MERSİN–2012

i

T.C.

MERSİN ÜNİVERSİTESİ

TIP FAKÜLTESİ

GENEL CERRAHİ ANABİLİM DALI

İNCE BAĞIRSAKTA İSKEMİ VE REPERFÜZYON

UYGULANAN DENEKLERDE RHO-KİNAZ İNHİBİTÖRÜ

Y-27632 UYGULAMASININ KAN VE DOKU LİPİD

PEROKSİDASYONU, ROCK EKSPRESYONU VE İLEAL

PATOLOJİ ÜZERİNE ETKİSİ

Dr. Serkan BAİKOĞLU

UZMANLIK TEZİ

DANIŞMAN

Prof. Dr. Mustafa Musa DİRLİK

MERSİN–2012

ii

T.C.

MERSİN ÜNİVERSİTESİ

TIP FAKÜLTESİ

GENEL CERRAHİ ANABİLİM DALI

İNCE BAĞIRSAKTA İSKEMİ VE REPERFÜZYON

UYGULANAN DENEKLERDE RHO-KİNAZ İNHİBİTÖRÜ

Y-27632 UYGULAMASININ KAN VE DOKU LİPİD

PEROKSİDASYONU, ROCK EKSPRESYONU VE İLEAL

PATOLOJİ ÜZERİNE ETKİSİ

Dr. Serkan BAİKOĞLU

UZMANLIK TEZİ

DANIŞMAN

Prof. Dr. Mustafa Musa DİRLİK

Bu tez, BAP-TF CTB (SB) 2012-2 TU kodlu proje olarak Mersin

Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir

iiiiiiiii

TEŞEKKÜR

Mersin Üniversitesi Rektörü hocam sayın Prof. Dr. Süha AYDIN başta

olmak üzere, tezimin planlanması ve sürdürülmesinde tecrübelerinden ve

bilgilerinden faydalandığım değerli hocam tez danışmanım Mersin Üniversitesi

Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Musa DiRLiK’e,

cerrahi eğitimim sürecinde her konuda yardım aldığım ve bana bu mesleği

öğreten Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalının

değerli öğretim üyeleri sayın Prof. Dr. Tahsin ÇOLAK’a, Prof. Dr. Ahmet Koray

ÖCAL’a, Doç. Dr. Tamer AKÇA’ya, Doç. Dr. Hakan CANBAZ’a, Yrd. Doç. Dr.

Özgür TÜRKMENOĞLU’na, Yrd. Doç. Dr. Ahmet DAĞ’a, Farmakoloji Anabilim

Dalı Başkanı sayın Prof. Dr. Kansu BÜYÜKAFŞAR’a, Biyoistatistik Anabilim

Dalı öğretim üyesi sayın Prof. Dr. Bahar TAŞDELEN’e Tıbbi Biyokimya

Anabilim Dalı Öğretim üyesi sayın Prof. Dr. Lülüfer Tamer GÜMÜŞ’e, Patoloji

Anabilim Dalı öğretim üyesi sayın Yard.Doç. Dr. TUBA KARA‘ya birlikte

çalıştığım, yardımlarını esirgemeyen tüm araştırma görevlisi arkadaşlarıma ve

kliniğimizin tüm hemşire ve personeline teşekkürü borç bilirim.

Ayrıca desteğiyle her zaman yanımda olan sevgili eşim Selin ve kızım

Rima,ya eğitimim için hiçbir fedakarlıktan kaçınmayan aileme sevgi ve

saygılarımı sunarım.

Dr. Serkan BAİKOĞLU

MERSİN-2012

iviv

İÇİNDEKİLER

ÖZET

Sayfa No

5

İNGİLİZCE ÖZET 6

I.GİRİŞ VE AMAÇ 7

II.GENEL BİLGİLER 9

III. GEREÇ ve YÖNTEMLER 28

IV. BULGULAR 36

V. TARTIŞMA 45

VI. SONUÇ VE ÖNERİLER 49

VII. KAYNAKLAR 50

VIII. SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ 59

IX. ŞEKİLLER VE RESİMLER DİZİNİ 60

X. TABLOLAR DİZİNİ 61

5

ÖZET

İskemi reperfüzyona maruz kalan bütün dokularda olduğu gibi ileumda

süre bağımlı olarak hasar oluşmaktadır. Çalışmada rho kinaz inhibitörü Y-27632

nin ileal dokuda iskemi reperfüzyon hasarı üzerine etkilerini araştırdık.

Bu çalışma Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalı

tarafından Nisan 2012- Ekim 2012 tarihleri arasında yapıldı.

Çalışma 3 kontrol olmak üzere 6 gruptan (7 şer rat) oluşturuldu. Kontrol

gruplarında laparatomi yapılarak Superior Mezanterik Arter (SMA) bulunup

prepare edildikten sonra klemplenmeden batın kapatıldı. Kontrol grubu ratlar 3

gruba ayrıldı. Birinci gruba hiçbir ilaç verilmedi, ikinci gruba 1 mg/Kg Y-27632

intra peritoneal olarak ve üçüncü gruba 5mg/Kg Y-27632 intra peritoneal olarak

verildi. Çalışma gruplarında SMA bulunup 30 dakika klemplenerek iskemi

oluşturuldu. 30 dakika sonunda klempler açılarak 90 dakika reperfüzyon yapıldı.

İskemi ve reperfüzyon yapılan ratlar 3 gruba ayrıldı. Birinci gruba laparatomiden

60 dakika önce serum fizyolojik intra peritoneal olarak verildi, ikinci gruba

laparatomiden 60 dakika önce 1 mg/Kg Y-27632 intra peritoneal olarak ve

üçüncü gruba 5 mg/Kg Y-27632 intra peritoneal olarak verildi. 3 saat sonunda

kontrol ve çalışma gruplarındaki tüm ratlar sakrifiye edildi. Kanda MDA, MPO,

nitrit-nitrat seviyeleri, dokuda (ileum) MDA, MPO, nitrit-nitrat, ROCK aktivitesi ve

mRNA ekspresyonu ölçüldü. Ayrıca ileal doku hasarı Hematoksilen-eozin ile

boyanarak ışık mikroskobunda Chiu yöntemi ile değerlendirildi.

İskemi reperfüzyon ileal dokuda hasara sebep oldu. İskemi reperfüzyon

oluşturulan deneklerde ROCK aktivitesi arttı. Y-27632 uygulanan deneklerde

doz bağımlı olarak ROCK aktivitesinde anlamlı düşüş saptandı. 5 mg/kg Y-

27632 uygulanan deneklerde iskemi reperfüzyon hasarını histopatolojik

incelemede engellediği görüldü. İskemi reperfüzyon hasarı oluşturulan denekler

ile tedavi uygulanan deneklerde MPO ve MDA değerleri açısından fark

saptanmadı. Nitrit-nitrat düzyi iskemi reperfüzyon yapılan deneklerde

yükskelirken Y-27632 verilip iskemi reperfüzyona maruz kalan deneklerde

düşüş saptandı.

Rho kinaz inhibitörü Y-27632 nin uygulaması ileal dokuda doz bağımlı

olarak iskemi reperfüzyon hasarını azaltığını düşünmekteyiz.

Anahtar kelimeler: İntestinal iskemi reperfüzyon hasarı, lipid

peroksidayonu, Rho-kinaz, Y-27632

6

ABSTRACT

The damage occurs in the ileum like in the other tissues exposed to

ischemia reperfusion depending on the time. In this study we searched the effects

of kinase inhibitor Y-27632 in preventing ileal tissue ischemia reperfusion damage.

This study has been performed in Mersin University Medicine Faculty,

Department of General Surgery between April 2012 and October 2012.

The study was consisted of 6 groups (7 rats), of which 3 were control

groups. After laparotomy, Superior Mesenteric Artery (SMA) was prepared without

being clamped in control groups. Rats in the control group were divided into 3

groups. Serum physiologic was given in the first group. 1 mg/Kg Y-27632 was

given intraperitoneally (IP) in the second group and 5mg/Kg Y-27632 in the third

group. In the study groups, we found SMA and clamped it for 30 minutes and

created ischemia. After 30 minutes we made reperfusion for 90 minutes. The rats

exposed to ischemia and reperfusion were divided into 3 groups. 60 minutes

before the laparatomy, IP serum physiologic was injected in the first group. 60

minutes before the laparatomy, IP 1 mg/Kg Y-27632 was given in the second

group and IP 5 mg/Kg Y-27632 was given in the third group. After 3 hours the rats

in the control and study groups were sacrificed. We evaluate the MDA, MPO and

nitrite-nitrate levels in the blood and the MDA, MPO, nitrite-nitrate, ROCK activity

and mRNA expression in the tissue. Also the ileal tissue damage was stained with

hematoxylon-eosin in the light microscope and evaluated by the Chiu method.

Ischemia reperfusion (IR) caused tissue damage in the ileal tissue. The

ROCK activity increased in the subjects in which IR was created. A significant

decrease was detected in the ROCK activity depending on the dose in the subjects

exposed to Y-27632. It is revealed in histopathological evaluation that reperfusion

damage was prevented in the subjects exposed to 5 mg/kg Y-27632. There was

no difference in the MPO and MDA values in the subjects with IR. While the nitrite-

nitrate levels were increased in the subjects exposed to IR, they decreased in the

subjects which were given Y-27632 and exposed to IR. We consider that Rho

kinase inhibitor decreases the IR damage in the ileal tissue with the exposition of

Y-27632 depending on the dose.

