancer (IARC) pada tahun 2002 ditemukan sekitar 80.000 kasus baru

KNF di seluruh dunia dan sekitar 50.000 kasus meninggal diantaranya adalah berasal

dari Cina sekitar 40% . Di Indonesia angka kejadian karsinoma nasofaring cukup

tinggi, yakni 4,7 kasus baru per tahun per 1000 penduduk dan memberikan hasil yang

beragam, dengan laki-laki lebih banyak menderita KNF daripada perempuan dengan

2,5:1. Kelompok umur yang terbanyak terjadi adalah pada umur 41-50 tahun

(Giordano et al., 2008). Berdasarkan data registrasi kanker tahun 2010 di Bali,

karsinoma nasofaring menempati peringkat kelima dari seluruh karsinoma pada laki-

laki dan perempuan dengan jumlah 70 kasus, pada laki-laki menempati peringkat

pertama dengan jumlah 47 kasus dari seluruh karsinoma. Umur rata-rata penderita

KNF yaitu 45-55 tahun. Rasio laki-laki : perempuan yaitu 2-3 : 1. Di Bali rasio umur

tebanyak usia 35-45 tahun sebanyak 13 kasus, yang kedua usia 45-54 tahun sebanyak

11 kasus, dan yang ketiga usia 55-64 tahun sebanyak 8 kasus (Anonim, 2010).

13

Insiden tertinggi dilaporkan berasal dari provinsi Guandong dan daerah Guangxi Cina

Selatan yaitu mencapai lebih dari 50 per 100.000 orang pertahun.Etnis Cina yang

bermigrasi ke luar negeri juga mempunyai angka insiden yang tinggi, tetapi etnis

Cina yang lahir di Amerika Utara, mempunyai angka insiden yang rendah

dibandingkan dengan yang lahir di Cina (Chou et al., 2008).Temuan ini

mengindikasikan bahwa faktor genetik, etnik, dan lingkungan memegang peranan

penting terhadap meningkatnya KNF (Korcum et al., 2006).

Angka kejadian karsinoma nasofaring di Singapura, persentase terbesar

mengenai masyarakat keturunan Tionghoa (18,5 per 100.000 penduduk) disusul oleh

keturunan Melayu (6,5% per 100.000) dan keturunan Hindustan (0,5 per 100.000).

Karsinoma nasofaring jarang terjadi di Amerika serikat dan Eropa, dengan angka

kejadian 1 per 100.000 penduduk per tahun (Lu, 2006)

2.2.2 Etiologi dan Faktor Risiko

Karsinoma nasofaring adalah suatu keganasan dengan etiologi

multifaktorial.Faktor yang diduga terkait dengan timbulnya karsinoma nasofaring

adalah genetik, faktor lingkungan dan Virus Ebstein Barr (Korcum et al., 2006).

1. Genetik

Walaupun karsinoma nasofaring bukan tumor genetik, kerentanan terhadap

karsinoma nasofaring pada kelompok masyarakat tertentu relatif menonjol, ras yang

banyak sekali menderitanya adalah bangsa China (Desen, 2008).Beberapa penulis

melaporkan adanya kecenderungan orang dengan tipe HLA tertentu dapat menderita

14

karsinoma nasofaring. Tingginya angka insiden KNF di daerah Cina Selatan, baik

yang tinggal di Cina atau yang sudah bermigrasi, dan angka insiden sedang pada

populasi keturunan Cina campuran, diduga mempunyai hubungan genetik dalam

terjadinya karsinoma nasofaring. Analisis genetik pada etnis China menunjukkan

Histo-Kompatibilitas Mayor pada lokus HLA-A2, B17 dan BW46 dengan

peningkatan risiko terjadinya karsinoma nasofaring sebanyak dua kali lipat. Tetapi

pada penelitan di Amerika Utara gagal menunjukkan lokus HLA dengan peningkatan

risiko peningkatan karsinoma nasofaring (Levine et al., 2008).

Polimorfik genetik dari gen CYP-2 F1 menunjukkan dapat terjadi pada daerah

Guandong-China. Ketika polimorfik genetik CYP-2 F1 diselidiki dan dibantu dengan

polimorfik genetik yang multipel dari satu atau beberapa gen lain maka berpotensial

untuk berkembang dan berprogresif menjadi karsinoma nasofaring. Gen XRCC-1

penting didalam DNA yang diperbaiki. Hipotesis bahwa nukleotida polimorfik

tunggal XRCC-1 (codons 194Arg → Trp dan 399Arg → Gln) dihubungkan dengan

risiko karsinoma nasofaring dan interaksi dengan rokok serta tembakau.Genotip

XRCC-1 Trp yang bervariasi berhubungan dengan risiko perkembangan karsinoma

nasofaring terutama pada pria yang merokok. Pada bagian lain, dengan adanya Cyclin

D1 (kunci regulasi dari siklus sel) dan diubahnya aktifitas menunjukkan

perkembangan karsinoma (Desen, 2008)

15

2. Lingkungan

Paparan ikan asin dan makanan yang mengandung volatile nitrosamine

berhubungan dengan terjadinya karsinoma nasofaring.Dan telah terbukti bahwa

mengkonsumsi ikan asin sejak anak-anak meningkatkan risiko KNF di Cina Selatan

(Can et al., 2005; Lin, 2006).

Faktor lingkungan lain yang merupakan faktor risiko terjadinya karsinoma

nasofaring adalah merokok. Orang yang merokok selama 10 tahun atau lebih

mempunyai risiko yang tinggi terhadap KNF. Penelitian menunjukkan adanya

paparan formaldehid bentuk uap dan asap yang terhirup berpengaruh paling besar

terhadap kejadian KNF, keduanya terbukti secara bersama-sama berpengaruh secara

signifikan terhadap kejadian KNF. Adanya radang kronik pada mukosa nasofaring

akan lebih mudah terpapar karsinogen lingkungan dan dapat menyebabkan karsinoma

nasofaring (Wee et al., 2010).

3. Virus Epstein Barr (VEB)

Virus Epstein-Barr adalah suatu virus yang sangat erat kaitannya dngan

timbulnya karsinoma nasofaring.Penderita karsinoma nasofaring terbukti terinfeksi

VEB dan genom virus dapat diidentifikasikan pada sel tumor.VEB merupakan suatu

virus gamma herpes yang mengandung DNA yang termasuk dalam keluarga herpes

viridae yang ditemukan oleh Ied Tony Epstein dan Yvone Barr pada tahun 1964.

Pada undifferentiated nasopharyng carcinoma, VEB menginfeksi sel epitel

nasofaring bagian posterior fossa Rosenmuller’s di Waldeyer’s ring.Walaupun

hubungan reseptor VEB pada sel epitel tidak tampak, tetapi permukaan protein

16

mengandung antigen yang dihubungkan dengan sel B. Reseptor CD21 dapat

diuraikan dan VEB banyak masuk ke sel nasofaring berupa igA-mediated

endocytosis. VEB dapat juga dideteksi pada karsinoma insitu, suatu prekursor

undifferentiated nasopharyngeal carcinoma. Infeksi laten VEB sangat penting dalam

perkembangan menuju displasia yang berat pada KNF. Displasia merupakan lesi awal

yang dapat terdeteksi, yang diperkirakan dipengaruhi oleh beberapa karsinogen

lingkungan.Hal ini berkaitan dengan kehilangan alel pada lengan pendek kromosom 3

dan 9 yang menyebabkan inaktivasi beberapa tumor suppressor genes, terutama p14,

p15, p16.Karsinogen yang berkaitan belum ditemukan dengan perkembangan

KNF.Area displasia ini merupakan asal dari tumor namun belum cukup untuk

menyebabkan perkembangan yang progresif. Pada stadium laten, infeksi VEB dapat

mengacu pada perkembangan displasia yang lebih berat. Didapatkan kerusakan gen

pada kromosom 12 dan kehilangan alel pada 11q, 13q, dan 16q dapat memicu

terjadinya kanker invasif dan metastasis sering dihubungkan dengan mutasi p53 dan

ekspresi chaderin yang menyimpang (gambar 2.4) (Korcum et al., 2006).

EBNA1 dan LMP1 yang merupakan produk onkogen VEB terbukti

menyebabkan transformasi dan imortalisasi limfosit B. Adanya partikel VEB pada

jaringan tumor spesimen biopsi penderita KNF secara konsisten, mendukung

hipotesis VEB sebagai faktor etiologi utama pada KNF (Hsiao et al., 2009).

17

Gambar 2.4 Pathogenesis karsinoma nasofaring (Tao, 2007)

2.2.3 Klasifikasi

Klasifikasi WHO tahun 1978 untuk karsinoma nasofaring (1) Keratinizing

squamous cell carcinoma ditandai dengan adanya keratin atau intercellular bridge

atau keduanya. (2) Non Keratinizing squamous cell carcinoma yang ditandai dengan

batas sel yang jelas (pavement cell pattern). (3) Undifferentiated carcinoma ditandai

oleh pola pertumbuhan sinsitial, sel-sel polygonal berukuran besar atau sel dengan

bentuk spindel, anak inti yang menonjol dan stroma dengan infiltrasi sel-sel radang

limfosit. Sedangkan klasifikasi WHO tahun 2005 membagi karsinoma nasofaring

menjadi (1) Keratinizing squamous cell carcinoma. Tipe KNF ini menunjukkan

18

diferensiasi skuamous dengan adanya intercellular bridges, dan keratin dalam

gambaran histologinya; (2) Nonkeratinizing carcinoma yang mencakup tipe

berdiferensiasi dan tipe tidak berdiferensiasi (undifferentiated). Tumor ini umumnya

lebih radiosensitif dan mempunyai hubungan yang kuat dengan EBV. (2.1)

Differentiated nonkeratinizing carcinoma. Sel-sel tumor menunjukkan diferensiasi

dengan maturasi sel skuamous.(2.2.) Undifferentiated carcinoma.Sel-sel tumor

dengan bentuk inti oval atau bulat vesikular dengan anak inti menonjol.Batas antar sel

tidak jelas dan dengan hubungan antar sel yang sinsitial; (3).Basaloid squamous cell

carcinoma.Merupakan tipe histologi yang jarang, terdiri dari komponen basaloid dan

komponen skuamous (Chan et al., 2005).

2.2.4. Gambaran Klinis

Gejala dini karsinoma nasofaring sulit dikenali oleh karena mirip dengan

infeksi saluran nafas atas.Gejala klinik pada stadium dini meliputi gejala hidung dan

gejala telinga.Ini terjadi karena tumor masih terbatas pada mukosa nasofaring.Timbul

keluhan pilek berulang dengan ingus yang bercampur darah.Kadang-kadang dapat

dijumpai epistaksis.Tumor juga dapat menyumbat muara tuba eustachius, sehingga

pasien mengeluhkan rasa penuh di telinga, rasa berdenging kadang-kadang disertai

dengan gangguan pendengaran.Gejala ini umumnya unilateral, dan merupakan gejala

yang paling dini dari karsinoma nasofaring.Sehingga bila timbul berulang-ulang

dengan penyebab yang tidak diketahui perlu diwaspadai sebagai karsinoma

nasofaring (Roezin, 2007).

19

Pada karsinoma nasofaring stadium lanjut gejala klinis lebih jelas sehingga

pada umumnya telah dirasakan oleh pasien, hal ini disebabkan karena tumor primer

telah meluas ke organ sekitar nasofaring atau mengadakan metastasis regional ke

kelenjar getah bening servikal (Roezin, 2007).

Menurut Formula Digby (Tabel 2.1), setiap gejala klinis mempunyai nilai

diagnostik dan berdasarkan jumlah nilai dapat ditentukan karsinoma nasofaring. Bila

jumlah nilai mencapai 50, diagnosis klinik karsinoma nasofaring dapat dipertanggung

jawabkan (Roezin, 2005).

Sekalipun secara klinik jelas karsinoma nasofaring, namun biopsi tumor

primer mutlak dilakukan, selain untuk konfirmasi diagnostik histopatologi, juga

menentukan subtipe histopatologi yang erat kaitannya dengan pengobatan dan

prognosis (Roezin, 2007).

Tabel 2.1. Formula Digby (Roezin, 2005)

GEJALA KLINIK NILAI

Dapat dilihat atau diraba tumor padat dalam nasofaring 25

Kelenjar limfe leher membesar 25

Gejala khas hidung (epistaksis, obstruksi) 15

Gejala khas telinga (kurang pendengaran, tinnitus) 5

Paralisis satu atau lebih syaraf otak (diplopia, neuralgia, trigeminus) 5

Sakit kepala mulai unilateral 5

Eksoptalmus unilateral/ bengkak di rahang/ bengkak di temporal 5

20

2.2.5 Gambaran Morfologi

2.2.5.1 Makroskopis

Tumor dapat berupa massa yang menonjol pada mukosa dan memiliki

permukaan halus, bernodul dengan atau tanpa ulserasi pada permukaan atau massa

yang menggantung dan infiltratif. Namun terkadang tidak dijumpai lesi pada

nasofaring (Chan et al., 2005).

