Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na

srčane neurone u nodoznom gangliju štakora

doktorant: Vana Koštamentor: prof. dr. sc. Ivica GrkovićZavodu za anatomiju, histologiju i

embriologiju Medicinskog fakulteta u Splitu

Inervacija srca

uvod

Nodozni ganglij

Imunohistokemijska obilježja

neurotransmiteri: glutamat, katekolamini, serotonin,

acetilkolin

neuropeptidi: CGRP, ENK, galanin, NPY, SOM, SP, NKA,

VIP

IB4, N52, TRPV1

bjelančevine koje vežu kalcij: CALR, CALB, PARV

Imunohistokemijska obilježja “srčanih” neurona u nodoznom gangliju

svega 2-5 % svih neurona nodoznog ganglija

Aδ vlakna C vlakna 70%

N52 61% IB4 20 % SP 17% CGRP 9%

Utjecaj tjelovježbe na srce

povećanje udarnog srčanog volumena

povećanje volumena desne i lijeve klijetke

hipertrofija miokarda

promjene u nadzornom djelovanju autonomnog živčanog sustava

Utjecaj tjelovježbe na vagus

pojačana vagalna aktivnost

smanjenje srčane frekvencije u mirovanju (Lin et al. 1972., Wisloff et al. 2001., Danson et al. 2003.)

kardioprotektivni utjecaj tjelovježbe posredovan vagusom (Buch et al. 2002. i Buchheit et al. 2004.)

Utjecaj tjelovježbe na neurone

povećanje broja neurona u hipokampusu koji eksprimiraju bjelančevine koje vežu kalcij (Arida i sur. 2004 i Choi i sur. 2009.)

nastanak novih neurona u području hipokampusa (Jin i sur. 2008.)

produljeno preživljenje neurona (van Praag i sur. 1999. i Jin i sur. 2008.)

Obilježiti „srčane“ neurone unutar nodoznog ganglija koji se projiciraju u različite dijelove srca i obilježene skupine neurona usporediti brojčano, morfološki i imunohistokemijski.

Utvrditi može li intenzivna aerobna tjelovježba i posljedična promjena srčane strukture izazvati promjene neurokemijskog fenotipa osjetnih srčanih neurona u nodoznom gangliju štakora.

Ciljevi istraživanja

Hipoteze istraživanja

1. Imunohistokemijske karakteristike osjetnih neurona koji inerviraju srčane klijetke i pretklijetke su različite.

2. Tjelovježba i posljedične strukturalne promjene lijeve klijetke bit će dovoljan poticaj za kvantitativne i imunohistokemijske promjene osjetnih srčanih neurona u nodoznom gangliju.

metode istraživanja

Pokusne životinjeSprague-Dawley rats

N=24

Kirurški zahvat i obilježavanje neuronalnom bojom (Huikeshoven et al. 2000.)

Priprema tkiva

Mjerna jedinica = 1mm na D, 400μm na E i 100μm na slici F

Dvostruka imunohistokemija

protutijelo kat. br. vrsta razrijeđenje proizvođač

primarno

neurofilament 200 MAB 5266 miš 1:1000 Sigma, St. Louis, SAD

kalretinin Ab702 zec 1:400Abcam plc.332 ,

sekundarno

zečji IgG-R F2507 magarac 1:200 Biotechnology

mišji IgG (H+L), TR 71C3-1 koza 1:200 Molecular Probes,

Eugene, Oregon, SAD

Primarna i sekundarna protutijela

izolektin konjugiranim s fluorescein isotiocijanatom (FITC) (1:200, Sigma, St. Louis, SAD)

Tjelovježba

8 tjedana

60 min/dan

5 dana/tjedan

nagib 10º

28 m/min

Statistički postupci

Broj FB pozitivnih neurona, promjer stanica, tjelesna težina životinja i težina njihovih srdaca izražen je kao aritmetička sredina±SD.

Obrada se napravila uz pomoć GraphPad (La Jolla, CA, USA) računarskog programa; razina statističke značajnosti je p<0,05.

Hi-kvadrat test koristili smo za usporedbu imunopozitivnosti među skupinama, a za ostale podatke Kolmogorov-Smirnov test nakon kojeg je slijedio t-test ili ANOVA

rezultati

Obilježja neurona nodoznog ganglija koji inerviraju srce štakora

prosječan broj FB obojanih

neurona u nodoznom gangliju 51

(51±30, 9-133)

značajno veći br neurona koji se

projicirao u klijetke nego u

pretklijetke 65,8±35 vs. 39,6±21,

p=0,03N=1344

Neurokemijski fenotip i morfološka obilježja srčanih aferentnih neurona u nodoznom gangliju

Izolektin pozitivni srčani neuroni

Mjerna jedinica = 50µm.

23% IB4+ neurona projicira se u desnu stranu srca dok se u lijevu stranu srca projicira 16% IB4+ neurona (p=0,01, Hi-kvadrat test).

Neurofilament 200 pozitivni srčani neuroni

Mjerna jedinica = 50µm.

60% neurona je koji se projiciraju u lijevu klijetku su N52+, dok je udio N52+ neurona koji se projiciraju u desnu klijetku 44% (p=0,03, Hi-kvadrat test).

Kalretinin pozitivni srčani neuroni

Mjerna jedinica = 25µm.

36% neurona koji se projiciraju u klijetke su CALR+, dok je samo 11% neurona koji se projiciraju u pretklijetke CALR+ (p<0,0001, Hi-kvadrat test).

Neurokemijski profil neurona u nodoznom gangliju koji se projiciraju u različite dijelove srca. Svi podaci su prikazani kao proporcije s postotkom u zagradama.