Key Words: Intestinal ischemia reperfusion injury, lipid peroxidation, Rho-

kinase, Y-27632

7

GİRİŞ VE AMAÇ

İnce bağırsaklarda oluşan iskemi ve reperfüzyon (İ/R) hasarı yüksek

morbidite ve mortaliteye sebep olan önemli bir problemdir. Abdominal aort

anevrizması, kardiyopulmoner bypass, boğulmuş fıtık cerrahisi, ince bağırsak

transplantasyonu ve neonetal enterokoliti gibi durumlarda bağırsaklara gelen

kan akımının devamlılığının kesintiye uğraması sonucu oluşur 1-3 . Ayrıca,

septik ve hipovolemik şok sırasında da gelişir. Metabolik olarak aktif dokulara

kan akımının kesintiye uğraması iskemik hasara sebep olur ve bu iskemik

dokulara kan akımının yeniden sağlanması öncekinden daha şiddetli olan

reperfüzyon hasarına sebep olan bir takım olaylar zincirini başlatır. Bu olaylar

zinciri olarak serbest oksijen radikallerinin oluşması, demir depolarının

salınması, mikrosürkülasyonun bozulması, enflamatuar sitokinlerin salınması,

kompleman aktivasyonu ve neutrofil infiltrasyonu sayılabilir 4,5. Rho/Rho-kinaz

yolağı, hücre içi kalsiyum düzeylerinin düşmesine rağmen düz kaslarda (damar

Çeperi) kasılmanın sürdürülmesini sağlayan bir Ca2+ duyarlılığı

mekanizmalarından (Ca2+-sensitization) biri ve belki de en önemlisidir6. Rho ile

indüklenen sinyal, trombin gibi bir takım uyarılara cevap olarak gelişen endotel

hücre şekil değişikliği, endotelyal kontraktilite ve kapiller permeabilite artışı gibi

olaylara önemli katkı sağlar. Ayrıca nötrofiller tarafından başlatılan endotelyal

hiperpermeabiliteden de Rho/Rho-kinaz yolağı sorumludur7. Bu yeni sinyal ileti

mekanizması ayrıca trombosit, nötrofil, lenfositlerin kemotaksisine ve hücre

membranı şekil değişikliklerine ve ayrıca mast hücrelerin salgılama

fonksiyonuna önemli katkı sağlamaktadır6. İnflamatuar hücrelerin migrasyonu

hücre iskeleti aktini tarafından düzenlenmektedir ve bu olayı düzenleyen en

önemli mekanizmalardan birisi Rho-ile indüklenen sinyal ileti mekanizmasıdır.

Rho-kinaz (ROCK, ROK): Rho-kinaz bir serin-treonin protein kinazdır. Şu an için

en az 2 izoformu tanımlanmıştır. Bunlar aynı zamanda ROCK-1 olarak da

bilinen ROKβ ile ROKα olarak da bilinen ROCK-2 dir8. Rho/Rho-kinaz yolağı,

ayrıca inflamasyon olaylarına da aracılık edebilmektedir. İnflamatuar hücrelerin

migrasyonu hücre iskeleti aktini tarafından düzenlenmektedir ve bu olayı

düzenleyen en önemli mekanizmalardan birisi Rho-ile indüklenen sinyal ileti

mekanizmasıdır8. İskemi/reperfüzyon hasarlanmasında Rho/Rho-kinaz yolağı

belirgin rol oynamaktadır zira ROCK inhibitörleri, kardiyak9,10, renal11, hepatik12,

8

serebral13 ve nöronal14 iskemi/reperfüzyon hasarlanmalarını önlemede oldukça

etkili bulunmuşlardır.

Rho/Rho-kinaz sinyal mekanizması fizyolojik ve patofizyolojik olaylarda

rol oynamaktadır. Gastrointestinal Sistemde kobay ileumunda Rho-kinaz,

agonistle indüklenen artmış myozin fosforilasyon düzeylerine düz kas

kasılmasına aracılık eder (6). Bir çalışmada gastrik fundus düz kasında Rho-

kinaz enziminin gerek agonist, gerek nöronal ve gerekse depolarizasyonla (KCl

ile) oluşturulan kasılmalarına iştirak ettiğini, ayrıca kolinerjik sinirlerden

nörotransmiter, asetilkolin salıverilmesine karıştığını gösterildi15

. Ayrıca bu

sinyal ileti mekanizması, koyun ve insan safra kesesi kontraktilitelerine de

aracılık etmektedir16,17

Ayrıca ROCK, monosit kemoatraktant protein-118 plazminojen aktivatör

inhibitör-1 (PAI-1)12 ve osteopontin19 gibi vasküler fonksiyonla ilişkili inflamatuar

moleküllerin gen ekspresyonlarında ilgili tutulmaktadır. Ayrıca, anjiotensin-II ve

interlökin-1 ile kültür hücrelerinde oluşturulan inflamasyon20 ve bakteriyel

endotoksinle (lipopolisakkaridlerle) in vivo olarak oluşturulan sistemik

inflamatuar yanıtta Rho kinaz upregüle olmaktadır21.

Bu çalışmada bir ROCK inhibitörü olan Y-27632 nin intestinal iskemi ve

reperfüzyon uygulanan deneklerde kan ve doku lipid peroksidasyonu, ROCK

ekspresyonu ve ileal patoloji (nekroz ve apoptozis) üzerine etkilerini araştırmayı

amaçladık.

9

GENEL BİLGİLER

Anatomi

Gastrointestinal sistem abdominal aortanın üç viseral dalı tarafından

beslenmektedir. Çölyak trunkus embriyoda foreguttan oluşan organları besler.

Bunlar mide, karaciğer, dalak, safra kesesi, pankreas ve duodenum ikinci

parçasına kadar bağırsaklardır. Kısa ve kalın bir damardır. Hiatus

aortikusun hemen aşağısında abdominal aortanın ön yüzünden T12 vertebra

düzeyinden çıkar. Kısa bir seyirden sonra üç dala ayrılır.

-A. gastrika sinistra

-A. hepatika komunis

-A. gastroduodenalis

-A. hepatika propria

-A. gastrika dekstra

-A. lienalistir22.

Ana hepatik arter karaciğere doğru gider. Gastroduodenal arteri

verdikten sonra sağ ve sol (bazende orta) hepatik arterlere ayrılır.

Gastroduodenal arter pankreas boynu ve duodenum arasında ilerler. Daha

sonra ilk ana dalı olan pankreatikoduodenalis süperiyor posteriyor dalını

vererek terminal dalları olan pankreatikoduodenalis süperiyor anteriyor ve sağ

gastroepiploik arteri verir. Bunlar SMA’nın dalı olan pankreatikoduodenalis

inferiyor ile yoğun anastomotik bağlantılar yapar23.

10

Şekil 1. Çölyak trunkus ve dalları

Süperiyor mezenterik arter embriyoda kökenini midguttan alan

organları besler. İnce bağırsakların tamamı ile transvers kolonun 1/3 distal

bölümüne kadar olan kolon kısmının kanlanmasını sağlar. Trunkus çölyakusun

yaklaşık 1 cm aşağısından ve aortanın ön yüzünden L1-2 düzeyinden çıkar. A.

pankreatikoduodenalis inferiyor SMA’nın ilk dalıdır. Daha sonra

-A. jejunalis ve A. İlealis

-A. İleokolika

-A. çekalis anterior

-A. çekalis posterior

-A. Apendikular

-R. İleali s

-R. Kolikus

-A. kolika dekstra

-A. kolika media dallarını vermektedir.

11

Şekil 2. Superior mezenter arter

İnferiyor mezenterik arter (İMA) kökenini hindguttan alan organlar olan

transvers kolonun 1/3 distalinden inen kolonun sonuna kadar olan kolon

kesmi, sigmoid kolon ve rektumun ampulla rektiye kadar olan kısmı bu arter

tarafından beslenir. İMA diğerlerine göre küçük çaplıdır ve aortanın sol

anterolateralinden L3-4 düzeyinden çıkar. İMA’nın dalları

-A. kolika sinistra

-A. Sigmoidalis

-A. rektalis süperiyordan oluşmaktadır (24).

12

Şekil 3. İnferior mezenterik arter

Mezenterik arterler ile nonmezenterik sistemik arterler arasında ve

mezenterik arterlerin kendi aralarında oldukça fazla miktarda kollateral akım

vardır. Bu sayede iki veya üç ana arterde tıkanıklık olsa bile, yeterli visseral

perfüzyon sağlanır25. Tıkanıklığın distalinde oluşan arteryel hipotansiyona

yanıt olarak mevcut kollateral damarlar açılır. Distaldeki basınç sistemik

basınçtan düşük olduğu sürece bu kollaterallerdeki akım artarak devam eder26.

13

Şekil 4. SMA ve İMA arasındaki kollateraller

İnce bağırsakların kanlanmasını sağlayan 3 temel arter ve bu arterler

arasında önemli anastomozlar vardır27 (Şekil4).

Temel mezenterik arteriyel kollateral yollar ;

-İnter çöliyak damarlar,

- Gastrik ark (sol ve sağ gastrik arterler),

- Gastroepiploik ark (sol ve sağ gastroepiploik arterler),

- Barkow arkı (sol ve sağ epiploik arterler),

-Çöliyak ve süperiyor mezenterik arterler arasında,

- Pankreatik ark (gastroduodenal ve inferiyor pankreatikoduodenal

arter),

- Buehler arkı (direk embriyolojik bir yoldur.)

-Süperiyor ve inferiyor mezenterik arterler arasında,

14

arasında)

- Drummondun marjinal arteri (sağ, orta ve sol kolik arterler

- Riolan arkı (orta ve sol kolik arterler arasında santral

anastomozdur).

- İnferiyor mezenterik ve iliak arterler arasında

- Rektal=hemoroidal ark (süperiyor, orta ve inferiyor rektal

arterler arasında izlenmektedir).

- İMA ile abdominal aortanın lomber dalları, sakral arter ve internal

iliyak arter arasında anastomotik bağlantılar mevcuttur.

Süperiyor ve inferiyor mezenterik venler (İMV) aynı isimdeki

arterlerine parelel seyrederek bağırsakları drene etmektedirler. İMV ile

splenik ven birleştikten sonra SMV ile de birleşerek portal veni

oluşturmaktadırlar28.

İskemi Reperfüzyon

Arterlerde herhangi bir nedene ağlı olarak ortaya çıkan tıkanma sonucu,

dokuya giden kan akımının bozulması iskemi olarak tanımlanmaktadır. Bir

dokuya giden kan akımı kesildiğinde, o dokudaki hücrelerin işlevlerinin

bozulması ile başlayan ve hücre ölümüne kadar ilerleyen bir dizi kimyasal olay

gerçekleşmektedir. Hücresel işlevlerin gerçekleşebilmesi için gerekli temel

molekül oksijendir. Normal hücre işlevleri için gerekli olan yüksek enerjili fosfat

bağları aerobik metabolizma ile sağlanmaktadır. Oksijen yetersizliği durumunda

ise anaerobik metabolizma devreye girmektedir; bu olay da laktik asit ve

toksik metabolitlerin birikimi ile sonuçlanmaktadır. Ayrıca, ortaya çıkan

asidoz nedeni ile normal enzim kinetiği değişmekte ve yüksek enerjili fosfat

bağlarının yapımı azalmaktadır; bu durumda ise hücre kendi homeostazı

için gerekli olan enerjiden yoksun kalmaktadır29,30

.