2.2.5.2 Mikroskopis Undifferentiated carcinoma nasopharynx.

Pada pemeriksaan undifferentiated carcinoma nasopharynx memperlihatkan

gambaran sinsitial dengan batas sel yang tidak jelas,inti bulat sampai oval dan

vesikular, dijumpai anak inti. Sel-sel tumor sering tampak terlihat tumpang

tindih.Beberapa sel tumor dapat berbentuk spindel.Dijumpai infiltrat sel radang dalam

jumlah banyak, khususnya limfosit, sehingga dikenal juga sebagai

lymphoepithelioma.Dapat juga dijumpai sel-sel radang lain, seperti sel plasma,

eosinofil, epiteloid dan multinucleated giant cell (walaupun jarang) (Chan et al.,

2005).

Terdapat dua bentuk pola pertumbuhan tipe undifferentiated yaitu tipe

Regauds, yang terdiri dari kumpulan sel-sel epiteloid dengan batas yang jelas yang

dikelilingi oleh jaringan ikat fibrous dan sel-sel limfosit (Gambar 2.5). Yang kedua

tipe Schmincke, sel-sel epitelial neoplastik tumbuh difus dan bercampur dengan sel-

sel radang (Gambar 2.6). Tipe ini sering dikacaukan dengan large cell malignant

lymphoma (Chan et al., 2005)

21

Pemeriksaan yang teliti dari inti sel tumor dapat membedakan antara

karsinoma nasofaring dan large cell malignant lymphoma, dimana inti dari

karsinoma nasofaring memiliki gambaran vesikular, dengan pinggir inti yang rata dan

berjumlah satu, dengan anak inti yang jelas berwarna eosinophilik. Inti dari malignant

lymphoma biasanya pinggirnya lebih iregular, kromatin kasar dan anak inti lebih

kecil dan berwarna basofilik atau amphofilik. Terkadang undifferentiated memiliki

sel-sel dengan bentuk oval atau spindel (Chan et al., 2005).

Gambar 2.5. Undifferentiated carcinoma “Regaud type”, terdiri dari sel-sel yang membentuk

sarang-sarang padat (Chan, 2005)

22

Gambar 2.6. Undifferentiated carcinoma “Schmincke type”, terdiri sel-sel yang tumbuh

membentuk gambaran sinsisial yang difus (Chan, 2005)

2.2.6. Pemeriksaan Penunjang

2.2.6.1. Pemeriksaan Klinis

Pemeriksaan klinis tumor primer di nasofaring dapat dilakukan dengan cara

rinoskopi posterior, nasofaringoskopi serta fibernaso faringoskopi (Roezin, 2007).

2.2.6.2 Radiologi

Digunakan untuk melihat massa tumor nasofaring dan melihat massa tumor yang

menginvasi pada jaringan sekitarnya dengan menggunakan :

1. Computed Tomografi (CT), dapat memperlihatkan penyebaran ke jaringan ikat

lunak pada nasofaring dan penyebaran ke ruang paranasofaring. Sensitif mendeteksi

erosi tulang, terutama pada dasar tengkorak.

23

2. Magnetic Resonance Imaging (MRI), menunjukkan kemampuan imaging yang

multiplanar dan lebih baik dibandingkan CT dalam membedakan tumor dari

peradangan. MRI juga lebih sensitif dalam mengevaluasi metastase pada

retrofaringeal dan kelenjar limfe yang dalam.MRI dapat mendeteksi infiltrasi tumor

ke sumsum tulang, dimana CT tidak dapat mendeteksinya (Roezin, 2007).

2.2.6.3 Serologi

Ekspresi spesifik viral messenger RNAs atau produk gen secara konsisten

dapat dideteksi pada tumor dengan pemeriksaan insitu hibridisasi dan tekhnik

imunohistokimia. Dapat juga dideteksi dengan tekhnik PCR pada material yang

diperoleh pada dari aspirasi biopsi jarum halus pada metastase kelenjar getah bening

leher (Chan et al., 2005).

2.2.6.4. Pemeriksaan Patologi

1. Biopsi aspirasi jarum halus pada kelenjar getah bening serikalis

Sejumlah kasus karsinoma nasofaring diketahui berdasarkan pemeriksaan sitologi

biopsi aspirasi kelenjar getah bening servikalis (Chan et al., 2005)

2. Biopsi

Konfirmasi pasti diagnosis KNF diperoleh dari hasil biopsi positif yang

diambil dari tumor di nasofaring. Biopsi dapat dilakukan dengan dua cara yaitu dari

hidung dan dari mulut (Chan et al., 2005).

2.2.7 Penatalaksanaan

24

National Comprehensive Cancer Network (2010), mengajukan suatu skema

penatalaksanaan karsinoma nasofaring (Gambar 2.7) dengan kombinasi kemoterapi

dan radioterapi (Yang et al,2012).

Gambar 2.7 Terapi Karsinoma Nasofaring berdasarkan NCCN (2010)

2.2.7.1 Radioterapi

Radioterapi sebagai gold standard untuk karsinoma nasofaring sudah dimulai

sejak lama.Hasil radioterapi untuk karsinoma nasofaring dini sebenarnya cukup baik,

respon lengkap sekitar 80%-100%.Sedangkan untuk karsinoma nasofaring stadium

lanjut loko regional, respon radioterapi menurun tajam dengan angka ketahanan hidup

5 tahun yang kurang dari 40%.Respon tumor terhadap radioterapi secara keseluruhan

sebesar 25%-65% (Chang, 2006).Radioterapi sebagai terapi utama pada karsinoma

nasofaring diberikan untuk yang belum ada metastasis jauh. Radiasi yang diberikan

25

diharapkan dapat memperbaiki kualitas hidup dan memperpanjang kelangsungan

hidup penderita (Qu et al., 2012)

Pertimbangan pemilihan radiasi sebagai pengobatan pilihan utama untuk

karsinoma nasofaring terutama didasarkan fakta bahwa secara histopatologis

kebanyakan (75%-95%) karsinoma dari jenis undifferentiated carcinoma

nasopharynx yang sangat radiosensitif. Alasan lainnya adalah faktor anatomi

nasofaring yang terletak di dasar tengkorak dengan banyak organ vital menyebabkan

tindakan pembedahan ekstensif untuk memperoleh daerah bebas tumor (free margin)

sangat sulit (Qu et al., 2012).

2.2.7.2. Kemoterapi

Kemoterapi sebagai terapi tambahan pada karsinoma nasofaring ternyata

dapat meningkatkan hasil terapi.Terutama diberikan pada stadium lanjut atau pada

keadaan kambuh (Tang et al., 2011).

2.2.7.3. Operasi

Tindakan operasi pada penderita karsinoma nasofaring berupa diseksi leher

radikal dan nasofaringektomi.Diseksi leher dilakukan jika masih ada sisa kelenjar

pasca radiasi atau adanya kekambuhan kelenjar dengan syarat bahwa tumor primer

sudah dinyatakan bersih yang dibuktikan dengan pemeriksaan radiologi dan

serologi.(Feng et al., 2010).

26

2.2.7.4. Imunoterapi

Dengan diketahuinya kemungkinan penyebab dari karsinoma nasofaring

adalah virus Epstein-Barr, maka penderita karsinoma nasofaring dapat diimunoterapi

(Feng et al., 2010).

Beberapa penelitian menunjukkan bahwa pemberian penghambat COX-2

terhadap penderita tumor memberikan hasil yang positif melalui efek kemopreventif

dan radiosensititizer.Pemberian penghambat COX-2 dapat meningkatkan efek terapi

standar serta mengurangi progresivitas KNF.

2.2.8 Prognosis

Angka ketahanan hidup dipengaruhi oleh usia (lebih baik pada pasien usia

muda), staging klinik dan lokasi dari metatasis regional ( lebih baik pada yang

homolateral dibandingkan pada metastasis kontralateral dan metastasis yang terbatas

pada leher atas dibandingkan dari leher bawah). Studi terakhir dengan menggunakan

TNM Staging System menunjukkan 5 years survival rate untuk stadium I 98%,

stadium II A-B 95%, stadium III 86%, dan stadium IV A-B 73%. Secara

mikroskopis, prognosis lebih buruk pada keratinizing squamous cell carcinoma

dibandingkan dengan yang lainnya (Roezin, 2005).

Untuk non keratinizing squamous cell carcinoma, prognosis buruk bila

dijumpai anaplasia dan atau plemorfism, proliferasi sel yang tinggi ( dihitung dari

mitotik atau dengan proliferasi yang dihubungkan dengan marker imunohistokimia ),

sedikitnya jumlah sel radang limfosit, tingginya densitas dari S-100 protein yang

27

positif untuk sel-sel dendritik, dijumpai banyak pembuluh darah kecil, dijumpai

ekspresi Her2/neu (Roezin, 2005).

2.3 Cyclooxygenase-2

2.3.1 Biologi Cyclooxygenase

Cyclooxygenase atau prostaglandin H2 synthase (PGHS) merupakan enzim

yang mengkatalisis dua langkah awal yaitu siklooksigenasi dan peroksidasi pada

biosintesis prostaglandin (PG) dari asam arakhidonat (AA). Asam arakhidonat (20-

carbon polyunsaturated fatty acid) merupakan prekursor dari prostaglandin dan

ditemukan hampir sebagian besar pada membran fosfolipid dari sel (Sonawane et al.,

2011).

Biosintesis prostaglandin terjadi melalui tiga langkah. Langkah pertama pada

sintesis prostaglandin adalah hidrolisis fosfolipid untuk menghasilkan arakhidonat

bebas dimana reaksi ini dikatalisasi oleh fosfolipase A. Langkah berikutnya

merupakan reaksi kunci yang dikatalisasi oleh COX dimana dua molekul oksigen

diinsersikan ke dalam asam arakhidonat untuk menghasilkan prostaglandin G2

(PGG2) intermediate yang tidak stabil dan kemudian secara cepat dikonversi menjadi

prostaglandin H2 (PGH2) oleh aktivitas peroksidase dari COX. Langkah ketiga

terjadi saat spesifik isomerase mengubah PGH2 menjadi berbagai prostaglandin

lainnya seperti PGE2, prostaglandin F2α (PGF2α), prostaglandin D2 (PGD2),

prostasiklin (PGI2) dan tromboksan (TXA2) (Gambar 2.8) ( Sonawane et al., 2011;

Zarghi dan Arfaei, 2011).

28

Gambar 2.8

Metabolisme Asam Arakidonat Melalui Kerja COX (Sonowane et al., 2011)

Cyclooxygenase merupakan bagian integral dari membran terutama membran

mikrosomal.Melalui pemeriksaan mikroskop fluorescence dan tehnik pewarnaan

histofluoresence menunjukkan bahwa Cyclooxygenase-1 (COX-1) dan COX-2

berlokasi pada retikulum endoplasma dan membran inti, COX-2 konsentrasinya lebih

tinggi pada membran inti (Stasinopoulos, 2008).

Saat ini diketahui ada 3 family enzim ini yaitu COX-1, COX-2, dan yang

terbaru diidentifikasi adalah Cyclooxygenase-3 (COX-3), yang memiliki kesamaan

aktivitas enzimatik tetapi memiliki fungsi dan pola ekspresi yang berbeda. COX-1

dan COX-2 mempunyai perbedaan dalam kemampuannya untuk memakai sumber

asam arakhidonat endogen, baik pada sel fibroblast maupun pada sel immune. COX-

2 dapat memanfaatkan asam arakhidonat endogen dan Cox-1 tidak.Hal yang paling

29

penting membedakan antara COX-1 dan COX-2 adalah perbedaan regulasi dari

ekspresi dan distribusinya pada jaringan. COX-3 merupakan varian dari COX-1,

mRNA COX-3 pada manusia memiliki panjang 5,2 kb. COX-1, COX-2, dan COX-3

memiliki persamaan yaitu responnya tergantung dari rangsangan hormon, faktor

pertumbuhan, pharbol ester, faktor inflamasi dan sitokin (Bertagnolli, 2008; Zhao et

al, 2008).

2.3.2 Cyclooxygenase, Prostaglandin, Karsinoma

Family COX adalah enzim yang terdiri dari 2 anggota, COX-1 adalah enzim

yang terekspresi di banyak organ dan COX-2 hanya terekspresi pada jaringan tertentu

saja, termasuk plasenta, otak dan ginjal. Dimana COX-2 ekspresinya meningkat oleh

sejumlah rangsangan, termasuk sitokin, faktor pertumbuhan dan onkogen (Howe,

2007; Surowiak, 2010).

