Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora

Pristupnik: Vana KoštaPredloženi mentor: prof. dr. sc. Ivica Grković

uvod

Imunohistokemijska obilježja nodoznog ganglija

neurotransmiteri: glutamat, katekolamini, serotonin, acetilkolin

neuropeptidi: CGRP, ENK, galanin, NPY, SOM, SP, NKA, VIP

IB4, N52, TRPV1

kalcij vežući proteini: CALR, CALB, PARV

Imunohistokemija obilježja “srčanih” neurona u nodoznom gangliju

svega 2-5 % svih neurona nodoznog ganglija

N52 61% IB4 20 % SP 17% CGRP 9%

Aδ vlakna C vlakna 70%

Promjene u neurotransmiterskom ili neuropeptidnom fenotipu

promjene okoliša uvjetovane:

bolesnim stanjima ozljedom živca promjenom u aksonalnom transportu tjelovježbom

Srce i tjelovježba

Utjecaj tjelovježbe na vagus

Pojačana vagalna aktivnost

Smanjenje srčane frekvencije u mirovanju (Lin et al. 1972., Wisloff et al. 2001., Danson et al. 2003.)

Kardioprotektivni utjecaj tjelovježbe posredovan vagusom (Buch et al. 2002. i Buchheit et al. 2004.)

Utjecaj tjelovježbe na imunohistokemijska obilježja neurona

Povećnje br neurona u hipokampusu koji eksprimiraju kalcij vežuće proteine (Arida et al. 2004 i Choi et al. 2009.)

Nastanak novih neurona u području hipokampusa (Jin et al. 2008.)

Problematika i cilj istraživanja1.) Nema studija koje uspoređuju imunohistokemijske

karakteristike osjetnih neurona koji se projiciraju u različite djelove srca (klijetke i pretklijetke).

Naš cilj je odrediti brojčane, morfološke i imunohistokemijske karakteristike osjetnih nurona unutar nodoznog ganglija koji se projiciraju u različite djelove srca što će nam biti važna ishodišna točka za daljnje istraživanje.

2.) Utjecaj vagalne aktivnosti na zbivanja u

organizmu tijekom i nakon tjelovježbe izrazito je značajan, ali vrlo se malo zna o mehanizmima srčane vagalne kontrole i načinu na koji je ona modulirana tjelovježbom.

Cilj našeg istraživanja je utvrditi mogu li intenzivna aerobna tjelovježba i posljedična promjena srčane strukture izazvati promjene neurokemijskog fenotipa osjetnih srčanih neurona u nodoznom gangliju štakora.

Hipoteza

1. Imunohistokemijske karakteristike osjetnih neurona koji inerviraju srčane klijetke i pretklijetke su različite. 

2. Tjelovježba i posljedične strukturalne promjene lijeve klijetke bit će dovoljan poticaj za kvantitativne i imunohistokemijske promjene osjetnih srčanih neurona u nodoznom gangliju.

 

Metode istraživanja

1. Pokusne životinjeSprague-Dawley rats

N=28

8 tjedana

60 min/dan

28 m/s

nagib 10º

5 dana/tjedan

Tjelovježba

2. Postupci:

N (štakora podvrgnutih operaciji) =28 (svi)

a) Kirurški zahvat (Huikeshoven et al. 2000.)

b) Priprema tkiva

c) Imunohistokemijsko bojanje

Protutijelo Kat. br. VrstaRazrijeđenj

eIzvor

Primarno

Neurofilament 200MAB

5266Miš 1:1000 Sigma, St. Louis, USA

Kalretinin Ab702 Zec 1:400

Abcam plc.332

Cambridge Science Park,

Cambridge,UK

Sekundarno

Zečji IgG-R F2507Magara

c1:200 Santa Cruz Biotechnology

Mišji IgG (H+L), TR 71C3-1 Koza 1:200Molecular Probes,

Eugene, Oregon, USA

IB4 konjugiranim s fluorescein isotiocijanatom (FITC) (1:200, Sigma, St. Louis, USA)

3. Statistički postupci

Broj FB pozitivnih neurona, promjer stanica, tjelesna težina životinja i težina njihovih srdaca izrazit će se kao aritmetička sredina±SD.

Obrada će se napraviti uz pomoć GraphPad (La Jolla, CA, USA) računarskog programa; razina statističke značajnosti bit će p<0.05.

Koristit će se Hi-kvadrat test za usporedbu imunopozitivnosti među skupinama, a za ostale podatke koristit će se Kolmogorov-Smirnov test nakon kojeg će slijediti t-test/ANOVA ili Mann-Whitney U test/Kruskal-Wallis

Znanstveni doprinos

Imunohistokemijska obilježja neurona nodoznog ganglija koji se projiciraju u različite dijelove srca bit će opisana po prvi put.

Time će se razlučiti eventualno postojanje različitih podskupina neurona koji su odgovorni za inervaciju točno određenog dijela srca i kao takvi predstavljaju metu za daljnja istraživanja i potencijalni cilj terapijskog djelovanja.

Po prvi put će se prikazati i utjecaj tjelovježbe na imunohistokemijske karakteristike osjetnih neurona nodoznog ganglija koji se projiciraju u područje lijeve srčane klijetke.

Budući da je tjelesna aktivnost teška i zahtjevna posebice za srčane bolesnike, a smatra se da dobrobit tjelovježbe leži upravo u pojačanoj vagalnoj aktivnosti smatramo da je svako rasvjetljavanje vagalnih promjena tijekom tjelovježbe važno.

Dosadašnji rezultati:

prosječan broj FB obojanih neurona u nodoznom gangliju 51 (51±30, 9-133) značajno veći br neurona koji se projicirao u klijetke nego u pretklijetke 65.8±35 vs. 39.6±21, p=0.03

Košta, V., et al., Immunohistochemical characteristics of neurons in nodose ganglia projecting to the differentchambers of the rat heart, Auton. Neurosci. (2010), doi:10.1016/j.autneu.2010.01.001

Scale bar=50µm

Imunohistokemijska obilježja srčanih neurona nodoznog ganglija

Imunohistokemijska obilježja neurona nodoznog ganglija koji se projiciraju u različite djelove srca

FB-označeni neuroni

(N = 736)

Lijeva pretklijetka

(N = 155)

Desna pretklijetka

(N = 179)

Lijeva klijetka

(N = 245)

Desna klijetka

(N = 157)

IB4+ 19/155 (12) 37/179 (21) 45/245 (18) 41/157 (26)

N52+ 43/76 (56) 46/82 (56) 70/116 (60) 31/70 (44)

CALR+ 10/79 (13) 10/97 (10) 51/129 (40) 27/87 (31)