Reperfüzyon, iskemiye neden olan etkenin ortadan kaldırılarak dokuya

kan akımının yeniden düzenlenmesidir. Reperfüzyonun, iskemik dokuda enerji

gereksiniminin sağlanması ve toksik metabolitlerin uzaklaştırılması gibi iki

olumlu etkisi vardır. Böylece, reperfüzyon iskemik hasarın düzeltilebilmesi için

gerekli bir süreçtir. Ancak, oksijenlenmiş kanın iskemik dokuya dönüşü, o

dokuda daha fazla hasara yol açan bir reaksiyon sürecini başlatmaktadır31-34.

İskeminin ardından gelişen reperfüzyon hasarı özellikle kardiyovasküler

cerrahide sıklıkla karşılaşılan bir sorundur. İskemi/reperfüzyon (İ/R) hasarı,

15

travma, beyin ya da miyokart enfarktüsü gibi beklenmeyen durumlarda ya da

organ transplantasyonu gibi nedenler ile arteriyel sisteme klemp uygulanması

gibi cerrahi işlem sırasında gözlenmektedir. İ/R hasarı yalnızca doğrudan

etkilenen organ ile sınırlı kalmayıp, uzak organlarda da hasar oluşumuna

neden olmaktadır. Uzak organ hasarı, İ/R'nin ilk ortaya çıktığı organ dışındaki

dokularda özellikle böbrek ve akciğerde, gelişen önemli bir hasardır. Yapılan

çalışmalarda, hastalarda yerel hasar ve sistemik inflamatuvar yanıt ile birlikte

iskelet kası, bağırsak, karaciğer ve aortik oklüzyon reperfüzyonu durumlarında

gelişen böbrek, akciğer veya karaciğer işlev bozukluğu ya da çoklu organ

yetersizliğinin ölüme neden olduğu da bildirilmiştir. İ/R hasarının klinik

yansımaları yerel, uzak ve sistemik düzeyde etkiler olmak üzere üç grupta

incelenmektedir. Yerel düzeydeki etkiler hemen hemen tüm organlarda ortak

bir etiyolojiden kaynaklanmaktadır; ortaya çıkan hücresel değişiklikler ise

organa özgüdür. Genellikle sızıntılı kapiller yatakların yol açtığı sıvı

ekstravazasyonu ve doku ödemi ile belirgin olan sistemik düzeydeki etkiler ve

uzak organlarda işlev bozukluğu ise tam olarak açıklanamamış olup, genellikle

"çoklu organ işlev bozukluğu sendromu" olarak da adlandırılan bir durum ile

sonuçlanabilen son derece karışık süreçlerin bir sonucu olarak ortaya

çıkmaktadır. Klinik olarak çoklu organ işlev bozukluğu sendromu renal

yetersizlik ve iveğen (akut) respiratuvar yetersizlik ile kendisini

göstermektedir35-49

.

İskemi Reperfüzyon Fizyopatoloji:

Günlük uygulama içerisinde tıbbın pek çok dalında İR'nin rol oynadığı

olgular bulunmaktadır. Şok, yanık, sepsis, pankreatit gibi olgularda ortaya

çıkan hipovolemi ile iskemi ve bu durumların resüsite edilmesi ile de

reperfüzyon hasarı ortaya çıkmaktadır. Serebrovasküler olaylarda, miyokart

infarktüsünde, mezenteriyovasküler olaylarda uygulanan trombolitik tedavi

veya revaskülarizasyon ameliyatları da yine reperfüzyon hasarına neden

olmaktadır. Travmalarda ve travma cerrahilerinde hipovolemi ya da kanama

kontrolü nedeni ile yapılan klemp ve tampon uygulamaları iskemiye neden

olurken, resüsitasyon sonrası mutlak bir reperfüzyon ile yine İR hasarı ortaya

çıkmaktadır. Kardiovasküler cerrahide aort ya da periferik arter klemp

uygulaması sonrası ortaya çıkan tablo İR hasarı ile belirgindir.

16

Transplantasyon cerrahisinde kaçınılmaz olarak transplante edilecek organın

iskemi ve reperfüzyonu söz konusu olup, oluşan hasar yama (graft) işlevlerini

etkilemektedir. Sonuç olarak, bütün cerrahi işlemler sırasında dokuların

iskemisi ve sıklıkla bunu izleyen bir repefüzyon periyodu bulunmaktadır35-49.

İ/R'ye maruz kalan postkapiler venüllerde gözlenen inflamatuvar

yanıtları açıklayan endotele bağımlı mekanizmalar Şekil 5'te özetlenmiştir.

eNOS aracılığı ile nitrik oksit (NO), ksantin oksidaz tarafından da süperoksit ve

hidrojen peroksit oluşumunun artması İR ile sonuçlanmaktadır. Oluşumu

artmış olan bu oksidan moleküller bir yandan NF-κB gibi özgül nükleer

faktörlerin transkripsiyonuna neden olurlarken, diğer yandan kompleman

sisteminin bileşenlerinden C5'in etkinleşmesine ve fosfolipaz A2 enzimi

aracılığı ile lökotrien B4 (LTB4) ve trombosit etkinleştirici faktör (TEF)

oluşumunda artmaya neden olmakta ve endotel hücrelerinde P-selektin

ekspresyonundaki artışa aracılık etmektedirler. LTB4, TEF ve C5a ise

lökositlerin membranında bulunan reseptörleri aracılığı ile β2-integrinlerin

(CD11/CD18) salıverilmesine ve böylece endotel hücrelerinin yüzeyinde

bulunan E-selektin ve intraselüler adezyon molekülü-1 (ICAM-1) gibi adezyon

molekülleri aracılığı ile lökositlerin adezyonuna neden olurlar. İR'ye yanıt

olarak gelişen inflamatuvar yanıtlar mast hücreleri ve makrofajlardan

salıverilen h i s t a m i n , TNF-α, hidrojen p e r o k s i t , süperoksit r a d i k a l i v e

N O g i b i moleküller ile daha da artırılmaktadır 35, 38, 40, 47.

17

Şekil 5. İR'ye maruz kalan postkapiler venüllerde gözlenen inflamatuvar yanıtları açıklayan endotele bağımlı mekanizmalar. CD, cluster of differentiation; eNOS, endoteliyal nitrik oksit sentaz; H2O2, hidrojen

peroksit; ICAM, intraselüler adezyon molekülü; İ/R (I/R), iskemi/reperfüzyon; LT, lökotrien; NF-κB, nükleer faktör-κB; NO, nitrik oksit;

O2-, süperoksit; PAF, trombosit etkinleştirici faktör; TNF, tümör nekroze

edici faktör; VCAM, vasküler hücre adezyon molekülü.