Kedua enzim COX ini mengkatalisis asam arakidonat menjadi PGG2 dan

sesudah itu menjadi PGH2, yang berperan sebagai substrat untuk isomerisasi

multipel yang secara sendirinya berespon untuk generasi untuk menghasilkan

eikosanoid, termasuk PGE2, PGI2 dan TXA2. Prostaglandin terutama PGE2 akan

memodulasi terbentuknya tumor. Misalnya PGE2 berikatan secara spesifik dengan

reseptor protein G-couple reseptor pada permukaan sel epitel, dan akan menstimulasi

rangkaian sinyal pertumbuhan dan motilitas. Didalam sel-sel epitel PGE2 akan

menekan apoptosis dengan meningkatkan ekspresi BCL2 dan juga meningkatkan

ekspresi Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) yang dapat meningkatkan

migrasi sel atau lebih invasif dan mengaktivasi Epidermal Growth Factor Reseptor

30

(EGFR). Selanjutnya, PGE2 akan menginduksi angiogenesis, sehingga memiliki

kemampuan untuk tumbuh dan bermetastasis (Howe, 2007).

Gambar 2.9 Peranan COX-2 pada Perkembangan Karsinoma (Klimek et al., 2009)

2.3.3 Peranan COX-2 pada Karsinoma Nasofaring

Beberapa studi terbaru menunjukkan bahwa level enzim COX-2 meningkat pada

beberapa kanker, seperti karsinoma kolorektal, karsinoma sel skuamous kepala dan

leher, serta beberapa kanker paru-paru dan payudara.Faktor yang kemungkinan

berperan dalam peningkatan ekspresi COX-2 adalah sitokin, faktor pertumbuhan,

mediator inflamasi, agen perusak DNA dan agen oksidasi. Pada manusia dan model

binatang level COX-2 ditemukan lebih tinggi pada adenokarsinoma tipe intestinal

dibandingkan pada lesi prakanker seperti familialadenomatous polyposis . Mirip

pada beberapa karsinoma sel skuamous kepala dan leher, level COX-2, PG, seperti

31

PG2α, PGE2 dan metabolisnya ditemukan lebih tinggi daripada jaringan normal

(Divvella, 2010). Peningkatan ekspresi protein COX-2 sejalan dengan peningkatan

progresifitas invasi epitelium karsinoma nasofaring dari sel normal kemudian

menjadi displasia dan menjadi karsinoma (Widiastuti et al., 2011). Tidak ada

hubungan antara sub tipe histologi karsinoma nasofaring antara keratinizing

squamous cell carcinoma dan non keratinizing carcinoma dengan tampilan COX-2.

Didapatkan tampilan COX-2 sedang pada non keratinizing carcinoma dan derajat

tampilan sedang pada keratinizingsquamous cell carcinoma. Sel kanker

mengekspresikan protein COX-2 dalam kadar tinggi dan ekspresi yang berlebihan

pada COX-2 berhubungan dengan prognosis yang buruk terutama pada

undifferentiated carcinoma nasopharynx (Tan dan Putti, 2005).

2.3.4 Peranan COX-2 pada Angiogenesis.

Angiogenesis merupakan proses pembentukan pembuluh darah baru yang

terjadi secara normal dan sangat penting dalam proses pertumbuhan dan

perkembangan. Pertumbuhan jaringan pembuluh darah baru sangat penting untuk

proliferasai sel kanker, karena proliferasi bergantung pada suplai oksigen, zat

makanan dan pembuangan zat sisa yang adekuat.Angiogenesis juga berperan penting

dalam penyebaran sel kanker. Sel-sel kanker dapat menembus masuk ke dalam

pembuluh darah ataupun limfe, bersirkulasi melalui aliran vaskular, dan kemudian

berproliferasi pada tempat yang lain atau metastasis. Tanpa lintasan angiogenesis,

sebuah tumor hanya akan berkembang hingga memiliki diameter sekitar 1–2 mm, dan

setelah itu perkembangan tumor akan terhenti. Sebaliknya, dengan angiogenesis,

32

sebuah tumor akan berkembang hingga melampaui ukuran diameter 2 milimeter.

Oleh karena itu, sel tumor memiliki kemampuan untuk mensekresi protein yang dapat

mengaktivasi lintasan angiogenesis. Dari berbagai protein yang dapat mengaktivasi

lintasan angiogenesis seperti acidic fibroblast growth factor, angiogeninepidermal

growth factor, G-CSF, HGF, interleukin-8, placental growth factor, platelet-derived

endothelial growth factor, scatter factor, transforming growth factor-alpha, TNF-α

dan molekul kecil seperti adenosine 1-butyryl glycerol, nikotinamida, prostaglandin

E1 dan E2, terdapat dua protein yang sangat penting bagi pertumbuhan tumor yaitu

VEGF dan basic fibroblast growth factor (bFGF). Kedua protein ini disekresi oleh

berbagai jenis sel kanker dan beberapa jenis sel normal.(Nishida et al., 2006).

Sekresi VEGF atau bFGF akan mengikat pada sel endotelial dan mengaktivasi

sel tersebut untuk memicu lintasan metabolisme yang membentuk pembuluh darah

baru. Sel endotelial akan memproduksi sejumlah enzim MMP yang akan melakukan

degradasi terhadap jaringan matriks ekstraselular yang mengandung protein dan

polisakarida berfungsi sebagai jaringan ikat yang menyangga jaringan parenkim

dengan mengisi ruang di sela-sela selnya. Degradasi jaringan tersebut memungkinkan

sel endotelial bermigrasi menuju jaringan parenkim, melakukan proliferasi dan

diferensiasi menjadi jaringan pembuluh darah yang baru (Pang dan Poon, 2006).

Angiogenesis diperlukan untuk menstabilkan koloni tumor yang baru

terbentuk dan untuk menyokong pertumbuhan massa tumor. COX-2 dan PG

(misalnya PGE2 dan PGI2) merupakan faktor potensial yang penting pada

33

angiogenesis tumor.Cyclooxygenase-2 secara konsisten terekspresi dalam

pembentukan pembuluh darah baru dalam tumor dan pembuluh darah di sekitar.Efek

pro-angiogenik dari COX-2 dapat meningkatkan ekspresi dari

VEGF.Immunoreaktivitas COX-2 juga berhubungan dengan immunoreaktivitas

VEGF pada kanker kolorektal dan metastasis hati pada kanker kolorektal

(Bertagnolli, 2008).

Overekspresi COX-2 berkorelasi dengan meningkatnya ekspresi VEGF pada

angiogenesis karsinoma hepatoselular. Penelitian ini memakai Heb-B HCC cell line,

merupakan sel hepatosit karsinoma yang membawa gen HBV. Clone Heb-B, yang

merupakan cell line dengan overekspresi COX-2 menunjukkan ekspresi VEGF yang

lebih tinggi dibandingkan dengan clone yang tidak mengekspresikan COX-2 (Zhao

et al., 2008).

2.3.5 Ekspresi COX-2 pada karsinoma nasofaring

Prostaglandin endoperoxidase sintesa-2 atau COX-2 adalah enzim kunci

dalam produksi prostaglandin.Enzim ini ditemukan meningkat pada bebagai

keganasan, seperti pada kolon, paru, payudara, kepala leher, dan dipengaruhi oleh

berbagai sitokin, hormon, dan promotor tumor. Prostaglandin dan isoenzim COX-2

dapat membantu proses karsinogenesis dengan merubah proses sel normal seperti

proliferasi sel, angiogenesis, apoptosis, imunomodulasi dan metabolism karsinogen.

Overproduksi dari PGE2 sebagai akibat peningkatan COX-2 juga dapat mengirimkan

sinyal yang tidak sesuai pada sel, sehingga merangsang pertumbuhan sel atau

mengurangi apoptosis (Zhao et al., 2008; Sonowane et al., 2011).

34

Analisis imunohistokimia memperlihatkan COX-2 terekspresi kuat pada sel-sel

ganas karsinoma nasofaring dan tidak terekspresi atau terekspresi lemah pada

nasofaring normal (Xu et al., 2006). Penelitian lain juga menyebutkan COX-2 kuat

pada karsinoma tiroid dan kolorektal (Ji et al., 2012). Penelitian yang dilakukan pada

vulva, ternyata COX-2 terekspresi paling tinggi pada inflamasi dibandingkan dengan

lesi displasia maupun kanker yang invasif, dan tidak berhubungan dengan

peningkatan derajat diferensiasi tumor (Mozes et al., 2005; Ristimaki et al., 2012).

Sel kanker mengekspresikan protein COX-2 dalam kadar tinggi dan ekspresi

yang berlebihan pada COX-2 berhubungan dengan prognosis yang buruk terutama

pada undifferentiated carcinoma nasopharynx. Peningkatan ekspresi protein COX-2

sejalan dengan peningkatan progresifitas invasi epitelium karsinoma nasofaring dari

sel normal kemudian menjadi displasia dan menjadi karsinoma (Widiastuti et al.,

2011).

2.4 Imunohistokimia

Imunohistokimia merupakan suatu proses mengidentifikasi protein spesifik

pada jaringan atau sel dengan menggunakan antibodi. Tempat pengikatan antara

antibodi dengan protein spesifik diidentifikasi dengan marker yang biasanya

dilekatkan pada antibodi dan bisa divisualisasi secara langsung atau dengan

mengidentifikasi marker. Marker dapat berupa senyawa berwarna, zat berfluoresensi,

logam berat, label radioaktif atau enzim (Anonim, 2012 ).

35

Terdapat dua metode dasar identifikasi antigen dalam jaringan dengan

imunohistokimia, yaitu metode langsung (direct method) dan tidak langsung

(indirectmethod).

a. Metode langsung (direct method)

Metode langsung merupakan metode pengecatan satu langkah karena hanya

melibatkan satu jenis antibodi, yaitu antibodi yang terlabel, contohnya anti serum

terkonjugasi fluorescein isothiocyanate (FITC) atau rodhamin.

b. Metode tidak langsung (indirect method).

Metode ini menggunakan dua macam antibodi, yaitu antibodi primer (tidak berlabel)

dan antibodi sekunder (berlabel). Antibodi primer bertugas mengenali antigen yang

diidentifikasi pada jaringan (first layer), sedangkan antibodi sekunder akan berikatan

dengan antibodi primer (second layer). Antibodi kedua merupakan anti-antibodi

primer. Pelabelan antibodi sekunder diikuti dengan penambahan substrat berupa

kromogen. Kromogen merupakan suatu gugus fungsi senyawa kimiawi yang dapat

membentuk senyawa berwarna bila bereaksi dengan senyawa tertentu. Penggunaan

kromogen fluorescent dye seperti FITC, rodhamin, dan Texas-red disebut metode

immunofluorescence, sedangkan penggunaan kromogen enzim seperti peroksidase,

alkali fosfatase, atau glukosa oksidase disebut metode immunoenzyme

(Anonim,2012).

Sel yang mengekspresikan COX-2 akan tampak berwarna coklat pada

sitoplasma sel ganas. Penilaian ekspresi COX-2 dibuat berdasarkan analisis

persentase sel tumor yang positif dan intensitas pewarnaan.Berdasarkan persentase

36

sel ganas yang menunjukkan overekspresi COX-2 maka dibagi menjadi 3 (0-3) yaitu:

0 (tidak terwarnai), 1 (<10% sel dari seluruh sel ganas terwarnai), 2 (10-50% sel dari

seluruh sel ganas terwarnai), 3 (> 50% sel dari seluruh sel ganas terwarnai).

Berdasarkan intensitas sel-sel ganas yang menunjukkan overeksprei COX-2 maka

dibagi menjadi 3 skala (0-3) yaitu: 0 (negatif), 1 (lemah), 2 (sedang), 3 (kuat) (Tan

dan Putti, 2005).

Skor persentase dari sel tumor, sesuai dengan penelitian sebelumnya digunakan skor

immunoreaktif, diperoleh dengan mengalikan skor % sel ganas yang

mengekspresikan COX-2 dengan skor intensitas. Skor imunoreaktif 4 atau lebih

dinilai sebagai ekspresi COX-2 positif, skor imunoreaktif kurang dari 4 dinyatakan

sebagai COX-2 negatif (Gambar 2.10) (Tan dan Putti, 2005).

Gambar 2.10 A. Lemah (intensitas 1 dari 3). B. Sedang (intensitas 2 dari 3). C. Kuat (intensitas

3 dari 3). D. Tidak terpulas COX-2 pada epitel nasofaring normal (Tan dan

Putti, 2007).