FB obilježeni

neuroni (N=736)

lijeva

pretklijetka

(N=155)

desna

pretklijetka

(N=179)

lijeva klijetka

(N=245)

desna klijetka

(N=157)

IB4+ 19/155 (12) 37/179 (21) 45/245 (18) 41/157 (26)

N52+ 43/76 (56) 46/82 (56) 70/116 (60) 31/70 (44)

CALR+ 10/79 (13) 10/97 (10) 51/129 (40) 27/87 (31)

Neurokemijski profil dvostrukog bojenja (kolokalizacije) FB-om obilježenih neurona u nodoznom gangliju koji se projiciraju u različite dijelove srca. Svi podaci su prikazani kao proporcije s postotkom u zagradama.

FB obilježeni

neuroni (N=736)

lijeva

pretklijetka

(N=155)

desna

pretklijetka

(N=179)

lijeva klijetka

(N=245)

desna klijetka

(N=157)

IB4+N52+ 2/76 (3) 5/82 (6) 2/116 (2) 2/70 (3)

IB4-N52- 26/76 (34) 22/82 (27) 26/116 (22) 20/70 (29)

IB4+CALR+ 2/79 (3) 1/97 (1) 9/129 (7) 3/87 (3)

IB4-CALR- 66/79 (84) 70/97 (72) 65/129 (50) 43/87 (49)

Utjecaj tjelovježbe na srce i neurone nodoznog ganglija štakora

Utjecaj tjelovježbe na srce i tjelesnu težinu vježbanih i kontrolnih životinja. Vrijednosti su izražene kao aritmetičke sredine±S.D.

kontrolne

životinje

vježbane

životinje

tjelesna težina, g 228±17,5 256±21,3

težina srca, g 0,956±0,06 1,093±0,16

težina srca/tjelesna težina,

x10004,20±0,38 4,25±0,34

Neurokemijski profil neurona nodoznog ganglija koji se projiciraju u lijevu klijetku u životinja podvrgnutih tjelovježbi i u kontrolnih životinja. Svi podaci su prikazani kao proporcije s postotkom u zagradama.

FB+ neuroni

kontrolnih životinja

(N=238)

FB+ neuroni životinja

podvrgnutih

tjelovježbi (N=176)

IB4+ 83/238 (34) 57/176 (32)

N52+ 73/118 (62) 55/77 (71)

CALR+ 18/120 (15) 18/99 (18)

Mali broj neurona pokazao je dvostruka bojenja

Mjerna jedinica = 50µm.

Utjecaj tjelovježbe na veličinu srčanih neurona

U skupini podvrgnutoj tjelovježbi promjer N52+ neurona (24,5±4,5μm, N=30) značajno je veći i od promjera CALR+ (21,2±3,2μm, N=30) i od IB4+ neurona (21,4±4,2μm) (p=0,0071, jednosmjerna analiza varijance (ANOVA) za nezavisne uzorke popraćena Bonferronijevim testom).

Promjer N52+ neurona značajno je veći u životinja podvrgnutih tjelovježbi nego u životinja u kontrolnoj skupini (p=0,016, t-test za nezavisne uzorke).

Utjecaj tjelovježbe na promjene neurokemijskog fenotipa srčanih neurona tijekom vremena

Utjecaj tjelovježbe na imunohistokemijske karakteristike svih neurona unutar nodoznog ganglijaNeurokemijski profil svih neurona nodoznog ganglija u životinja podvrgnutih tjelovježbi i kontrolnih životinja. Svi podaci su prikazani kao proporcije s postotkom u zagradama.

neuroni nodoznog ganglija

kontrolnih životinja

(N=1767)

neuroni nodoznog ganglija

životinja podvrgnutih

tjelovježbi (N=1513)

IB4+* 1280/1767 (72) 1176/1513 (78)

N52+254/785 (32) 202/713 (28)

CALR+77/982 (8) 69/800 (9)

* p=0.007, Hi-kvadrat test

zaključci

1.Neuroni koji se projiciraju u različite dijelove srca imaju različite imunohistokemijske karakteristike temeljene na njihovoj imunoreaktivnosti na IB4, N52 i CALR.

2.Neuroni nodoznog ganglija koji šalju svoje projekcije u srce imaju drugačije osobine i to ne samo kada ih se uspoređuje međusobno (ovisno u koji dio srca se projiciraju) nego i kada ih se uspoređuje s ostalim neuronima u nodoznom gangliju ili s neuronima u spinalnim ganglijima koji se projiciraju u srce.

3. Rezultate pojedinih imunohistokemijskih bojenja neurona u štakora važno je promatrati u odnosu na dob životinja.

4. Intenzivna tjelovježba u štakora ne dovodi do promjena u imunoreaktivnosti na IB4, N52 i CALR unutar neurona nodoznog ganglija koji se projiciraju u lijevu klijetku.

5. Morfološka obilježja neurona koji se projiciraju u lijevu klijetku kao i imunohistokemijska obilježja ostalih neurona unutar nodoznog ganglija mijenjaju se kao odgovor na tjelovježbu.

6. Utvrđivanje postojanja različitih podskupina neurona koji su odgovorni za inervaciju točno određenog dijela srca važno je jer takve podskupine predstavljaju vrlo preciznu metu za daljnja istraživanja i potencijalni cilj na koji se može djelovati terapijski.

7. Tjelovježbom uvjetovane morfološke i imunohistokemijske promjene neurona unutar nodoznog ganglija upućuju na mogućnost da je upravo nodozni ganglij inicijator vagalnih promjena koje nastaju kao posljedica dugotrajne tjelovježbe.