İR hasarında hipoksinin ilk etkisi hücrenin aerobik solunum, yani

mitokondrilerdeki oksidatif fosforilasyon üzerinedir (Şekil 6). Oksijen

basıncının azalması sonucunda hücre içi adenozin trifosfat (ATP) oluşumu

belirgin olarak azalmaktadır. ATP oluşumunun azalması ise hücre içindeki

birçok sistemi etkilemektedir. İR hasarında hücre içindeki serbest kalsiyum

düzeylerinin artmasına karşın, hücre membranındaki Na+/K+-ATPaz

pompasının etkinliğinin azalmasına bağlı olarak hücre içinde sodyum

birikmekte, potasyum ise hücre dışına çıkmaktadır. Hücre içinde sodyum

düzeylerinin artması ise, suyun izoozmotik artışı ile birlikte olup, hücrenin

şişmesine neden olmaktadır. Hücresel şişme inorganik fosfatlar, laktik asit

ve pürin nükleozitleri gibi metabolitlerin birikmesi ile artan ozmotik yük ile

daha da artmaktadır. Hücresel ATP düzeyindeki azalma ile birlikte, siklik

18

adenozin 5′- monofosfat (siklik AMP) oluşumundaki artma da

fosfofruktokinaz enzimini uyararak glikojenden ATP üretimi ile hücrenin

enerjisini sağlamak amacı ile gelişen anaerobik glikoliz hızında artmaya ve

glikojenin hızla tükenmesine neden olmaktadır. Artan glikoliz ise fosfat

esterlerinin hidrolizi ile laktik asit ve inorganik fosfatların birikimine neden

olarak hücre içi pH değerinin düşmesine yol açmaktadır. Bütün bu olayları

ribozomların granüllü endoplazmik retikulumdan ayrılması ve polizomlardan

monozomların oluşumu ile protein sentezinde azalma izlemektedir. Bu

aşamadan sonra isteminin sürmesi durumunda dönüşümsüz hasar

gelişmektedir. Morfolojik olarak geri dönüşümsüz hasara mitokondrilerin

vakuolizasyonu ve mitokondri matriksinde şekilsiz, kalsiyumdan zengin

yoğunlukların birikimi eşlik etmektedir. İskemi sırasında ATP sentezi

durmakta, ancak tüketimi sürmektedir. ATP önce AMP’ ye, sonra da

adenozine kadar parçalanmaktadır. Adenozin hızla hücre dışı ortama

çıkarak burada inozin üzerinden hipoksantine çevrilmektedir. Normoksik

durumlarda hipoksantin ksantin dehidrojenaz enzimi aracılığı ile ürik aside

metabolize olmaktadır. Öte yandan, hipoksik durumlarda hipoksantin ürik

aside metabolize olmadan iskemik dokuda birikmekte, ksantin dehidrojenaz

enzimi ise ksantin oksidaza çevrilmektedir. Reperfüzyon ile moleküler

oksijenin dokuya gelmesi ile hipoksantin, ksantin oksidaz enzimi ile ürik

aside çevrilmesi sırasında serbest oksijen radikali oluşmaktadır. Serbest

oksijen radikali SOD enziminin etkisi ile hidrojen peroksit ve oksijene

dönüştürülürken, hidrojen peroksit ise katalaz enziminin etkisi ile su ve

oksijene çevrilmektedir. Serbest oksijen radikalleri hem dokuya doğrudan

zarar vermekte, hem de polimorfonükleer lökositler (PMNL)'lerin hasarlı

dokuda birikmesine neden olmaktadır. Dokuya gelen PMNL'ler

miyeloperoksidaz, elastaz, proteaz, kolajenaz, laktoferrin ve katyonik

proteinler gibi enzimler ile moleküller açığa çıkmaktadır. Bu enzimler ise

hem dokudaki hasarı artırmakta, hem de daha fazla radikal oluşmasına

neden olmaktadırlar. Serbest oksijen radikalleri proteinler, polisakkaritler,

nükleik asitler ve doymamış yağ asitleri gibi tüm biyolojik maddeler ile

reaksiyona girebilmektedir. Oksijen radikalinin en belirgin özelliği hücre

membranındaki doymamış yağ asitlerinden metilen hidrojen atomunu

ayırmasıdır. Bu reaksiyon hücre membranında lipit peroksidasyonunu

19

başlatması sonucunda lipit hidroperoksit radikalleri ve lipit hidroperoksitler

gibi lipit türevi radikaller oluşmaktadır. Lipit peroksidasyonunun son ürünleri

malondialdehit ve öteki aldehitler ile hidrokarbon gazlar ve konjüge

dienlerdir35-49.

Şekil 6. Hipoksi sırasında hücre içinde ATP derişiminin azalması ile ilgili olarak hücre metabolizması, iyonik denge ve yapısal proteinlerde ortaya çıkan değişiklikler. ADP, adenozin difosfat; Apaf-1, apoptotik proteaz etkinleştirici faktör-1; ATP, adenozin trifosfat; Can-L, L-türü kalsium kanalı; NADPH2, nikotinamit adenin dinükleotit fosfat; OP, oksidatif fosforilasyon zinciri; Pi, inorganik fosfat; PTP, mitochondrial permeability transition pore; [i], hücre içi iyon derişimi; ψm, sarkoplazmik membran potansiyeli; ψmito, mitokondriyal membran potansiyeli.

İntestinal İskemi

İnce bağırsakta oluşan iskemi ve reperfüzyon hasarı yüksek morbidite ve

mortaliteye sebep olan önemli bir problemdir. Abdominal aort anevrizması,

kardiyopulmoner bypass, boğulmuş fıtık cerrahisi, ince bağırsak

transplantasyonu ve neonetal enterokoliti gibi durumlarda bağırsaklara gelen

kan akımının devamlılığının kesintiye uğraması sonucu oluşur1-3. Ayrıca, septik

ve hipovolemik şok sırasında da gelişir.

İskeminin süresi ve yoğunluğuna bağlı olarak, oksijenin dokulara tekrar

ulaşmasıyla birlikte doku hasarı daha da fazla artabilmektedir (oksijen

20

paradoksu)50. Deneysel mezenter İR modelinde, reperfüzyon sırasında oluşan

doku lezyonlarının iskemi sırasında oluşanlara göre daha büyük olduğu

gösterilmiştir51. İR, endotel ve değişik hücre tipleri arasında kompleks

etkileşimlere sebep olarak mikrovasküler hasar, hücresel nekroz ve/veya

apopitoz oluşmasına öncülük edebilir52. Splanknik arterlerin oklüzyon ve

reperfüzyonu, çoğunlukla vasküler permeabilitedeki artış sonucunda meydana

gelen sirkülatuvar şoku hızlandırarak polimorfonükleer nötrofillerin adezyonuna,

proinflamatuvar maddelerin salıverilmesine ve hem azota- hem de oksijene-

bağımlı serbest radikallerin oluşmasına neden olur53. Splanknik İR sonucunda

oluşan hasar çoğunlukla mukoza ve submukozada görülen ve endoteliyal

yıkıma neden olan yoğun inflamasyon ile karakterizedir54.

İntestinal İR sonucunda kontraktil aktivitede azalma, mikrovasküler

permeabilitede artma ve mukozal bariyer disfonksiyonu görülmektedir55.

İskemik dokunun reperfüzyonu süperoksit anyonu, hidroksil radikali, hidrojen

peroksit ve peroksinitrit gibi toksik serbest oksijen radikallerinin oluşması için en

önemli sebeptir56. Serbest oksijen radikalleri, çok miktarda fosfolipid ve protein

içeren sellüler membran ve subsellüler tabakada hasar meydana getirerek lipid

peroksidasyonuna sebep olurlar ve sonucunda yapısal ve metabolik

değişikliklere neden olarak hücre ölümü ve nekroza yol açarlar. Ayrıca İntestinal

İ/R’nin özellikle reperfüzyon sırasında artan bir akut inflamatuvar cevap

meydana getirdiği ve lokal etkisinden daha zararlı bir sistemik cevap

oluşturduğu bilinmektedir. Aktive olan nötrofiller sitotoksik serbest oksijen

radikalleri ve proteolitik enzimler ile birlikte iskemik hasarı artırırlar57.

İnce bağırsaklardaki İR, mukoza bariyeri rüptürüne neden olarak

bakteriyel translokasyon ve inflamatuvar cevabın aktivasyonu ile birlikte uzak

organlarda da gösterilen asit-baz denge bozukluğuna yol açmaktadır58.

Bakteriyel translokasyon, yaşayabilen bakterilerin intestinal mukozadan diğer

doku ve uzak organlara dolaşım yoluyla geçmesi sonucunda

gerçekleşmektedir. Reperfüzyon ile birlikte kalsiyumun intraselüler ortama

geçişi artmakta ve bu durum fosfolipaz A2 aktivitesinde anlamlı bir yükselme

meydana getirmektedir. Fosfolipaz A2 etkisi ile salıverilen araşidonik asitten

siklooksijenaz (COX) enzimi ile prostaglandin (PG)’ler, tromboksan A2 (TXA2)

ve prostasiklin (PGI2), lipoksijenaz (LOX) enzimi ile ise lökotrien (LT)’ler

oluşmaktadır59. Bu oluşan ürünler vazokonstriksiyona (TXA2, LTC4, LTD4,

21

LTE4), vazodilatasyona (PGI2, PGE1, PGE2, PGD2), vasküler permeabilitede

artışa (LTC4, LTD4, LTE4), trombosit kümelenmesine ve polimorfonükleer

lökositlerde kemotaksiye neden olmaktadır (LTB4).

Bütün bu olaylar sonucunda İR, ileumun elektriksel aktivitesini ve

kontraktil cevaplarını etkileyebilmektedir60. Literatür bilgilerine göre serbest

oksijen radikalleri, inflamatuvar mediyatörler ve ekstravaze lökositler ile birlikte

NO metabolizmasında oluşan bozukluk da İR sonrası görülen kas

disfonksiyonunda rol oynamaktadır61. İntestinal dokudaki kas ve sinir hücreleri

iskemiden ileri derecede etkilenebilmektedir. İskemiye maruz kalan intestinal

dokuda hücrelerde enerji deplesyonu görülmektedir62. Bununla birlikte

reperfüzyon sırasında oluşan serbest oksijen radikalleri de iyonik homeostazisi

bozarak hücre fonksiyonlarına zarar vermektedir63,64.

Yapılan çalışmalarda nötrofillerin İR hasarında kritik bir rolü olduğu

bildirilmektedir. Bu hipoteze dayalı çalışmalarda nötrofil deplesyonunun ve

nötrofil- endotel hücre etkileşmesi inhibisyonunun İ/R hasarını önleyebildiği

gösterilmiştir 65-67.

Nötrofiller ilk olarak damar duvarına yaklaştıktan sonra endotel boyunca

yuvarlanırlar ve sonunda da endotelin içinden göçmeden önce sıkıca

yapışırlar68. Adezyonu ve sonrasında endotelin içinden göçü takiben aktive

nötrofiller daha fazla serbest radikal, proteolitik enzimler (kollajenaz, elastaz,

katepsin G) ve peroksidaz salıverilmesini sağlayarak lokal yıkıma sebep olurlar.

Aktive nötrofillerin akciğer ve diğer organlar tarafından tutulması, çoklu organ

yetmezliği gelişmesindeki önemli bir basamaktır69.

Rho-Kinaz

Özellikleri

Rho-kinaz yaklasık 1388 amino asit dizisinden oluşmuştur. Bu dizide,

amino (N) ve karboksil (C) uçları bulunmaktadır. Rho-kinaz aynı zamanda Rho-

kinaz α/ROKα/ROCK2 veya ROKα/ROCK-II ve Rho-kinaz β/ROKβ/ROCK1

veya p160ROCK/ROCKβ olarak da adlandırılmaktadır. İnsanda ROCK1 ve

ROCK2 genleri sırası ile 18. kromozom (18q11.1) ve 2. kromozomda (2p24)

yer almaktadır. Rho-kinaz enziminin hemen hemen her dokuda varlığı

gösterilmiştir; ancak, ROCK2'nin beyin ve kalpte, ROCK1'in akciğer, karaciğer,

dalak, böbrek ve testiste daha fazla eksprese edildiği de bildirilmiştir. Rho-

kinazın N-terminalinde kinaz bölgesi, orta bölgesinde kuramsal olarak kangal

22

gibi kıvrılmış (coiled-coil) bölge ve C-terminal bölgesinde plekstrin homoloji

bölgesi bulunmaktadır. Etkinleşen Rho, Rho-kinazın kangal gibi kıvrılmış

bölgesinin C-terminal parçası ile etkileşerek kinaz bölgesini etkinleştirir. Bu olay

sonucunda etkinleşen Rho-kinaz Tablo 1 de belirtilen substratlarını fosforile

ederek çeşitli hücre içi olaylara katkıda bulunmaktadır70-91.