37

Antibodi primer CD31 mengenali glikoprotein 1000 Da pada sel endothelial dan

130 kDa pada trombosit.CD31 bereaksi secara lemah dengan zona lapisan sel B, sel T

perifer dan neutrofil.CD31 dapat mendeteksi antigen yang berhubungan dengan sel

endotel vaskular dan telah digunakan sebagai penanda terhadap ganas atau jinak suatu

gangguan vaskular pada manusia, infiltrasi leukemia myeloid, dan megakariosit

dalam susum tulang normal.Ketika dibandingkan dengan faktor VIII dan CD34

penelitian menunjukkan bahwa CD31 merupakan penanda yang lebih unggul untuk

angiogenesis yang dilaporkan dapat memprediksi rekurensi tumor.CD31 bersama

dengan faktor VIII dan CD34 digunakan dalam panel pemeriksaan untuk

menandakan sarkoma Kaposi’s dan angiosarkoma.Kontrol CD31 terdapat pada tonsil,

angiosarkoma, atau karsinoma kolon. Sel yang mengekspresikan CD31 pada

sitoplasma dan membran (Anonim, 2009).

Untuk penghitungan microvessel density, pulasan CD31 dinilai pada pembesaran

lemah (10x) untuk area yang menunjukkan peningkatan pembuluh darah (hot spots).

Pada area hotspot dilihat pada pembesaran 400x dengan mikroskop cahaya binokuler

CX-21.Empat lapang pandang pada 1 slide dipilih untuk mewakili area seluas 1

mm2.Intratumoral dan peritumoral microvessel (pembuluh darah dengan diameter ˂

50µm tanpa lapisan muskular) dihitung jumlah microvessel pada masing-masing

empat lapang pandang, dan hasilnya digabungkan untuk mendapatkan

microvessel/mm2 (Gambar 2.11) (Taweevisit et al., 2010; Tan dan Putti, 2005).

38

Gambar 2.10.

A. Hasil pewarnaan imunohistokimia dengan hasil MVD tinggi dan B. MVD rendah

(Hasibuan, 2014).

39

BAB III

KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1 Kerangka Berpikir

Inflamasi merupakan salah satu faktor risiko pencetus terjadinya keganasan pada

beberapa organ.Rangsangan mekanik, kimia, fisik dan mediator inflamasi akan

melepaskan asam arakhidonat dari fosfolipid membran sel melalui kerja dari

fosfolipase A. Asam arakhidonat yang terbentuk akan mengalami biotransformasi

menjadi prostaglandin dan tromboksan melalui perantaraan enzim COX.

Cyclooxygenase-2 terekspresi pada beberapa tumor dan terbukti terlibat dalam

proses karsinogenesis melalui proses perubahan metabolism xenobiotik, yang

dapat meningkatkan pertumbuhan tumor invasi, angiogenesis dan menghambat

apoptosis

Hampir semua sel karsinoma nasofaring mengandung Virus Epstein Barr, dan

sebagian besar penderita karsinoma nasofaring terbukti terinfeksi oleh virus ini di

dalam darah.Infeksi VEB sendiri belum cukup untuk menyebabkan karsinoma

nasofaring. Faktor-faktor lain seperti genetik, dapat mempengaruhi bagaimana

tubuh berespon terhadap VEB. Faktor lingkungan yang berpengaruh terhadap

karsinoma nasofaring adalah iritasi oleh bahan kimia, asap, bahan makanan yang

mengandung pengawet nitrosamin, debu kayu, dan rokok. Adanya radang kronik

pada karsinoma nasofaring dan paparan faktor lingkungan yang disebutkan diatas

dapat meningkatkan terjadinya karsinoma nasofaring.

40

Pada undifferentiated carcinoma nasopharynx, VEB menginfeksi sel epitel

nasofaring bagian posterior fossa Rosenmuller’s di Waldeyer’s ring.Walaupun

hubungan reseptor VEB pada sel epitel tidak tampak, tetapi permukaan protein

mengandung antigen yang dihubungkan dengan sel B. Reseptor CD21 dapat

diuraikan dan VEB banyak masuk ke sel nasofaring berupa IgA-mediated

endocytosis. VEB dapat juga dideteksi pada karsinoma insitu, suatu prekursor

undifferentiated carcinoma nasopharynx. Infeksi laten VEB sangat penting dalam

perkembangan menuju displasia yang berat pada KNF. Displasia merupakan lesi

awal yang dapat terdeteksi, yang diperkirakan dipengaruhi oleh beberapa

karsinogen lingkungan.Hal ini berkaitan dengan kehilangan alel pada lengan

pendek kromosom 3 dan 9 yang menyebabkan inaktivasi beberapa tumor

suppressor genes, terutama p14, p15, p16.Area displasia ini dapat menjadi

precursor dari karsinoma nasofaring. Pada stadium laten, infeksi VEB dapat

memicu perkembangan displasia yang lebih berat. Didapatkan kerusakan gen pada

kromosom 12dan kehilangan alel pada 11q, 13q, dan 16q dapat memicu terjadinya

kanker invasif dan metastasis sering dihubungkan dengan mutasi p53 dan ekspresi

chaderin yang menyimpang.

Cyclooxygenase-2 tidak terdapat pada jaringan normal namun ekspresinya

secara cepat diinduksi oleh berbagai rangsangan seperti sitokin, lipopolisakarida,

mitogen dan onkogen, faktor pertumbuhan, hormon dan kelainan keseimbangan

cairan dan elektrolit sehingga pembentukan prostaglandin akan meningkat pada

jaringan yangmengalami inflamasi dan neoplastik.Kondisitersebut

41

mengimplikasikan keterlibatan COX-2 dalam berbagai proses patologis seperti

inflamasi dan keganasan.

Pada undifferentiated carcinoma nasopharynx, COX-2 berperan dalam

berbagai proses yaitu; (1) Menekan apoptosis oleh induksi PGE2, dimana

berakibat terjadi peningkatan protein antiapoptosis BCL2, menekan ekspresi

protein proapoptosis BAX dan melemahkan sinyal NO. (2) Meningkatkan

angiogenesis melalui peningkatan level PGE2, yang diikuti oleh peningkatan

VEGF, endothelin-1. (3) Meningkatkan kemampuan invasi sel tumor melalui

ekspresi berlebihan CD44. Cyclooxygenase-2 merupakan mediator

inflamasidanenzim yang dapatmengubahasamarakhidonatmenjadi PGE2,

PGE2berperan penting dalam proses karsinogenesis pada banyak organ

menyebabkan proliferasi sel ganas, bersifat anti apoptosis, memicu angiogenesis,

memicu metastasis.

Angiogenesis merupakan proses pembentukan pembuluh darah baru.

Pertumbuhan jaringan pembuluh darah baru sangat penting untuk proliferasai sel

kanker, karena proliferasi bergantung pada suplai oksigen, zat makanan dan

pembuangan zat sisa yang adekuat.Sel pada jaringan pre kanker membutuhkan

kemampuan angiogenik untuk membuat sel tersebut berubah menjadi

ganas.Angiogenesis juga berperan penting dalam penyebaran sel kanker. Sel-sel

kanker dapat menembus masuk kedalam pembuluh darah ataupun limfe,

bersirkulasi melalui aliran vaskular, dan kemudian berproliferasi pada tempat

yang lain atau metastasis.

42

Angiogenesis diperlukan untuk menstabilkan koloni tumor yang baru

terbentuk dan untuk menyokong pertumbuhan massa tumor. Cyclooxygenase-

2dan PG (misalnya PGE2 dan PGI2) merupakan faktor potensial yang penting

pada angiogenesis tumor.Cyclooxygenase-2 secara konsisten terekspresi dalam

pembentukan pembuluh darah baru dalam tumor.Efek pro-angiogenik dari COX-

2 dapat meningkatkan prostaglansin E2.Peningkatan PGE2 dapat meningkatkan

VEGF.

3.2 Konsep Penelitian

Konsep penelitian tampak pada bagan sebagai berikut :

Gambar 3.1

BaganKonsep Penelitian

Keterangan Gambar :

Ekspresi COX-2

Microvessel density Undifferentiated carcinoma

nasopharynx

Genetik

Lingkungan

Virus Epstein Barr

43

= Variabel yang diteliti

3.3 Hipotesis Penelitian

Hipotesis penelitian ini adalah terdapat hubungan positif ekspresi COX-2

dengan MVD pada undifferentiated carcinoma nasopharynx di RSUP Sanglah

Denpasar.

44

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 RancanganPenelitian

Penelitian ini merupakan penelitian observasional dengan menggunakan

rancangan potong lintang (cross-sectional study). Skema rancangan penelitian

dapat dilihat pada Gambar 4.1

Gambar 4.1 Rancangan Penelitian

Undifferentiated carcinoma

nasopharynx

COX-2

Microvessel

density

45

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Bagian/SMF Patologi Anatomi FK Unud / RSUP

Sanglah Denpasar dan di Bagian/SMF Patologi Anatomi FK Universitas Gadjah

Mada/RSUP dr. Sardjito, Yogyakarta dari 15Maret 2015 – 1 Mei 2015.

4.3 Ruang Lingkup Penelitian

Penelitian dimulai dengan rediagnosis sediaan histopatologi dari bahan

biopsi penderitaundifferentiated carcinoma nasopharynx yang diperiksa secara

histopatologi pada Bagian/SMF Patologi Anatomi FK Unud/RSUP Sanglah di

Denpasar oleh peneliti dan seorang ahli patologi.Populasi terjangkau dicari blok

parafinnya, selanjutnya dilakukan pemotongan blok parafin, pulasan, dan

interpretasi ekspresi protein COX-2 dan CD31.

4.4 Penentuan Sumber Data

4.4.1 Populasi

4.4.1.1. Populasi target

Populasi target penelitian ini adalah semua sediaan blok parafin dari

penderita undifferentiated carcinoma nasopharynx yang diperiksa secara

histopatologi dari hasil biopsi di Bali.

4.4.1.2. Populasi terjangkau

Populasi terjangkau penelitian ini adalah sediaan blok parafin dari

penderita undifferentiated carcinoma nasopharynx yang diperiksa

46

secarahistopatologi dari hasil biopsi di Bagian/SMF Patologi Anatomi FK

UNUD/RSUP Sanglah Denpasar.

4.4.2 Sampel Penelitian

Sampel penelitian ini adalah sediaan blok parafin dari

penderitaundifferentiated carcinoma nasophrynx yang telah diperiksa secara

histopatologi dari hasil biopsi di Bagian/SMF Patologi Anatomi FK UNUD/RSUP

Denpasar dari tanggal 1 Januari 2014 sampai dengan 31 Agustus 2014 yang

memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.

4.4.3 Kriteria Inklusi

1. Sediaan berasal dari salah satu bahan biopsi dekstra atau sinistra yang

mengandung minimal 3 mm jaringan tumor (Chou, 2008).

2. Sediaan merupakan tumor primer.

3. Penderita belum pernah mendapatkan kemoterapi atau radioterapi.

4.4.4 Kriteria Eksklusi

1. Kasus dengan diagnosis histopatologi yang belum pasti (masih ada

diagnosis banding).

2. Blok parafin yang rusak.

3. Sediaan mengandung sel-sel radang padat, jika limfosit menginfiltrasi

tumor secara difus seluruh komponen tumor (Busam et al, 2011)

47

4.4.5 Besar Sampel

Besar sampel pada penelitian ini dihitung dengan menggunakan rumus besar

sampel penelitian analitik korelatif oleh (Machin et al., 2009):

( )3

1

1ln5,0

2

+

−+

+=

r

r

ZZn

βα

Keterangan: n = besar sampel

Zα = Nilai Z untuk α tertentu

Zβ = Nilai Z untuk power (1-β) tertentu

r = koefisien korelasi

Berdasarkan penelitian sebelumnya (Hasibuan, 2014) diperolehbahwa

koefisien korelasi (r) sebesar 0,559. Dengan tingkat kesalahan tipe I, α ditetapkan

sebesar 5% sehingga nilai Zα adalah 1,96. Sedangkan kesalahan tipe II, β

ditetapkan sebesar 10%, maka Zβ adalah 1,28. Dari rumus di atas maka

didapatkan besar sampel adalah

( )3

559,01

559,015,0

28,196,1

2

+

−++

=In

n

n= 28

Jadi besar sampel pada penelitian ini adalah 28. Untuk menghindari drop

out maka ditambah 10% sehingga besar sampel menjadi 28+2,8=30,8dan

dibulatkan menjadi 31 sediaan blok parafin untuk pulasan COX-2 dan CD 31.

48

4.4.6 Teknik Pengambilan Sampel

Teknik penentuan sampel dilakukan dengan cara berikut :

a. Dari populasi terjangkau sediaan blok parafin diadakan pemilihan sampel

berdasarkan kriteria inklusi dan eksklusi.

b. Populasi terjangkau yang telah memenuhi syarat diambil secara random untuk

mendapatkan jumlah sampel yang dibutuhkan, yaitu sebanyak 31blok parafin.

4.5 Variabel Penelitian

4.5.1 Klasifikasi Variabel

1.Variabel tergantung : Microvessel density

2. Variabel bebas : Ekspresi COX-2

4.5.2 Definisi Operasional Variabel

1.Undifferentiated carcinoma nasopharynxadalah keganasan yang berasal dari

epitel mukosa nasofaring infiltratif pada stroma yang memperlihatkan gambaran

sel berbentuk oval atau spindel dengan inti bulat sampai oval dan vesikular, dan

ditemukan anak inti membentuk pola sinsitial (Chan et al., 2005).