Tablo 1. Rho kinazın substratları

Substratlar İşlevleri Hücresel yanıtları

Miyozin fosfatazın miyozin bağlayıcı alt birimi

Miyozin fosfatazın inhibisyonu

Düz kas kasılmasında kalsiyum duyarlaşması

Miyozin hafif zinciri

Miyozinin F aktine

bağlanmasında artma

Stres lifleri oluşumu, fokal adezyon oluşumu, nörit

retraksiyonu, hücre kasılması, hücre motilitesi

CPI-17 proteinib

Miyozin fosfatazın etkisizleştirici özelliğinin

uyarılması

Düz kas kasılmasında kalsiyum duyarlaşması

Kalponin F aktine bağlanmada azalma

Düz kas kasılmasında kalsiyum duyarlaşması

ERMb ERM'nin etkinleşmesi Mikrovilüs oluşumu

Adusin F aktine bağlanmada artma

Membran ile ilgili olaylar (ruffling), hücre motilitesi

Vimentin Filamentlerin dağılımı Filamentlerin sitokinez için

ayrılması

Na+/H+ değiştiricisi Değiştirici etkinliğin uyarılması

Stres lifleri oluşumu

Zipper interacting-kinase. Miyozin fosfatazın inhibisyonu

Düz kas kasılmasında kalsiyum duyarlaşması

*CPI-17, 17-kDa protein kinase C-potentiated inhibitory protein of protein phosphatase-

1; ERM, ezrin-radiksin-moesin;

Rho Aktivitesinin Düzenlenmesi

Küçük G proteinleri diğer G proteinleri gibi guanindifosfat (GDP) ve

guanin trifosfat (GTP) ile spesifik etkileşme ve GTP‟az aktivitesi için gerekli

aminoasit dizilimine sahiptirler ve efektörleri ile etkileşime girecek

özelleşmiş bölgeleri vardır90.Küçük G proteinleri, GDP-bağlı inaktif ve

GTP-bağlı aktif olmak üzere birbirine dönüşebilen iki forma sahiptir.

Rho‟nun aktivitesi siklik olarak düzenlenir. Rho aktivitesinin GTP‟az

aktive edici protein (GAP) ve GTP‟az ayrıştırıcı inhibitör (GTPase-

23

dissociation inhibitor; GDI) olmak üzere iki negatif ve guanin nükleotid

değiştirici faktör (guanine nucleotide exchange factor; GEF) olmak üzere bir

pozitif düzenleyicisi vardır. İstirahattaki hücrelerde Rho-GDP disosiyasyon

inhibitörü (Rho-GDI), GDP-Rho‟ya bağlanır ve onu membrandan sökerek

sitozole getirir. Hücreler bazı agonistlerle stimüle edilirse Rho spesifik

GEF‟ler, GDP ayrıĢmasını ve bunu izleyerek GTP bağlanmasını

baĢlatarak Rho‟nun aktivasyonunu arttırırlar. Bundan sonra GTP-Rho C-

terminali geranil- geranillenmiş kuyruğuyla hücre membranına tutunur ve

spesifik hedefleriyle etkileşir. GAP Rho‟nun intrinsik GTPaz aktivitesini

hızlandırarak ve onu inaktif GDP-Rho‟ya dönüştürerek negatif regülatörler

gibi çalışırlar. GAP, Rho‟nun intrinsik GTPaz aktivitesini arttırarak GTP

bağlı aktif formunu inhibe eder. Bu GDP/GTP dönüĢüm reaksiyonunun

hız kısıtlayıcı basamağı GDP-bağlı form‟dan GDP‟nin ayrılmasıdır (şekil

5). Bu reaksiyon oldukça yavaştır ve GEF tarafından stimüle edilir92,93.

Rho‟nun aktivitesi G12 ve G13 proteinleri ile düzenlenir. G12 ve G13

küçük molekül ağırlıklı GTP bağlayıcı Rho proteinini aktive eder94,95.

Sfingozin1 fosfat (S1P), lizofosfatidik asid (LPA), sfingozilfosforilkolin

gibi lizofosfolipidler G proteinlerinin aktivasyonuna aracılık ederek RhoA/

Rho-associated coiled coil-forming protein serine/threonin kinase (ROCK)

yolunu aktive ederler96.

24

Agonist

Plazma membranı

Şekil 7. Rho ailesi GTPazların aktivasyonu

Fizyolojik Olaylardaki Rolü

Küçük G proteinleri moleküler kütleleri 20-40 kilodalton olan monomerik

G proteinleridir. Mayalardan insanlara kadar bütün ökaryot hücrelerde bulunan

ve 100'den çok üyesi bulunan büyük bir aileyi oluşturmaktadırlar. Rho, Ras,

Rab, Sar1/Arf ve Ran gibi küçük G proteinleri hücre içi sinyalleri

düzenlemektedirler. Rho ailesinin üyeleri arasında RhoA, RhoB, RhoC, RhoD,

RhoE, RhoG, Rac1, Rac2 ve Cdc42 bulunmaktadır. RhoA, RhoB ve RhoC

proteinlerinin efektör bölgelerinin amino asit dizilişleri aynıdır ve benzer

hücresel işlevleri bulunmaktadır. RhoA, vücutta en bol bulunan ve eksprese

edilen, ayrıca ve en çok çalışılan Rho proteini alt türüdür. RhoE'nin ise

genotoksik stres sırasında ROCKI'i inhibe ettiği ve böylece apoptozu önlediği

bildirilmiştir16-37.

Rho proteinleri, başlıca hücre iskeleti kontrolünden, stres liflerinin

yapılanmasından, fibroblastların fokal adezyonundan ve düz kas

kasılmasında kalsiyuma duyarlılığın düzenlenmesinden sorumludurlar. Ayrıca,

aktin iskeletinin yapılanmasını sağlayarak hücrenin biçimi, motilitesi, adezyonu,

göçü, kasılması ve sitokinez gibi birçok hücresel işlevde önemli rol

25

oynamaktadırlar. Sitoplazmik serbest kalsiyum düzeyindeki artış düz kaslarda

kasılmayı tetikleyen temel mekanizmadır. Bunun ile birlikte, düz kaslarda

agonist ile indüklenen kontraksiyon, büyük oranda membran potansiyelinden

bağımsız mekanizmalar ile düzenlenmektedir. Serotonin ve fenilefrin gibi

agonistler, fosfotidil inozitol yolunu etkinleştirerek sarkoplazmik retikulumdan

kalsiyum salıverilmesinde artışa neden olmaktadırlar. Hücre içi kalsiyum

düzeyindeki artış kalsiyumun kalmoduline bağlanmasını artırmakta, oluşan

kalsiyum/kalmodulin kompleksi ise, miyozin hafif zincir (MHZ)'yi fosforile etmek

için, MHZ kinaz (MHZK)'nin etkinleşmesine neden olmaktadır. Düz kaslarda

kasılmanın büyüklüğünü belirleyen etkenin, MHZ'nin fosforilasyonunun

derecesi olduğu düşünülmektedir. MHZ fosforilasyonu düz kaslarda kasılmaya

neden olurken, hücre içi kalsiyum düzeyindeki azalmanın ardından gerçekleşen

MHZ defosforilasyonu sonucunda gevşeme ortaya çıkmaktadır. Rho-kinaz yolu,

miyozin II'nin MHZ'nin fosforilasyon düzeyini başlıca miyozin fosfatazı inhibe

ederek düzenlemekte, ayrıca düz kas kasılmasında agonist ile uyarılan

kalsiyum duyarlığına katkıda bulunmaktadır. Öte yandan, hücre içi kalsiyum

derişiminin MHZ'nin fosforilasyonu ve düz kas kasılması ile her zaman paralel

olmadığı görülmüştür. Sonuç olarak, yapılan çalışmalarda GTP bağlayıcı

protein olan Rho'nun agonist aracılıklı kalsiyum duyarlığında yer aldığı

gösterilmiştir. Daha da önemlisi, belirli bir kalsiyum derişiminde artmış olan

kasılmaların, etkinleşen Rho ile MHZ fosforilasyonu oranındaki artıştan çok,

defosforilasyon oranındaki azalmadan kaynaklandığı ileri sürülmüştür. Rho

proteinleri bu etkiyi "downstream" efektörleri olan Rho-kinaz aracılığı ile

oluşturmaktadırlar. Rho- kinaz için özgül inhibitörler kullanılarak daha sonra

yapılan çalışmalarda, Rho-kinaz aracılıklı kalsiyum duyarlılığının hipertansiyon

ve koroner arter spazmı gibi hastalıklarda rolü olduğu gösterilmiştir. Düz kas

kasılmasının düzenlenmesinde Rho/Rho-kinaz sinyal ileti yolunun rolü Şekil

8'de özetlenmiştir70-91

.

26

Şekil 8. Düz kas kasılmasının düzenlenmesinde Rho/Rho-kinaz sinyal ileti yolunun rolü. Çeşitli agonistler ile uyarılan reseptörler, Gq türü heterotrimerik G proteinleri aracılığı ile hücre içi kalsiyum düzeylerini artırarak MHZK'yi etkinleştirirken, aynı zamanda G12/13 alt birimleri aracılığı ile de GEF'leri etkinleştirirler. GEF'ler etkisiz olan Rho'yu (Rho-GDP) etkinleştirerek (Rho-GTP) onun membrana translokasyonunu sağlar. Etkin Rho da alt efektörlerden (downstream) biri olan Rho kinazı etkinleştirir. Rho kinaz MYPT1'yi fosforilleyerek miyozin fosfatazı inhibe eder. Rho kinaz aynı zamanda doğrudan MHZ'yi de fosforiller. Ayrıca Rho kinaz arakidonik asit ile de uyarılır. Bunlara ek olarak Rho kinaz, miyozin fosfatazın fosforilasyona bağımlı inhibitörü olan CPI-17'yi de, PKC gibi, fosforilleyerek etkinleştirir. Böylece, Rho kinaz başlıca miyozin fosfatazı inhibe ederek, ayrıca MHZ'yi doğrudan fosforilleyerek hücre içi kalsiyum düzeyinden bağımsız bir biçimde düz kasın kasılma derecesini artırır. CaM, kalsiyum-kalmodulin kompleksi; CPI-17, 17-kDa protein kinase C-potentiated inhibitory protein of protein phosphatase-1; DAG, diaçil gliserol; DMPK, miyotonik distrofi protein kinaz; FLC, fosfolipaz C; GEF, guanin nükleotit değişim faktörü; LIMK, LIM kinaz; M20, miyozin fosfatazın 20 kDa katalitik olmayan alt birimi; MHZ, miyozin hafif zincir; MHZK, miyozin hafif zincir kinaz; MYPT1, miyozin fosfatazın miyozin bağlayan alt birimi; P, fosforilasyon; PIP2, fosfoinozitol

(4,5) bifosfat; PKC, protein kinaz C; PP1, miyozin fosfatazın katalitik alt birimi; SR, sarkoplazmik retikulum; Y-27632, seçici Rho- kinaz inhibitörü; ZIPK, zipper interacting protein kinase;. Kesiksiz çizgiler uyarıcı, kesikli çizgiler inhibe edici etkileri göstermektedir.