2. Ekspresi COX-2 adalah: Penilaian protein COX-2 dengan pulasan

imunohistokimia menggunakan antibodi primer monoklonal COX-2 clone D07

dari Dako, secara semikuantitatif, diamati dengan mikroskop cahaya binokuler

merk Olympus CX-21 mulai dari pembesaran lemah (40x) kemudian pembesaran

kuat (400x). Penghitungan dilakukan pada seluruh sel tumor dimulai dari bagian

tumor dengan ekspresi COX-2 terkuat ke bagian yang lebih lemah (40x). Sediaan

49

jaringan yang akan dinilai, dibandingkan dengan kontrol positif. Kontrol positif

diambil dari jaringan kolon. Sel yang mengekspresikan COX-2 akan tampak

berwarna coklat pada sitoplasma sel ganas. (Tan dan Putti, 2005). Penilaian

ekspresi COX-2 dijelaskan pada lampiran 1.

3. Microvessel density : Penilaian MVD dengan pulasan immunohistokimia

menggunakan antibodi primer monoclonal mouse anti human CD 31Endothelial

Cell secara semikuantitatif, diamati dengan mikroskop cahaya binokuler merk

Olympus CX-21 mulai dari pembesaran lemah (40x) kemudian pembesaran kuat

(400x). Penghitungan dilakukan pada seluruh sel tumor dimulai dari bagian tumor

dengan ekspresi terkuat ke bagian yang lebih lemah. Sediaan jaringan yang akan

dinilai, dibandingkan dengan kontrol positif. Kontrol positif diambil dari jaringan

tonsil. Untuk menentukan microvessel, dilihat dari ekspresi lemah sampai kuat

CD31 yaitu berwarna coklat pada sitoplasma dan membrane sel. Intratumoral dan

peritumoral microvessel (pembuluh darah dengan diameter ˂ 50µm tanpa lapisan

muskular) dihitung jumlah microvessel pada masing-masing empat lapang

pandang, dan hasilnya digabungkan untuk mendapatkan microvessel/mm2

(Taweevisit et al., 2010). Penilaian MVD dijelaskan pada lampiran 1.

4.6 Bahan Penelitian

1. Bahan pemeriksaan histopatologi berupa blok parafin dari bahan biopsi dan

operasi pasien yang menderitaundifferentiated carcinoma nasopharynxyang

diperiksa secara histopatologi di Bagian/SMF Patologi Anatomi FK Unud/RSUP

Sanglah,dan slide dengan pengecatan H&E.

50

2. Bahanpemeriksaan imunohistokimia berupa blok parafin dari bahan biopsi dan

operasi pasien yang menderitaundifferentiated carcinoma nasopharynxyang

diperiksa secara histopatologi di Bagian/SMF Patologi Anatomi FK Unud/RSUP

Sanglah, untuk pengecatan imunohistokimia COX-2 menggunakan antibodi

primer monoklonal COX-2 clone DO7 dari Dako dan antibodi monoclonal mouse

anti-Human CD31 Endothelial cell.

3. Buku Registrasi Pemeriksaan Histopatologi Bagian/SMF Patologi Anatomi FK

Unud/RSUP Sanglah di Denpasar tahun 2014 untuk mencari data pasien yang

menderita karsinoma nasofaring dari tahun 2014.

4.7 Instrumen Penelitian

Instrumen penelitian yang digunakan adalah:

1. Instrumen untuk pemeriksaan imunohistokimia yaitu: mikrotom Leica 2135

RM,gelas obyek yang telah dilapisi dengan poly-L-lisyne, merk Biogear,

ukuran lebar 1 inchi, panjang 3 inchi dan tebal 1,2 mm dan inkubator.

2. Mikroskop cahaya binokuler Olympus CX21 untuk melihat ekspresi COX-2

dan microvessel densitypada sediaan undifferentiated carcinoma

nasopharynx.

4.8Prosedur Penelitian

4.8.1 Cara Pengumpulan Data

1. Pengumpulan data pasien dan sediaan preparat biopsi atau operasi

Undifferentiated carcinoma nasopharynxyangdiperiksa secara histopatologi

51

dari 1 Januari 2014 sampai 31 Agustus 2014 di Bagian/SMF Patologi Anatomi

FK UNUD/RSUP Sanglah, Denpasar.

2. Preparat hasil pulasan Hematoksilin dan Eosin (H&E) sesuai dengan yang

didapatkan tersebut diatas dikumpulkan dan dievaluasi ulang oleh peneliti dan

dua ahli patologiuntuk memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi sehingga didapat

kelompok data yaitu undifferentiated carcinoma nasopharynx. Preparat yang

sulit dievaluasi dilakukan potong ulang blok dan dipulas dengan pulasan rutin

menggunakan Harris’s Hematoksilin dan Eosin.

3. Blok paraffin dari pasien dikumpulkan dan dievaluasi sesuai kriteria inklusi

dan eklusi.

4. Blok paraffin dikirim ke Bagian/SMF Patologi Anatomi FK UGM/RSUP dr.

Sarjito, Jogyakarta untuk dilakukan pulasan Imunohistokimia COX-2 dan

CD31.

5. Data hasil pulasan selanjutnya diusulkan kedalam formulir penelitian.

4.8.2 Prosedur Pemeriksaan Bahan

1. Prosedur pulasan H&E sesuai dengan prosedur pulasan yang rutin dikerjakan di

Bagian/SMF Patologi Anatomi FK UNUD/RSUP Sanglah, Denpasar:

a. Potong ulang blok parafin menggunakan mikrotom Leica 2135 RM

dengan ketebalan 4µm, kemudian ditempelkan pada gelas obyek merk Sail

Brand dengan ukuran lebar 1 inchi, panjang 3 inchi dan tebal 1,2 mm.

b. Deparafinsasi dengan cara dicelupkan pada xilol sebanyak 4 kali masing-

masing celupan sebanyak 5 menit.

52

c. Hidrasi dengan alkohol bertingkat dengan kosentrasi menurun

menggunakan alkohol 95%, alkohol 80%, alkohol 75%, dan alkohol 50%,

masing masing celupan selama 2 menit.

d. Masukkan ke air selama 10 menit.

e. Celupkan ke cat utama yaitu Harris’s hematoksilin selama 10 menit.

f. Cuci dengan air selama 10 menit.

g. Lihat dibawah mikroskop, inti sel akan terlihat biru terang sedangkan

sitoplasma tidak berwarna.

h. Celupkan pada cat pembanding eosin 1% selama 0,5-1 menit.

i. Dehidrasi dengan alkohol bertingkat dengan konsentrasi meningkat

menggunakan alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 95% dan alkohol

absolut, masing-masing celupan selama 2 menit.

j. Penjernihan dengan xilol sebanyak 4 kali celupan, lama masing-masing

celupan selama 5 menit.

k. Tutup dengan cover glas

2. Melakukan pulasan imunohistokimia COX-2 dengan prosedur :

a. Potong blok parafin menggunakan mikrotom Leica 2135 RM ketebalan 3

µm, kemudian direkatkan pada gelas obyek yang telah dilapisi dengan

poly-L-lisyne, merk Biogear, ukuran lebar 1 inchi, panjang 3 inchi dan

tebal 1,2 mm. Disamping pemeriksaan untuk sampel, pemeriksaan juga

dilakukan pada kasus karsinoma kolon sebagai kontrol positif.

b. Letakkan gelas obyek di inkubator dengan suhu 45o C selama 1 malam.

53

c. Deparafinsasi dengan xilol, preparat dicelupkan kedalam xilol sebanyak 3

kali, masing-masing celupan selama 5 menit.

d. Rehidrasi dengan alkohol bertingkat terdiri dari alkohol absolut 2 kali,

alkohol absolut, alkohol 96%, dan alkohol 70%, masing-masing selama 5

menit.

e. Cuci dengan aquadest selama 10 menit.

f. Teteskan H2O2 dalam methanol 3% sampai menutupi seluruh permukaan

jaringan selama 15 menit.

g. Cuci dengan aquadest selama 10 menit.

h. Untuk retrivel dengan buffer citrate ph 6 selama 40 menit pada 950 dengan

decloaking chamber atau 10-20 menit dengan microwave.

i. Dinginkan pada suhu kamar kurang lebih selama 30 menit.

j. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 3-5 menit.

k. Inkubasi dengan bloking serum atau normal serum selama 15 menit.

l. Tiriskan, bersihkan.

m. Inkubasi dengan antibodi primer menggunakan antibodi monoklonal

COX-2 dari Dako yang telah diencerkan (pengenceran 1:100) selama 1

jam.

n. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 3-5 menit.

o. Inkubasi dengan antibodi sekunder atau trekkie universallink selama 20

menit.

p. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 3-5 menit.

q. Inkubasi dengan trekkie avidin HRP selama 10 menit.

54

r. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, selama 3-5 menit.

s. Teteskan dengan cromogenDAB (1:50), biarkan selama 2 menit.

t. Cuci dengan air mengalir.

u. Counterstain dengan Mayer Hematoksilin selama 2 menit.

v. Cuci dengan air mengalir.

w. Dehidrasi dengan alkohol bertingkat terdiri dari alkohol 70%, alkohol

96%, dan alkohol 100%, masing-masing selama 3 menit.

x. Celupkan kedalam xilol sebanyak 3 kali, 3 menit.

y. Tutup dengan cover glass.

3. Melakukan pulasan imunohistokimia CD31 dengan prosedur :

a. Potong blok parafin menggunakan mikrotom Leica 2135 RM ketebalan 3

µm, kemudian direkatkan pada gelas obyek yang telah dilapisi dengan

poly-L-lisyne, merk Biogear, ukuran lebar 1 inchi, panjang 3 inchi dan

tebal 1,2 mm. Disamping pemeriksaan untuk sampel, pemeriksaan juga

dilakukan pada tonsil sebagai kontrol positif.

b. Inkubasi dalam inkubator dengan suhu 45o C selama 1 malam.

c. Deparafinsasi dengan xilol, preparat dicelupkan kedalam xilol sebanyak

3x5 menit.

d. Rehidrasi dengan alkohol bertingkat terdiri dari alkohol absolut, alkohol

96%, dan alkohol 70%, masing-masing selama 5 menit.

e. Cuci dengan aquadest selama 10 menit.

f. Teteskan H2O2 dalam methanol 3% selama 15 menit.

g. Cuci dengan aquadest selama 10 menit.

55

h. Untuk retrivel dengan buffer citrate ph 6 selama 40 menit pada 950 dengan

decloaking chamber atau 10-20 menit dengan microwave.

i. Dinginkan pada suhu kamar kurang lebih selama 30 menit.

j. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit.

k. Inkubasi dengan bloking serum atau normal serum selama 15 menit.

l. Tiriskan, bersihkan.

m. Inkubasi dengan antibodi primer menggunakan antibodi monoklonal

Mouse anti-human CD31 Endothelial cell dari Dako yang telah diencerkan

(pengenceran 1:100) selama 1 jam.

n. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 3-5 menit.

o. Inkubasi dengan antibodi sekunder atau trekkie universal link selama 20

menit.

p. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing 3-5 menit.

q. Inkubasi dengan trekkie avidin HRP selama 10 menit.

r. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 3-5 menit.

s. Teteskan dengan cromogen DAB (1:50), biarkanselama 2 menit.

t. Cuci dengan air mengalir.

u. Counterstain dengan Mayer Hematoksilin selama 2 menit.

v. Cuci dengan air mengalir.

w. Dehidrasi dengan alkohol bertingkat terdiri dari alkohol 70%, alkohol

96%, dan alkohol 100%.

x. Celupkan kedalam xilol sebanyak 3 kali, 3 menit.

y. Tutup dengan cover glass.

56

4.8.3 Bagan Alur Penelitiaan

Skema alur penelitian dapat dilihat pada table 4.2

Gambar 4.2 Bagan Alur Penelitian

Mencari nomor-nomor sediaan undifferentiated carcinoma

nasopharynx dari 1 Januari 2013-31 Desember 2014

Pengumpulan sediaan pulasan HE

Seleksi dan rediagnosis sediaan mikroskopik yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi

Pulasan imunohistokimia CD31

Undifferentiated nasopharyng carcinoma

Pulasan imunohistokimia ekspresi COX-2

Randomisasi

Pengumpulan dan pemotongan blok parafin

Interpretasi dan penghitungan ekspresi COX-

2

Interpretasi dan penghitungan microvessel density

Analisis data

57

4.9 Analisis Data Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan SPSS 16.0 for

windows dengan langkah-langkah sebagai berikut:

1. Analisis Deskriptif.

2. Uji Normalitas data dengan ujiKolmogorov-Smirnov.

3. Analisis korelatif adalah uji Pearson karena distribusi data normal.

4. Tingkat kemaknaan dalam penelitian ini ditetapkan sebesar α < 0,05.

58

BAB V

HASIL PENELITIAN

Penelitian observasional dengan menggunakan rancangan potong lintang

(cross-sectional study) yang menggunakan sediaan blok parafin dari penderita

undifferentiated carcinoma nasopharynx yang telah diperiksa secara

histopatologi dari hasil biopsi di Bagian/SMF Patologi Anatomi FK UNUD/RSUP

Sanglah Denpasar dari tanggal 1 Januari 2014 sampai dengan 31 Agustus 2014

didapatkan sebanyak 58 kasus. Setelah dilakukan diagnosis ulang secara

histopatologi, dilakukan pemilihan sampel, sesuai besar sampel yang dibutuhkan,

yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi yaitu sebanyak 31 kasus

undifferentiated carcinoma nasopharynx. Sampel tersebut kemudian dipulas

dengan pengecatan imunohistokimia COX-2 dan CD31.

5.1 Karakteristik Sampel Penelitian

Pada penelitian ini, data karakteristik subyek meliputi jenis kelamin dan

umur.

Tabel 5.1 Distribusi Sampel Berdasarkan Jenis Kelamin

Jenis kelamin Jumlah Persentase

Laki-laki 26 83,9%

Perempuan 5 16,1%

Jumlah 31 100%

Dari 31 kasus undifferentiated carcinoma nasofarinx, didapatkan 26(83,9%)

adalah laki-laki dan 5(16,1%) perempuan.

59

Tabel 5.2

Distribusi Sampel Berdasarkan Umur

Umur Jumlah Persentase

11-20 1 3,23%

21-30 1 3,23%

31-40 4 12,90%

41-50 11 35,48%

51-60 8 25,80%

61-70 5 16,13%

71-80 1 3,23%

Jumlah 31 100%

Berdasarkan hasil analisis didapatkan bahwa rerata umur pasien adalah

49,52±11,64 tahun dengan rentangan 18-71 tahun (Tabel 5.2).

5.2 Ekspresi COX-2 dan Microvessel density

Tabel 5.3 Distribusi Sampel Berdasarkan Persentase Sel dan Intensitas Ekspresi COX-2

Persentase Sel Intensitas

Skor Jumlah Skor Jumlah

0 (0%) Tidak ada 0 (negatif) Tidak ada

1 (˂10%) 6 (19,35%) 1 (lemah) 3 (9,68%)

2 (10-50%) 10 (32,26%) 2 (sedang) 8 (25,80%)

3 (˃50%) 15 (48,39%) 3 (kuat) 20 (64,52%)

60

Berdasarkan pemeriksaan perluasan ekspresi COX-2 dari 31 sampel

menunjukkan berturut-turut skor (0) tidak ada, skor (1) 6 kasus (19,35%), skor (2)

10 kasus (32,26%), skor (3) 15 kasus (48,38%). Sedangkan pada pemeriksaan

intensitas ekspresi COX-2dari 31 sampel didapatkan hasil sebagai berikut 0

(negatif) tidak terpulas, 3 (9,68%) terpulas dengan intensitas lemah, 8( 25,80%)

terpulas dengan intensitas sedang, dan 20 (64,52%) terpulas dengan intensitas

kuat (Tabel 5.3).

Tabel 5.4 Interpretasi Ekspresi COX-2

Interpretasi Ekspresi COX-2 Jumlah

Negatif (Skor<4) 7 (22,59%)

Positif (Skor ≥4) 24 (77,42%)

Interpretasi ekspresi COX-2 dibagi menjadi 2 yaitu skor negatif jika

intensitas pulasan<4 dan skor positif jika pulasan≥4.Penelitian ini

memperlihatkan intensitas negatif pada 7 kasus (22,59%) dan intensitas positif

pada 24 kasus (77,42%) (Tabel 5.4).

Tabel 5.5 Microvessel Density sesuai dengan Ekspresi CD 31

Ekspresi CD 31 Jumlah

Rendah (COP <4,5) 9 (29,03%)

Tinggi (COP >4,5) 22 (70,97%)

Pada tabel 5.5 menunjukkan ekspresi CD 31 rendah yaitu 29,03% dan

tinggi 70,97%. Berdasarkan hasil analisis dengan menggunakan Receiver

Operating system (ROC) didapatkan bahwa nilai batas (cut off point) ekspresiCD

31 adalah 4,5 dengan nilai sensitivitas 100% dan nilai spesifisitas adalah 79%.

61

Gambar 5.1 Kurva ROC dari Ekspresi CD 31

5.3 Uji Normalitas COX-2 dengan Microvessel Density

Berdasarkan hasil uji normalitas data dengan uji Kolmogrov-Smirnov

didapatkan bahwa data COX-2 dan MVD berdistribusi normal (p>0,05). Untuk

mengetahui hubungan antara COX-2 dengan MVD digunakan uji korelasi

Pearson.

Tabel 5.6

Hubungan antara COX-2 dengan Microvessel density

62

MVD

r P Tinggi Rendah

COX-2 Positif 23 1

0,868 0,001 Negatif 1 6

Tabel 5.6 di atas menunjukkan bahwa dengan uji korelasi Pearson

didapatkan nilai r = 0,868 dan p = 0,001. Hal ini berarti bahwa terdapat hubungan

positif secara bermakna antara COX-2 dengan MVD (p<0,05).

Gambar 5.2 Hasil Pewarnaan Imunohistokimia COX-2 pada Undifferentiated carcinoma

nasopharynx terpulas pada <10% sel ganas dengan Intensitas Kuat (IHK COX-2, pembesaran 400x pada kotak kecil).

63

Gambar 5.3 Hasil Pewarnaan Imunohistokimia COX-2 pada Undifferentiated carcinoma

nasopharynx terpulas pada 10-50% sel ganas dengan Intensitas Kuat (IHK COX-2, pembesaran 400x pada kotak kecil)

Gambar 5.4 Hasil Pewarnaan Imunohistokimia COX-2 pada Undifferentiated carcinoma

nasopharynx terpulas pada >50% sel ganas dengan intensitas kuat (IHK COX-2, pembesaran 400x).

64

Gambar 5.5 Hasil Pewarnaan Imunohistokimia peritumoral dengan hasil MVD tinggi (IHK

CD 31, pembesaran 400x pada kotak kecil).

Gambar 5.6 Hasil Pewarnaan Imunohistokimia peritumoral dengan hasil MVD rendah (IHK

CD 31, pembesaran 400x pada kotak kecil).

65

Gambar 5.7 Hasil Pewarnan Imunohistokimia MVD pada intratumoral (IHK CD 31,

pembesaran 400x)

Gambar 5.7 Hasil Pewarnaan Imunohistokimia MVD pada intratumoral (IHK CD 31,

pembesaran 400x pada kotak kecil)

66

BAB VI

PEMBAHASAN HASIL

6.1 Karakteristik Subyek Penelitian

Pada penelitian ini didapatkan kasus undifferentiated carcinoma nasopharynx dari

bahan biopsi 26 kasus (83,9%)pada laki-laki dan 5 kasus (16,1%) pada perempuan.

Hasil yang didapatkan ini tidak jauh berbeda dengan yang didapatkan dari

kepustakaan bahwa karsinoma nasofaring lebih sering pada laki-laki daripada

perempuan (Chan et al., 2005).Lebih banyaknya penderita karsinoma nasofaring pada

laki-laki dibanding perempuan kemungkinan berhubungan dengan kebiasaan

merokok pada laki-laki lebih banyak daripada perempuan.Hal ini sesuai dengan

penelitian Taweevisit et al (2010) yang mendapatkan insiden pada laki laki lebih

sering daripada perempuan. Beberapa penelitian di berbagai negara juga

menunjukkan penderita karsinoma nasofaring lebih banyak daripada perempuan

dengan rata-rata perbandingan 2:1 (Xu et al., 2006).Berdasarkan data registrasi

kanker tahun 2010 di Bali karsinoma nasofaring lebih sering terjadi pada laki-laki

daripada perempuan dengan rasio 2:1.

Kasus undifferentiated carcinoma nasopharynx terbanyak ditemukan pada

dekade kelima (Chan,2006). Pada penelitian ini didapatkan usia terbanyak pada

dekade kelima dengan rentang usia 18 tahun sampai usia 71 tahun. Rerata usia pasien

67

dalam penelitian ini adalah 49,52±11,64 tahun. Hal ini sesuai dengan penelitian

Hasibuan (2014) mendapatkan kelompok usia terbanyak adalah kelompok 41-60

tahun dengan rerata 47,54±11,651.

6.2 Hubungan antara COX-2 dengan Microvessel Density

Inflamasi merupakan respon fisiologis tubuh terhadap iritasi maupun stimuli

yang mengubah homeostasis jaringan. Inflamasi akut dapat mengalami pemulihan

sempurna jika tubuh mampu mengeliminasi penyebabnya, tetapi jika tubuh tidak

mampu mengeliminasi akan berlanjut menjadi inflamasi kronis. Inflamasi kronis

menyebabkan kematian sel dan tubuh mengkompensasi dengan peningkatan

pembelahan sel. Bila diakselerasi dapat memudahkan terjadinya kesalahan

pembentukan DNA dan mutasi (mutagen).Reaksi inflamasi dapat meningkatkan

pelepasan sitokin dan faktor pertumbuhan.Secara umum sitokin ikut berperan pada

regulasi protein dan meregulasi COX-2 yang merupakan enzim untuk sintesis

prostaglandin (Soo, 2005).Inflamasi adalah salah satu faktor risiko pencetus

terjadinya keganasan pada beberapa organ.Rangsangan mekanik, kimia, fisik dan

mediator inflamasi akan melepaskan asam arakhidonat dari fosfolipid membran sel

melalui kerjadari fosfolipase A.Asam arakhidonat yang terbentuk akan mengalami

biotransformasi menjadi prostaglandin dan tromboksan melalui perantaraan enzim

COX (Xu et al., 2006).

Cyclooxygenase merupakan enzim penting pada jalur biosintetik

prostaglandin, tromboxan dan prostasiklin dari asam arakhidonat.Ekspresi seluler

COX-2 meningkat diatas normal pada stadium awal karsinogenesis dan selama

68

perkembangan serta invasif tumor. Prostaglandin dan enzim COX-2, yang

mengkatalisis produksi prostaglandin, merupakan mediator inflamasi yang terlibat

dalam proses angiogenesis (Bertagnolli, 2008).

Angiogenesis merupakan proses pembentukan pembuluh darah baru.

Pertumbuhan jaringan pembuluh darah baru sangat penting untuk proliferasi sel

kanker, karena proliferasi bergantung pada suplai oksigen, zat makanan dan

pembuangan zat sisa yang adekuat.Menurut Nishida et al (2006) angiogenesis juga

berperan penting dalam penyebaran sel kanker. Sel-sel kanker dapat menembus

masuk kedalam pembuluh darah ataupun limfe, bersirkulasi melalui aliran

intravaskular, dan kemudian berproliferasi pada tempat yang lain yang dikenal

sebagai metastasis. Angiogenesis merupakan proses pertumbuhan massa tumor.

Cyclooxygenase-2 merupakan faktor potensial yang penting pada angiogenesis

tumor.Cyclooxygenase-2 secara konsisten terekspresi dalam pembentukan pembuluh

darah baru dalam tumor dan pembuluh darah disekitar tumor.

Prostaglandin endoperoksidase sintesa-2 atau COX-2 adalah enzim kunci

dalam produksi prostaglandin.Enzim ini ditemukan meningkat pada berbagai

keganasan.Induksi COX-2 atau ekspresi berlebihan berhubungan dengan peningkatan

produksi PGE2.Prostaglandin-E2 menunjukkan adanya hubungan antara

perkembangan tumor dan biosintesis prostaglandin. Prostaglandin dan izoenzim

COX-2 dapat membantu proses sel normal seperti proliferasi sel, angiogenesis, dan

apoptosis. Prostaglandin E2 juga penting pada invasi tumor.Prostaglandin E2 dapat

meningkatkan kadar VEGF. Vascular Endothelial Growth Factor memproduksi

69

memproduksi MMP untuk memulai suatu proses angiogenesis. Matrix metalloprotein

memecah ekstraseluler matrix.Hal ini merangsang migrasi sel endotel.Sel endotel

mulai membelah begitu mereka bermigrasi ke jaringan sekitarnya.Kemudian tersusun

menjadi pembuluh darah baru dan kemudian berkembang menjadi pembuluh darah

matur (Nishida et al., 2006).Hal tersebut menjelaskan mengapa pada penelitian ini

ditemukan jumlah subyek dengan ekspresi COX-2 positif lebih besar dibandingkan

dengan yang negatif.