27

Rho-kinaz İnhibitörleri

Rho-kinazın etkinleşmesini önleyen çok sayıda bileşik geliştirilmiştir.

ROCK1 ve ROCK2'yi seçici olmayan biçimde inhibe eden bileşikler arasında

fasudil, Y-27632, Y-39983, Wf-536, SLx-2119, azabenzimidazol,

aminofurazanlar, DE-104, olefinler, izokinolinler, piridilalken türevleri, H-1152P,

bir ROKα inhibitörü, XD-4000, HMN-1152, 4-(1-aminoalkil)-N-4-

piridil)siklohekzan-karboksamitler, rostatin, BA-210, BA-207, BA-215- BA-285,

BA-1037, Ki-23095, VAS-012 ve kinazolin gibi maddeler bulunmaktadır. Bu

bileşiklerden fasudil ile serebral vazospazm, iveğen inme, anjina ve pulmoner

hipertansiyon, Y-39983 ile glokom ve BA-210 ile maküler dejenerasyon, omurilik

hasarı, glokom ve kanser tedavisine yönelik klinik çalışmalar sürmektedir.

Fasudil, Y-39983 ve BA-210 dışındaki bileşikler ise reperfüzyon hasarı,

ateroskleroz, hipertansiyon, serebrovasküler hastalık, inme, astım, kanser,

glokom, maküler dejenerasyon, inflamasyon, erektil işlev bozuluğu, insan

immün yetersizlik virüsü (HIV) enfeksiyonu, osteoporoz, saç kaybı ve kulak

çınlaması gibi durumların tedavisinde kullanılmak üzere geliştirmeye

çalışılmaktadır70-91.

28

GEREÇ VE YÖNTEMLER

Bu çalışma Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Yerel Etik Kurulu‟nun

04.01.2012 tarih ve 2012/04 sayılı oturumunda alınan karar doğrultusunda Mersin

Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalı tarafından planlandı

ve uygulandı. Çalışmanın deney aşaması Nisan 2012- Mayıs2012 tarihleri

arasında Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Araştırma Birimi‟nde

gerçekleştirildi. Bu birimde üretilen 200-250 gr ağırlığında W istar-Albino cinsi

sıçanlar kullanıldı. Denekler 22±1 oC ısıda, 12 saat karartılıp 12 saat aydınlatılan ve

%50-60 oranında nemlendirilen bir ortamda tutuldular. Deney gününe kadar

sıçanların beslenmesinde standart pellet yem ile şehir içme suyu kullanıldı. Giderler

için Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri kapsamında destek sağlandı

(BAP-TF CTB (SB) 2012-2 TU). Deney sonunda çıkartılan dokuların histopatolojik

incelemesi Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı, mpo mda m rna

Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, Rho-kinaz ekspresyonları

ve aktiviteleri ise Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı

tarafından çalışıldı

On iki saat açlıktan sonra deneklere 3 mg/kg dozuna xylazin hidroklorür

(Rompun, Bayer-İstanbul) ve 90 mg/kg dozunda ketamin hidroklorür (Ketalar, Pfizer -

İstanbul) kas içine uygulanarak anestzisağlandı. Tüm ratların karın cildi %10 ‘luk

povidon iyot çözeltisi ile temizlenerek örtüldü ve orta hat kesisi ile karına girildi.

Kontrol gruplarında laparatomi yapılarak Superior Mezanterik Arter (SMA)

bulunup prepare edildikten sonra klemplenmeden batın kapatıldı. Kontrol grubu ratlar

3 gruba ayrıldı. Birinci gruba hiçbir ilaç verilmedi, ikinci gruba 1 mg/Kg Y-27632 intra

peritoneal olarak ve üçüncü gruba 5mg/Kg Y-27632 intra peritoneal olarak verildi.

Çalışma gruplarında SMA bulunup prepare edildikten sonra buldok pensi ile 30

dakika klemplenerek iskemi oluşturuldu. 30 dakika sonunda klempler açılarak 90

dakika reperfüzyon yapıldı. İskemi ve reperfüzyon yapılan ratlar 3 gruba ayrıldı.

Birinci gruba reperfüzyondan 60 dakika önce serum fizyolojik intra peritoneal olarak

verildi, ikinci gruba reperfüzyondan 60 dakika önce 1 mg/Kg Y-27632 intra peritoneal

olarak ve üçüncü gruba 5 mg/Kg Y-27632 intra peritoneal olarak verildi.(Resim 1)

3 saat sonunda kontrol ve çalışma gruplarındaki tüm ratlar sakrifiye edildi.

Kan ve dokuda (ileum) MDA, MPO, Western Blot yöntemi ile İleal ROCK aktivitesi

29

ölçülecek,ileal dokuda mRNA ekspresyonu ölçülecek ileal doku hasarı hematoksilen-

eozin ile boyanarak ışık mikroskobunda Chiu yöntemi ile eğerlendirildi.

Tablo 2 deney grupları

Deney Grupları Hayvan Sayısı/Grup

Grup I: Sham

7

Grup II: İskemi-reperfüzyon (İ/R) + serum fizyolojik

7

Grup III: Sham + 1 mg/Kg Y-27632

7

Grup IV: İ/R + 1 mg/Kg Y-27632 7

Grup V: Sham + 5 mg/Kg Y-27632

7

Grup VI: İ/R + 5 mg/ Kg Y-27632

7

30

RESİM 1 : A:SMA diseksyonu , B : SMA klemplenmesi, C: kontrol grubu D:

iskemi reperfzyon grubu

Rho-Kinaz Enzim Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Dokular lizis tampon [TrisHCl (pH 7.4) 50 mM, NaCl 400 mM, EGTA 2 mM,

EDTA 1 mM, dithiothreitol (DDT) 1 mM, phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) 10

M, leupeptine 10 g ml/ml, pepstatin 1 g/ml, benzamidine 1 mM ile homojenize

edildi. Homojenizasyon işleminden sonra 13.000 rpm’de 10 dk +4 C ’de santrifüj

sonrası süpernatantlar alınarak Bradford yöntemi ile total protein tayini yapıldı93.

Total protein tayinini takiben ROCK aktivasyonunu ölçmek için ROCK Ativity

Assay Kit (Cell Biolabs, Inc. USA) kullanıldı. Eşit miktarda protein içeren örnekler

MYPT-1 ile kaplı platelere yüklendi. 45dk 30 oC’de inkübasyonun ardından yıkanan

platelere anti-fosfoMYPT-1 antikoru eklenerek oda ısısında 1 saat inkübe edildi. 1

31

saat sonrasında tekrar yıkanan platelere HRP ile konjuge sekonder antikor eklenerek

tekrar 1 saat oda ısısında inkübasyona bırakıldı. 1 saatin sonunda plateler yıkanarak

substrat solusyonu eklendi ve 20dk sonrasında 450nm de optik dansiteleri ölçüldü.

Malondialdehid (MDA) Ölçümü

Serum ve doku örneklerindeki MDA düzeyleri lipid peroksidasyon ürünü olan

MDA'in tiyobarbütirik asit ile reaksiyonu sonucu oluşan pembe rengin 532 nm dalga

boyunda spektrofotometrik ölçülmesi prensibine dayanmaktadır105.

Doku MDA Ölçümü

Homojenizasyon: Tüm dokular tartıldı. Doku ağırlıkları 50 mg. dokuya 500 μL

0.15 M KCl eklenerek homojenize edildi.

Metod: Aerobik şartlarda homojenatın pH:3.4’de tiyobarbitürik asit ile 95˚C’de

inkübasyonu sonucu eğer lipid peroksidasyonu var ise bunun sekonder bir ürünü

olan malondialdehit oluşur. Oluşan MDA tiyobarbitürik asit ile pembe renkli bir

kompleks oluşturur. Bu renk şiddetinin 532 nm.’de spektrofotometrik olarak ölçümü

ile lipid peroksidasyonu saptanır.

Kör Çalışma

SDS (%8.1) 100μl 100 μl

Asetik asit (%20, pH:3.5) 750 μl 750 μl.

TBA* (%0.8, pH:3.5) 750 μl 750 μl

Distile su 400 μl 350 μl

Homojenat - 50 μl

‡SDS: sodyum dodesil sülfat

*TBA: Tiyobarbitürik asit

Hazırlanan solüsyonlar 95˚C’de 30 dakika inkübe edildi. Daha sonra musluk

suyunda soğutuldu. 1 ml distile su eklendi. 2.5 ml. n-bütanol: piridin (14:1 oranında

hazırlandı) solüsyonu eklendi. Vorteksde karıştırıldı. 4000 rpm.’de 15 dakika

santrifüje edildi. Üstteki kısmı alınarak spektrofotometrede 532 nm.’de absorbsiyonu

okundu.

Sonuçlar: Konsantrasyon (nmol/ml olarak) aynı yöntemle çalışılarak değişik

konsantrasyonlarda hazırlanan standart eğri yardımı ile hesaplandı.

Serum MDA

Biyokimya tüplerine alınan Kan örnekleri 3000 rpm de 10 dakika santrifüj

edilerek elde edilen serum çalışılana kadar -20 0C’de saklandı

32

SDS (%8.1)

Kör

100μl

Çalışma

100 μl

Asetik asit (%20, pH:3.5)

TBA* (%0.8, pH:3.5)

750 μl

750 μl

750 μl.