Pada penelitian ini diperoleh cut of point nilai MVD dengan kurva ROC

adalah 4,5 MV/LP. Sehingga pada penelitian diperoleh MVD rendah 29,03% dan

MVD tinggi 70,97%. Pada penelitian Hasibuan ditetapkan batas MVD 45 MV/LP.

Penelitia oleh Xu et al (2006) menemukan rata-rata MVD 32. Penelitian Zhao et al

(2006) pada kanker lambung mendapat rerata MVD 28,46±8,28, dengan cut of point

28, didapatkan 67 pasien dengan MVD tinggi dan 37 pasien engan MVD rendah.

Perbedaan hasil MVD pada berbagai penelitian ini mungkin disebabkan

perbedaan teknik pembacaan dan teknik pewarnaan dengan marker yang berbeda

seperti CD31, CD34, dan faktor VIII, dan hingga saat ini belum ada penelitian yang

membandingkan berbagai teknik pewarnaan ini untuk menentukan teknik pewarnaan

yang ideal (Rao et al., 2011).

Meskipun penelitian yang dilakukan oleh Hasibuan sudah pernah dilakukan

di Indonesia dengan hasil yang bermakna namun penelitian yang sama belum pernah

dilakukan di RSUP Sanglah Denpasar. Oleh karena itu pada penelitian ini kami

menilai ekspresi Cox-2 dan MVD pada undifferentiated carcinoma nasopharynx di

70

RSUP Sanglah Denpasar. Berdasarkan hasil uji normalitas data dengan uji

Kolmogrov-Smirnov didapatkan bahwa data COX-2 dan MVD berdistribusi normal

(p>0,05). Untuk mengetahui hubungan antara COX-2 dan MVD digunakan uji

korelasi Pearson. Hasil analisis dengan uji korelasi Pearson didapatkan nilai r =

0,868 dan p = 0,001. Hal ini berarti bahwa terdapat hubungan positif antara COX-2

dengan MVD (p<0,05). Hal ini sesuai dengan penelitian Hasibuan pada tahun 2014,

dimana hasil penelitiannya menunjukkan adanya korelasi positif sedang antara COX-

2 dengan microvessel density dengan koefisien korelasi r = 0,559 dengan p = 0,005.

Gallo et al (2008) menyatakan ditemukan adanya peningkatan angiogenesis pada

tumor dengan ekspresi COX-2 positif (p = 0,007). Berbeda dengan Tan dan Putti

pada tahun 2005 yang tidak menemukan adanya hubungan antara ekspresi COX-2

dan MVD pada undifferentiated carcinoma nasopharynx (p = 0,774).

71

BAB VII

SIMPULAN DAN SARAN

7.1 Simpulan

Penelitian ini mendapatkan kesimpulan bahwa terdapat adanya korelasi positif

antara ekspresi Cyclooxygenase-2 dan Microvessel density pada undifferentiated

carcinoma nasopharynx.

7.2 Saran

Adanya korelasi Cyclooxygnase-2 dan Microvessel density yang positif pada

undifferentiated carcinoma nasopharynx, maka pemberian penghambat COX-2 akan

dapat dipertimbangkan pada penderita dengan ekspresi COX-2 positif dan/atau

MVD> 4,5.

72

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2010. Kanker di Indonesia Tahun 2010 Data Histopatologik. Jakarta: Direktorat Jenderal Pelayanan Medik Departemen Kesehatan RI.

Anonim. 2012. Pengecatan Imunohistokimia p53. Cancer Chemoprevention Research Center fakultas Farmasi UGM.

Anonim. 2009. Primary antibodies. Biocare medical. 4040 pike lane, concord, CA 94520.

Bertagnolli, M., Viner, J.l., Hawk, E.T. 2008.Cyclooxygenase-2 as a Target for Cancer Prevention and Treatment.In : Tavassoli, F.A., Devilee, P (eds). Molecular Targeting in Oncology. Boston: Humana Press: p. 5093531

Brennan, B. 2006.Nasopharyngeal carcinoma.Orphanet Journal of Rare Diseases, vol 1, no.23.p.1-5

Chan, J.K.C., Pilch, B.Z., Kuo, T.T., Wenig, B.M., Lee, A.W.M. 2005.Nasopharyngeal carcinoma. In: Barnes L, Eveson, J.W, Reichart, P, Sidrasky, D editors. WHO classification of tumours: Pathology and genetics

head and neck tumours. Lyon: IARCPress. p. 85-97.

Chang, J.T., Chan, S.H., Lin, C.Y., Lin, T.Y., Wang, H.M., Liao, C.T., Wang, T.H., Lee, L.Y., Cheng, A.J. 2007.Differentially expressed genes in radioresistant nasopharyngeal cancer cells: gp96 and GDF15.Mol. Cancer Ther, 6:2271–2279.

Cho, WC, 2007. Nasopharyngeal Carcinoma: Molecular Biomarker Discovery and Progres. Molecular Cancer, 6:1.

73

Choi, W.W.L., Lewis, M.M., Lawson, D., Goen, Q.Y., Birdsong, G.G., Cotsonis, G.A. 2005. Angiogenic and lymphangiogenic microvessel density in breast carcinoma: correlation with clinicopathologic parameter and VEGF family gene expression. Mod pathology, 18:143-52.

Chou, J., Lin, Y.C., Kim, J., You, L., Xu, Z., He, B. 2008.Nasopharyngeal carcinoma-review of the molecular mechanisms of tumorigenesis.Head and

Neck-DOI, 10:1002.

Choudhary, S., Wang, H.C.R. 2007.Proapoptotic ability of oncogenic H-ras to facilitate apoptosis induced by histone deacetylase inhibitors in human cancer cells.Mol Cancer Ther, 6(3):1099-111.

Desen, W. 2008. Tumor kepala dan leher. In: Desen W, editor. Buku ajar onkologi

klinis edisi II. Jakarta: Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. p. 263-78.

Divvela, A.K., Challa, S.R., Tagaram, I.S. 2010.Pathogenic Role of Cyclooxygenase32 in Cancer. J H Science, 56:5023516.

El-Gehani, K., Al-Kikhia, L., Mansuri, N., Syrjanen, K., Al-Fituri, O., Elzagheid, A. 2011. Angiogenesis in urinary bladder carcinoma as defined by microvessel density (MVD) after immunohistochemical staining for factor VII and CD31. Libyan J Med, vol 6, pp. 6016.

Evoric, B.M., Neuchrist, C., Berger, U., El-Rabadi, K., Burian, M. 2005.

Quantitation of microvessel density in squamous cell carcinoma of the head and neck by computer-aided image analysis. Wien Klin Wochenschr, vol. 117, no. 1 pp. 53-57

Feng, X.P., Yi, H., Li, M.Y., Li, X.H., Yi, B., Zhang, P.F., Li, C., Peng, F., Tang, C.E., Li, J.L. 2010.Identification of biomarkers for predicting nasopharyngeal carcinoma response to radiotherapy by proteomics.Cancer Res, 70: 3450–3462.

74

Gallo, O., Franchi, A., Magnelli, L., Sardi, I., Vanacci, A. 2008. Cyclooxygenase-2 Pathway correlates with VEGF expression in head and neck cancer: implication for tumor angiogenesis and metastasis. Neoplasia. 3(1):53-61.

Garden, A. 2010.The nasopharynx. In: Co, J.D, Ang, K.K, editors. Radiation

oncology: rationale, technique, results. Philadelphia: Mosby Elsevier. p. 207-20.

Giordano, A., De-Falco, G., Rubin, E., Rubin, R. 2008.Neoplasia. In: Rubin, R., Strayer, D.S., editors. Rubin’s Pathology Clinicopathologic Foundations

Medicine Fifth Edition. Philadelphia: Wolters Kluwer. p. 137-176.

Greenhough, A., Smartt, A.J.M., Moore, A.E., Roberts, H.R., Williams, A.C., Paraskeva, C., Kaidi, A. 2009. The COX-2/PGE2pathway: key roles in the hallmarks of cancer and adaptation to the tumour microenvironment. Oxford

Journal. 30(3): 377-386.

Hasibuan, N.R., Farhat., Haryuna, T.S.H., Yudhistira,a. 2014, Korelasi positif ekspresi cyclooxygenase-2 dengan gambaran microvessel density pada karsinoma nasofaring. ORLI, 44:1.

Howe, L.R. 2007.Cyclooxygenase / Prostaglandin Signaling and Breast Cancer.BC

Research, 9:210.

Hsiao, S.H., Lee, M.S., Lin, H.Y., Su, Y.C., Ho, H.C., Hwang, J.H., Lee, C.C., Hung, S.K. 2009. Clinical significance of measuring levels of tumor necrosis factor-alpha and soluble interleukin-2 receptor in nasopharyngeal carcinoma.Acta Otolaryngol. 129, 1519–1523.

Ji, B., Liu, Y., Zhang, P., Wang, Y., Wang, G. 2012. COX-2 Expression and Tumor Angiogenesis in Thyroid Carcinoma Patient among Northeast Chinese Population-Result of Single-Center Study.Int J Med Sci. 9(3): 237-42.

75

Jiang, R., Cabras, G., Sheng, W., Zeng, Y., Ooka, T. 2009. Synergism of BARF1 with ras induced malignant transformation in primary primate epithelial cells and human nasopharyngeal epithelial cells. Neoplasia. 9:964-73.

Klimek, M., Urbański, K., Kojs, Z., Karolewski, K., Pudetek, J., Blecharz, P. 2009. Role of Cyclooxygenase-2 in Cervical Cancer. Arch Med Sci., 3:303-307.

Korcum, A.F., Özyar, E., Ayhan, A. 2006. Epstein-Barr virus genes and n[-asopharyngeal cancer. Turk J Cancer. 36 (3): 97-107.

Kumar., Abas., Fausto., Aster. 2010. Neoplasm. In: Robbins Cotran Pathologic

Basis of Desease. Eight Edition. Kumar Vinay. Philadelphia: Saunders Elsevier. p. 62-70.

Levine, A.J., Hu, W., Feng, Z. 2008. Tumor supressor genes. In: Mendelsohn, J., Howley, P..M, Israel, M.A., Gray, J.W., Thompson, C.B, editors. The

moleculaar basis of cancer. 3th ed. Philadelphia: Saunders. p. 31-8.

Lin, D.T., Subbaramaiah, K., Shah, J.P. 2006. Cyclooxygenase-2: a novel molecular target for the prevention and treatment a head and neck cancer. Head neck. 24:792-9.

Lu, H., Ouyang, W., Huang, C. 2006. Inflamation, a Key Event in Cancer Development.Molecular Cancer Research Journal. 4: 221-233.

Machin, D., Cambell, M.J., Tan, S.B., Tan, S.H. 2009.Sample size table for clinical studies.Third edition.A john wiley and sons.UK.

Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwil, F. 2008. Cancer-related inflammation.Nature, vol. 24, no. 254, pp. 436-44.

Monica, B., Jaye, L., Viner., Ernest, T., Hawk. 2008. Cyclooksigenase-2 as a Target for Cancer Prevention and Treatment. In: Kaufman H.L., Wadler S., Anntman K., Eds. Molecular Targeting In Oncology. Humana Press. p.509-541.

76

Mozes, S.N., Kupets, R., Rasty, G., Ismiil, N., Covens, A., Khalifa, M.A. 2005.

Cyclooxygenase-2 (COX-2) Immunostaining Does not Correlate withThe Degree of Vulvar Neoplasia. November., (Cited 2006 February. 2). Available from: http://www.jogc.com/abstracts/full/200604_Gynaecology_1.pdf. Accessed Pebruari, 10 2014.

Nancy R.T. Epstein Barr Virus in the Pathogenesis of NPC.In: Erles S.R. editor

Epstein Barr Virus, 1 st ed. Phyladelphia Pennsylvania 2005:p.71-87.

Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. 2006. Angiogenesis in cancer. Vascular Health and Risk Management, vol. 2, no. 3, p. 213-219.

Pang, R.W.C., Poon, R.T.P. 2006.Clinical implications of angiogenesis in cancers. Vascular Health and Risk Management, vol. 2, no. 2, p. 97-108.

Qu, C., Liang, Z., Huang, J., Zhao, R., Su, C., Wang, S., Wang, X., Zhang, R., Lee, M.H., Yang, H. 2012. MiR-205 determines the radioresistance of human nasopharyngeal carcinoma by directly targeting PTEN. Cell Cycle. 11, 785–796.

Rao ,V.U.S., Shenoy, A.M., Kanthikeyan, B. 2011. Role of angiogenetic marker to predict neck node metastasis in head and neck.J cancer Res Ther. 6(2): 1412-6.

Ristimaki, A., Sivula, A., Lundin, J., Lundin, M., Salminen, T., Haglun, C., Joensuu, H., Isola, J. 2012.Prognosis Significant of Elevated Cyclooxigenase-2 Expression in Breast Cancer.Cancer Research Journal.62: 632.