750 μl

Distile su 400 μl 350 μl

Homojenat - 50 μl

‡SDS: sodyum dodesil sülfat

*TBA: Tiyobarbitürik asit

Hazırlanan solüsyonlar 95˚C’de 30 dakika inkübe edildi. Daha sonra musluk

suyunda soğutuldu. 1 ml distile su eklendi. 2.5 ml. n-bütanol: piridin (14:1 oranında

hazırlandı) solüsyonu eklendi. Vorteksde karıştırıldı. 4000 rpm.’de 15 dakika

santrifüje edildi. Üstteki kısmı alınarak spektrofotometrede 532 nm.’de absorbsiyonu

okundu.

Sonuçlar: Konsantrasyon (nmol/ml olarak) aynı yöntemle çalışılarak değişik

konsantrasyonlarda hazırlanan standart eğri yardımı ile hesaplandı.

Myeloperoksidaz (MPO) Ölçümü

Serum ve doku örneklerindeki MPO düzeyleri Golowich ve ark. nın104

geliştirdikleri yönteme göre saptandı. Yöntem hidrojen peroksitin homojenat

tarafından oksitlenerek o-dianozidini redüklemesi ve redükte o-dianozidinin 410

nm’de ölçülmesi prensibine dayanmaktadır.

Doku MPO Ölçümü

Homojenizasyon: Tüm dokular tartıldı. 300 mg dokuya 5 ml. 0.02 M EDTA

(pH:7.4) hesabıyla doku miktarına göre EDTA konularak 60 saniye homojenize edildi.

Homojenatın 1.5 ml’si 20.000 devirde (15 dakika +4°C’de) santrifüje edildi,

süpernatant atıldı. 0.05 M KPO4 (pH:6) tamponu içinde %0.5 HETAAB (Hekza Adezil

Trimetil Amonyum Bromid) hazırlandı. Pellet 1,5 ml HETAAB ile yeniden

homojenize edildi. Homojenat 20.000 devirde tekrar (15 dakika +4°C’de) santrifüje

edildi, süpernatant çalışma için alındı104.

Metod: Hidrojen peroksitin homojenat tarafından oksitlenerek o-dianosidini

redüklemesi ve redükte o-dianosidin 410 nm.’de ölçülmesi prensibine dayanır.(104)

33

Tampon

Kör

0.2 ml.

Çalışma

0.2 ml.

H2O2

O-dionisidin (%1,metanol)

0.09 ml

0.1 ml.

0.09 ml.

0.1 ml.

Distile su 1.6 ml 1.3 ml

Homojenat - 0.3 ml.

H2O2 %30, den 1/10 oranında distile su dilue edilir

Hazırlanan kör ve çalışma örnekleri 37˚C’de 30 dakika bekletildi. 0.2 ml 3 M

HCl eklendikten sonra 410 nm.’de köre karşı okutuldu.

Sonuçlar: Spesifik aktivite =Ünite / gr doku olarak hesaplandı.

Serum Miyeloperoksidaz (MPO) Ölçümü :

Hidrojen peroksitin örnek tarafından oksitlenerek o-dianozidini redüklemesi ve

redükte o-dianozidinin 410 nm’de ölçülmesi prensibine dayanmaktadır104. Tam

kandan ayrılan serum örnekleri aşagıdaki tablodaki pipetlenerek MPO düzeyleri

ölçüldü.

Tampon

Kör

0.2 ml.

Çalışma

0.2 ml.

H2O2

O-dionisidin (%1,metanol)

0.09 ml

0.1 ml.

0.09 ml.

0.1 ml.

Distile su 1.6 ml. 1.3 ml

Örnek - 0.3 ml.

H2O2 %30, den 1/10 oranında distile su dilue edilir

Hazırlanan kör ve çalışma örnekleri 37˚C’de 30 dakika bekletildi. 0.2 ml 3 M

HCl eklendikten sonra 410 nm.’de köre karşı okutuldu.

Sonuçlar: Spesifik aktivite =Ü /l olarak hesaplandı.

Nitrik Oksit Düzeyinin Belirlenmesi

Nitrik oksit düzeyleri kolorometrik yöntem ile ölçüldü. Yöntemin prensibi nitrat

redüktaz varlığında, nitratın NADPH kullanarak nitrite indirgenmesi esasına

dayanmaktadır101.

Oluşan nitrit sülfamit ve N-(1-naftil)-etilendiamin dihidroklorür ile reaksiyona

girer ve kırmızı-mor diazo boyasını verir.

34

Bu renk 550 nm de ölçülürerek elde edilen absorbans standart eğri

kullanılarak konsantrasyon hesaplandı.

mRNA Gen Ekspresyonu

High Pure RNA Tissue Kit ile yapılmıştır.

Her örnek için; dokular 30-35 mg tartıldı ve Roche MagNA Lyser

Homojenizatörde 350 ul High Pure RNA Tissue Kit Tisssue Lysis/Binding Buffer ile

MagNA Lyser Green Bead’ler içerisinde 6500 devirde 40 sn.homojenizasyon

işlemine tabi tutuldu, +4 C ‘de 2 dk soğuk blok üzerinde tutuldu, tekrar 6500 devirde

40 sn. homojenizasyon işlemine tabi tutuldu, 5-10 dk +4 C de soğuk blok üzerinde

bekletildi. Beadler üzerine 175 er ul Absolute Ethanol eklendi ve izolasyon

aşamasına geçildi ve aşağıdaki protokol uygulandı.

cDNA Sentez Aşaması

Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit ile yapılmıştır.

2 aşamalıdır. Her bir örnek için;

9 ul Pure Total RNA + 2 ul Random Hexamer Primer + 2 ul PCR Grade Water

= 13 ul Total Hacim

Bu karışım Termal Cycler da, 65 C de 10 dk bekletildi.

13 ul ürün + 4ul Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer + 0,5 ul

Protector Rnase Inhibitor + 2UL Deoxynucleotide Mix + 0,5 ul Transcriptor Reverse

Transcriptase = 20 ul Final Volume

Bu karışım Temal Cycler da 25 C 10 dk, 50 C de 60 dk, 85 C de 5 dk bekletildi

ve cDNA’lar elde edildi.

Real Time PCR Aşaması

Light Cycler 480 Real Time Sisteminde çalışılmıştır.

Referans Gen Mix

1 ul Primer + 1 ul Probe + 4 ul Taqman Master + 9 ul PCR grade water = 15 ul total

hacim

Target Gen Mix

1 ul F primer + 1 ul R primer + 1 ul Probe 42 + 4 ul Taqman Master + 8 ul PCR grade

water = 15 ul total hacim

Herbir örnek için yukarıdaki mixlere 5 er ul cDNA eklenerek Light Cycler 480

Sistemine ait plateler üzerinde çalışıldı.

35

Çalışma sonucunda Absolute Quantification yöntemiyle amplifikasyon eğrileri

kontrol edildi. Relative Quantification Hesaplamalarıylada expresyonu olan örneklerin

Target/Referans hesaplamaları sistem tarafından otomatik yapıldı.

Histopatolojik İnceleme

% 10’luk Formaldehit ile fiske edilen ileum örneğinin parafin kesitleri

hazırlandıktan sonra Hematosilen-Eozin ile boyanır. Histopatolojik değerlendirme

Chiu yöntemi ile yapılıdı:

Grade Histolojik görünüm

0 Normal

1 Subepitelial ödem, apikal epitel hücrelerinde kısmi ayrılma

2 Villus uç kımında epitel hücrelerinde dökülme

3 Epitel hücrelerindeki dökülme villu tabanına uzanır

4 Lamina propria da nekroz (Kısmi mukozal nekroz)

5 Total mukozal nekroz

Hesaplamalar ve İstatistiksel Değerlendirme

Klinik bulguların sunumunda sürekli değişkenlerden normal dağılım

gösterenler için ortalama ± standart sapma, Medyan(min-maks) değerleri

kullanılmıştır. Sürekli verilerin normal dağılıma uygunluğunu test etmek için Shapiro

Wilk testi uygulanmıştır. Normal dağılım gösteren sürekli değişkenler (MPO, nitrit,

UML ve UMOL) açısından gruplar arasında fark olup olmadığı ortalamaları ANOVA

ve post-hoc Tukey testi ile karşılaştırılarak belirlenmiştir. Normal dağılım

göstermeyen değişkenler (MDA, NMOL, Ekspresyon ve Patoloji) açısından gruplar

arasında fark olup olmadığı medyanları Kruskal-Wallis testi ve devamında Conover

çoklu karşılaştırma yöntemi ile karşılaştırılarak belirlenmiştir. İstatistik analizler

MedCalc 12.1.3 paket programı kullanılarak yapılmıştır. İstatistik anlamlılık sınırı

p0,05 olarak belirlenmiştir.

36

Ser

um

MD

A (

Nm

ol/

ml)

Serum MDA

BULGULAR

Serum MDA düzeyleri ortalama ve standart sapmalarına göre yapılan

istatistiksel değerlendirmede (Tablo 3) gruplar arasında istatistiksel olarak farklılık

saptanmadı. p>0.05 (şekil 9)

32

30

28

26

24

22

20

18

16

14

1 2 3 4 5 6

M edian

25%-75%

Şekil 9: Serum MDA düzeyi ile ilgili grafik

Serum MPO

Serum MPO düzeyleri ortalama ve standart sapmalarına göre yapılan

istatistiksel değerlendirmede (Tablo 3) gruplar arasında istatistiksel olarak farklılık

saptanmadı. p>0.05 (şekil 10)

37

Ser

um

MP

O (

U/g

r)

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0

1 2 3 4 5 6

M ean

M ean±0,95 Conf. Interval

Şekil 10 Serum MPO düzeyi ile ilgili grafik

Serum Nitrit+Nitrat

Serum nitrit+nitrat düzeyleri ortalama ve standart sapmalarına göre yapılan

istatistiksel değerlendirmede (Tablo 3) sonucunda iskemi reperfzyon grubunda sham

grubuna göre nitrit-nitrat seviyesindeki artış istatistiksel olarak anlamlı (p<0,05)

bulunmuştur.Y27632 uygulanan bütün tedavi gruplarında (grup 3-4-5-6) nitrit-nitrat

seviyelerinde iskemi reperfüzyon grubuna göre düşüş saptandı ve bu düşüş

istatistiksel olarak anlamlı bulundu p<0,05. (Şekil 11)