Roezin A. 2007. Karsinoma nasofaring. In: Soepardi, Arsyad E, editors. Buku ajar

ilmu kesehatan telinga hidung tenggorok kepala dan leher. Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. p. 182-98.

77

Rottey, S., Madani, I., Deron, P., van Belle, S. 2011. Modern treatment for nasopharyngeal carcinoma: Current status and prospects. Curr.Opin.Oncol. 23, 254–258.

Soo R. 2005. Overexpression of Cycloogenase-2 in Nasopharyngeal Carcinoma and Association With Epidermal Growth Factor Receptor Expression Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 131;p.147 – 152.

Sonawane, C.S., Jagdale, D.M., Kadam, V.J. 2011. Review Article: Role of Cyclooxygenase-2 in Cancer. International Journal of Research in Pharmacy

and Chemistry, 1(3):385-395.

Stasinopoulos, I., Mori, N., Bhujwalla, Z.M. 2008. The Malignant Phenotype of Breast Cancer Cells Is Reduced by COX32 Silencing. BMC Cancer, 10:116331169

Surowiak, P., Materna, V., Matkowski, R., Kornafel, J., Wojnar, A., Pudelko, M. 2005. Relationship between the Expression of Cyclooxygenase 2 and MDR1/P3Glycoprotein in Invasive Breast Cancers and their Prognostic Significance. J Breast Cancer, 7: 8623870

Svagzdys, S., Lesauskaite, V., Pavalkis, D., Nedzelskiene, I., Pranys, D., Tamelis, A. 2009. Microvessel density as new prognostic marker after radiotherapy in rectal cancer.Biomed Cancer, 9(95): 1-8.

Tan, E.L., Looi, L.M., Sam, C.K. 2006.Evaluation of plasma Epstein-Barr virus DNA load as a prognostic marker for nasopharyngeal carcinoma. Singapore

Med. J. 47, 803–807.

Tan, K.B., Putti, T.C. 2005. Cyclooxygenase-2 expression in nasopharyngeal carcinoma: immunohistochemical finding and potential implication. Journal

clinical pathology. 58(5):535-8

78

Tang, F., Xie, C., Huang, D., Wu, Y., Zeng, M., Yi, L., Wang, Y., Mei, W., Cao, Y., Sun, L. 2011.Novel potential markers of nasopharyngeal carcinoma for diagnosis and therapy.Clin.Biochem. 44, 711–718.

Tao, Q., Anthony, T.C. 2007.Nasopharyngeal carcinoma.Molecular Pathogenesis

and Therapeutic Development in Expert review in molecular medicine. Vol 9.

Taweevisit, M., Keelawat, S., Thoner P.S. 2010. Correlation of microvascular density and proliferation index in undifferentiated nasopharyngeal carcinoma. Asian Biomedicine.vol.4, no.2, pp.315-321.

Tse, L.A., IT-S, Y., OW, KM., Wong, S.L. 2006. Incidence rate trends of histological subtypes of nasopharyngeal carcinoma in Hong Kong. British J Cancer. 95:1269-73.

Uppaluri, R., Dunn, G.P., Lewis, J.S. 2008. Focus on TILs: prognostic significance of tumor infiltrating lymphocytes in head and neck cancer. Cancer immunity.8, 16-26.

Widiastuti., Prija, T.K.S., Alsagaf, J.H., Koentjono, W.A. 2011. Ekspresi Protein Cox-2 pada Karsinoma Nasofaring Respon Tinggi dan Respon Rendah Pasca- Radioterapi. JBP, 13(2):105-114.

Wee, J.T., Ha, T.C., Loong, S.L., Qian, C.N. 2010. Is nasopharyngeal cancer really a “Cantonese cancer”? Chin. J. Cancer. 29, 517–526.

Xie, P., Yue, J.B., Fu, Z., Feng, R., Yu, J.M. 2010. Prognostic value of 18F-FDG PET/CT before and after radiotherapy for locally advanced nasopharyngeal carcinoma. Ann. Oncol. 21, 1078–1082.

Xu, X., Hu, G., Li, S., Xu, F., Li, D., Dai, D., Chen, Y. 2006. Expression of cyclooxygenase-2 in nasopharyngeal carcinoma and its relation to angiogenesis and prognosis.Chinese-German J Clin Oncol. 5(2):104-7.

79

Yang, S., Chen, J., Guo, Y., Lin, H. Zhang, Z., Feng, G., Hao, Y., Cheng, J., Liang, P., Chen, K. 2012.Identification of prognostic biomarkers for response to radiotherapy by DNA microarray in nasopharyngeal carcinoma patients.Int. J.

Oncol. doi:10.3892/ijo.2012.1341.

Zhargi, A., Arfaei, S. 2011. Review Article: Selective COX-2 Inhibitors: A Review of Their Structure-Activity Relationships. Iran J Pharm Res 10(4):655-683

Zhao, H.C., Qin, R., Chen, X.X., Sheng, X., Wu, J.F., Wang, D.B. 2008. Microvessel density is a prognostic marker of human gastric cancer. World J

Gastroenterol. 2006; 12(47): 7598-603.

Zheng, H., Li, L., Hu, D., Deng, X., Cao, Y. 2007. Role of Epstein-Barr virus encoded Latent Membrane Protein 1 in the carcinogenesis of nasopharyngeal carcinoma. Celular & Molecular Immunology. 4(3):185-96.

. .

80

Lampiran 1. Penilaian ekspresi COX-2 dan CD 31

1. Penilaian ekspresi Cox-2 dibuat berdasarkan analisis persentase sel tumor yang

positif dan intensitas pewarnaan. Berdasarkan persentase sel ganas yang

menunjukkan overekspresi Cox-2 maka dibagi menjadi 3 skor (0-3) yaitu: 0 (tidak

terwarnai), 1 (<10% sel dari seluruh sel ganas terwarnai), 2 (10-50% sel dari seluruh

sel ganas terwarnai), 3 (>50% sel dari seluruh sel ganas terwarnai). Berdasarkan

intensitas sel-sel ganas yang menunjukkan overeksprei COX-2 maka dibagi menjadi

3 skor (0-3) yaitu: 0 (negatif), 1 (lemah), 2 (sedang), 3 (kuat) (Tan dan Putti, 2005).

Interpretasi ekspresi COX-2 dari sel tumor, sesuai dengan penelitian sebelumnya

digunakan skor immunoreaktif, diperoleh dengan mengalikan skor % sel ganas yang

mengekspresikan COX-2 dengan skor intensitas. Skor imunoreaktif 4 atau lebih

dinilai sebagai ekspresi COX-2 positif, skor imunoreaktif kurang dari 4 dinyatakan

sebagai COX-2 negatif (Tan dan Putti, 2005).

2. Untuk penghitungan microvessel density, pulasan CD31 dinilai pada pembesaran

lemah (40x) untuk area yang menunjukkan peningkatan pembuluh darah (hot spots).

Pada area hotspot dilihat pada pembesaran kuat 400x dengan mikroskop cahaya

binokuler CX-21.Empat lapang pandang pada 1 slide dipilih untuk mewakili area

seluas 1 mm2. Intratumoral dan peritumoral microvessel (pembuluh darah dengan

diameter ˂ 50µm tanpa lapisan muscular) dihitung jumlah microvessel pada masing-

masing empat lapang pandang dengan cara digeser, dan hasilnya digabungkan untuk

81

mendapatkan microvessel/mm2 (Taweevisit et al., 2010). Interpretasi MVD rendah

dan tinggi ditentukan dengan analisis menggunakan kurva ROC.

82

83

84

Lampiran 4.Data Subyek Penelitian

No

No CM

Jenis kel/ Umur

No PA

COX-2

Microvessel Density

Distri-

busi Inten-sitas

Skor Interpre-tasi

Jumlah Interpre-tasi

1 14003193 L,58 272/PP/14 3 3 9 positif 15 tinggi 2 14004532 L,64 460/PP/14 3 3 9 positif 16 tinggi 3 14005444 L,45 462/PP/14 3 3 9 positif 18 tinggi 4 1609275 L,45 522/PP/14 1 1 1 negatif 0 rendah 5 14007336 P,56 560/PP/14 2 2 4 positif 1 rendah 6 1343032 L,54 781/PP/14 2 2 4 positif 5 tinggi 7 1620807 L,48 844/PP/14 2 3 6 positif 7 tinggi 8 1647871 L,40 898/PP/14 2 3 6 positif 8 tinggi 9 14010199 L,55 928/PP/14 2 3 6 positif 10 tinggi 10 14008167 L,43 1082/PP/14 2 2 4 positif 5 tinggi 11 14014991 L,38 1150/PP/14 3 3 9 positif 18 tinggi 12 14015471 L,53 1216/PP/14 3 3 9 positif 19 tinggi 13 14016655 L,61 1238/PP/14 3 3 9 positif 26 tinggi 14 1631367 L,48 1464/PP/14 1 3 3 negatif 0 rendah 15 14019854 P,40 1535/PP/14 3 2 6 positif 5 tinggi 16 14021471 L,38 1617/PP/14 2 1 2 negatif 1 rendah 17 14024418 L,69 1730/PP/14 3 2 6 positif 5 tinggi 18 14025054 L,42 1758/PP/14 1 1 1 negatif 0 rendah 19 14023849 P,43 1772/PP/14 1 2 2 negatif 2 rendah 20 14026592 L,55 1955/PP/14 3 2 6 positif 5 tinggi 21 14018313 L,18 1960/PP/14 3 3 9 positif 16 tinggi 22 14028871 P,48 1993/PP/14 2 3 6 positif 10 tinggi 23 14027940 L,58 2075/PP/14 2 3 6 positif 8 tinggi 24 14034801 L,54 2397/PP/14 3 3 9 positif 13 tinggi 25 14034067 L,28 2443/PP/14 3 3 9 positif 9 tinggi 26 14037561 L,45 2647/PP/14 1 2 2 negatif 4 rendah 27 14016868 P,64 2667/PP/14 2 3 6 positif 6 tinggi 28 14036260 L,64 3278/PP/14 3 3 9 positif 13 tinggi 29 14047828 L,47 3676/PP/14 3 3 9 positif 12 tinggi 30 14050574 L,43 3926/PP/14 1 3 3 negatif 0 rendah 31 14053195 L,71 4322/PP/14 3 3 9 positif 12 tinggi

85

Lampiran 5

Uji Normalitas Data Umur, COX-2, dan CD 31

Cox-2 CD_31 Umur

N 31 31 31

Normal Parametersa

Mean 6.03 8.68 49.52

Std. Deviation 2.869 6.720 11.636

Most Extreme Differences

Absolute .237 .127 .100

Positive .150 .127 .100

Negative -.237 -.098 -.097

Kolmogorov-Smirnov Z 1.317 .708 .558

Asymp. Sig. (2-tailed) .062 .697 .915

a. Test distribution is Normal.

Lampiran 6

Analisis Deskriptif Jenis Kelamin dan Umur

Jenis_Kelamin

Frequency Percent Valid Percent Cumulative Percent

Valid Laki-laki 26 83.9 83.9 83.9

Perempuan 5 16.1 16.1 100.0

Total 31 100.0 100.0

Descriptive Statistics

N Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Umur 31 18 71 49.52 11.636

Valid N (listwise) 31

86

Lampiran 7

UJi Korelasi Pearson antara Cox-2 dengan CD 31

Correlations

Cox_2 CD_31

Cox-2 Pearson Correlation 1 .868**

Sig. (2-tailed) .000

N 31 31

CD_31 Pearson Correlation .868** 1

Sig. (2-tailed) .000

N 31 31

**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).

Lampiran 8

Kurva ROC Data CD 31

87

Area Under the Curve

Test Result Variable(s):CD_31

Area Std. Errora Asymptotic Sig.b

Asymptotic 95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

.914 .056 .054 .804 1.024

The test result variable(s): CD_31 has at least one tie between the positive actual state group and the negative actual state group. Statistics may be biased.

a. Under the nonparametric assumption

b. Null hypothesis: true area = 0.5

Coordinates of the Curve

Test Result Variable(s):CD_31

Positive if Less Than or Equal Toa Sensitivity 1 - Specificity

-1.00 .000 .000

.50 .500 .103

1.50 1.000 .138

3.00 1.000 .172

4.50 1.000 .207

5.50 1.000 .379

6.50 1.000 .414

7.50 1.000 .448

8.50 1.000 .517

9.50 1.000 .552

11.00 1.000 .621

12.50 1.000 .690

14.00 1.000 .759

15.50 1.000 .793

17.00 1.000 .862

18.50 1.000 .931

22.50 1.000 .966

27.00 1.000 1.000

The test result variable(s): CD_31 has at least one tie between the positive actual state group and the negative actual state group.

a. The smallest cutoff value is the minimum observed test value minus 1, and the largest cutoff value is the maximum observed test value plus 1. All the other cutoff values are the averages of two consecutive ordered observed test values.