38

Ser

um

Nit

rit+

Nit

rat

(Um

ol/

gr)

120

100

80

60

40

20

0

1 2 3 4 5 6

M ean

M ean±0,95 Conf. Interval

Şekil 11 Serum Nitrit-Nitrat seviyeleri ile ilgili grafik

Doku MDA Düzeyi

Doku MDA düzeyleri ortalama ve standart sapma değerlerine göre (tablo 3)

istatistiksel değerlendirilmesi sonucunda iskemi reperfüzyon yapılan grubun MDA

düzeyi sham grubuna göre daha düşük saptanmıştır (P<0.05). İskemi reperfüzyon

yapılan grup ile 1mg/kg ve 5 mg/kg Y27632 + iskemi reperfüzyon uygulanan denekler

arasında anlamlı farklılık saptanmadı (P>0.005). (şekil 12)

39

MD

A

(Nm

ol/

ml)

DO

KU

MP

O (

U/g

r)

34

32

30

28

26

24

22

20

18

16

14

1 2 3 4 5 6

M edian

25%-75%

Şekil 12: Doku MDA düzyleri ile ilgili grafik

Doku MPO

Doku MPO düzeyleri ortalama ve standart sapma değerlerine göre yapılan

istatistiksel değerlendirme (tablo3) sonucunda sham ile iskemi reperfüzyon grubu,

sham + 1 mg/kg Y27632 ve sham + 5 mg/kg Y27632 grubları arasında istatistiksel

olarak anlamlı fark oluştu (p<0.05). (şekil 13)

8

7

6

5

4

3

2

1

0

1 2 3 4 5 6

M ean

M ean±0,95 Conf. Interval

Şekil 13. Doku MPO düzeyleri ile ilgili grafik

40

Nitr

it+N

itra

t (U

mo

l/g

r)

Doku Nitrit-Nitrat

Doku nitrit + nitrat düzyleri ortalama ve standart sapma değerlerine göre

(tablo 3) istatistiksel değerlendirilmesi sonucunda gruplar arasında istatistiksel olarak

farklılık saptanmadı. p>0.05 (şekil 14)

65

60

55

50

45

40

35

30

25

20

15

1 2 3 4 5 6

M ean

M ean±0,95 Conf. Interval

Şekil 14. Doku nitrit nitrat seviyesi ile ilgili grafik

m-RNA Ekspresyonu

Doku m-RNA ekspresyon düzyleri ortalama ve standart sapma değerlerine

göre (tablo 3) istatistiksel değerlendirilmesi sonucunda gruplar arasında istatistiksel

olarak farklılık saptanmadı. p>0.05 (şekil 15)

41

RO

CK

Acti

vati

on

(O

D)

Ek

spre

syo

n

0,04

0,03

0,02

0,01

0,00

-0,01

1 2 3 4 5 6

M edian

25%-75%

Şekil 15. mRNA ekspresyon düzeyi ile ilgili grafik

ROCK Aktivitesi

Doku ROCK aktivite düzeyleri iskemi reperfüzyon grubunda sham grubuna

göre anlamlı derecede yükselmiştir (p<0.05). Ayrıca, iskemi repürfüzyon + 1 mg

Y27632, iskemi reperfüzyon + 5 mg Y27632 uygulanan gruplarda sadece iskem

reperfüzyon uygulanan gruba göre düşme görülmüştür ve bu düşme sadece iskemi

reperfüzyon + 5 mg Y27632 uygulanan grubta anlamlı bulunmuştur. (p<0.05). (şekil

16)

0.3

0.2

Sham

I/R

I/R + 1 mg/kg Y-27632

I/R + 5 mg/kg Y-27632

1 mg/kg Y-27632

5 mg/kg Y-27632

0.1

0.0

* İR grubunda ROCK aktivitesi Sham grubuna göre anlamlı derecede artmıştır (p<0.05)

+ İR grubuna göre İ/R + 5 mg/kg Y27632 uygulan grubun ROCK aktivitesi anlamlı derecede baskılanmıştır(p<0.05)

Şekil 16. Serum ROCK Aktivitesi ile ilgili grafik

42

Pat

olo

ji

Histopatolojik inceleme sonuçları

Chiu sınıflaması ile değerlendirilen deneklerin median ve min-max değerlerine

göre (Tablo 3) iskemi reperfizyon grubu ve sham grubu arasında istatistiksel olarak

anlamlı fark oluştu. 5 mg/kg Y 27632 + İR ve 1 mg/kg Y 27632 + İR yapılan grupta

iskemi reperfüzyon yapılan gruba göre daha az hasar oluştuğu fakat sadece yüksek

doz uygulanangrup ile iskemi reperfüzyon uygulanan gruplar arasındaki fark

istatistiksel olarak kanıtlandı. P<0.05 (şekil 17)

4,5

4,0

M edi an

25%-75%

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

1 2 3 4 5 6

Şekil 17. Chiu sınıflamasına göre gruplara ait grafik

43

Resim 2. Deneklerde elde edlilen ileal dokunun ışık mikroskobi bulguları (A:

Grade 0, B: Grade 4, C: Grade 3, D:Grade 1)

44

Grup1 Grup2 Grup3 Grup4 Grup5 Grup6 P Doku MPO U/gr

2,5444±0,57296

5,1349±2,27786

a 2,2697±1,29775

b

4,7841±1,1513

2,3325±1,15321

b

3,4887±2,33661

0,003

(1,48-3,18)

(3,16-9,9)

(0,01-4,16)

(2,91-5,83)

(1,17-4,05)

(0,01-6,87)

Doku MDA nmol/ml

30,0035±6,9027

23,5275±6,17733

24,894±4,8288

21,6263±4,44049

16,1603±6,87762 18,2397±7,11253

<0,001

26,20 (25,37- 44,08)

23,29 (11,23-30,36)

a

26,62 (16,64- 29,94)

23,29 (12,06-

24,95)a

18,30 (1,25-

22,46)a,b,c,d

20,79 (2,5-

22,87)a,b,c

Doku NİTRİT+ NİTRAT umol/gr

36,8909±4,00929

41,493±19,07043

30,8322±8,85599

42,1747±10,71157

27,4622±7,43905

46,4268±14,6532 9

0,052

(29,36-41,22)

(23,93-82,14)

(20,37-47,75)

(31,06-61,69)

(20,19-41,83)

(23,67-71,04)

Serum MPO U/ml

0,1426±0,05117

0,2613±0,25099

0,1266±0,04388

0,0837±0,03253

0,0863±0,03699

0,2427±0,2025

0,07

(0,07-0,21)

(0,11-0,81)

(0,07-0,18)

(0,05-0,14)

(0,04-0,14)

(0,04-0,53)

Serum MDA Nmol/ml

15,8632±5,59229

15,6256±6,61887

18,2398±1,61838

20,5569±11,24662

14,4967±6,48055

18,2397±7,85957

0,4019

17,88 (3,33-19,55)

18,29 (0,83-19,13)

17,88 (16,22- 20,79)

19,13 (1,66-37,43)

16,63 (0,00-18,3)

18,29 (4,99- 32,02)

Serum NİTRİT+ NİTRAT Umol/ml

8,9355±2,27016

74,5142±34,39502

a 7,3985±3,34739

b 11,1764±2,49254

b 8,9675±3,51985

b 16,2178±5,51585

b

<0,001

(6,52-12,4)

(16,81-113,49)

(2,31-12,17)

(8,57-14,69)

(4,86-13,84)

(10,49-27,31)

mRNA Ekspresyo nu

0,00 ,00

0,0023 ,0061

0,0034 ,0091

0,0149 ,0219

0,0021 ,0054

0,0055 ,0105

0,4283

0,00 (0,00-0,00)

0,00 (0,00-0,02)

0,00 (0,00-0,02)

0,00 (0,00-0,05)

0,00 (0,00-0,01)

0,00 (0,00-0,03)

Patoloji

0,00 ,00

2,43 ,39

1,00 ,00

1,57 ,13

1,00 ,00

1,14 ,68

0,0004

0,00 (0,00-0,00)

3,00 (1,00-4,00)

a

1,00 (1,00-1,00)

1,00 (1,00-4,00)

1,00 (1,00-1,00)

0,00 (0,00-4,00)

b

Tablo 3. çalışma gruplarıa ait doku ve serum MPO,MDA,Nitrit-Nitrat, Patoloji,

mRNA ekspresyonuna ait OrtalamaStandart Sapma (Min-Max) değerleri ve p değerleri

a: Grup1’den farkı istatistiksel olarak anlamlı p<0,05

b: Grup2’den farkı istatistiksel olarak anlamlı p<0,05

c: Grup3’den farkı istatistiksel olarak anlamlı p<0,05

d: Grup4’den farkı istatistiksel olarak anlamlı p<0,05

45

TARTIŞMA

İskemi ve ardından gelişen reperfüzyonun serbest oksijen radikal formasyonu,

demir depolarının salınması, organların mikrovasküler hasarı, inflamatuar sitokinler,

kompleman aktivasyonu, hasar alanında nötrofil infiltrasyonu gibi çok sayıda etken

araclığı ile doku hasarı çarpıcı bir şekilde büyür. İnflamatuar cevabın gelişmesi

intestinal hasarın patogenezinde kilit rol oynar. Özellikle nötrofillerin infiltrasyonunun

ve sonrasında yaptıklarının intestinal iskemi reperfüzyon hasarının takip ettiği intestin

içindeki doku hasarından sorumlu olduğuna inanılır.

Aktive olmuş endotelyum tarafından eksprese edilen çeşitli adezyon

moleküllerinin aracılık ettiği lökositlerin doku içine migrasyonunda en önemli

basamak lökosit endotel hücresi etkileşimidir. Doku hasarı aktive edilmiş nötrofillerce

geniş bir dizi enzim salınımı sonucu olarak meydana gelmektedir.

Endojen antioksidan sisteminin temizleme potansiyelini aşan nötrofillerce

aktive edilen reaktif oksijen türlerinin üretimi, protein modifikasyonu, DNA hasarı ve

lipit peroksidasyonu ile sonuçlanan oksidatif strese yol açabilir. Oksidan hasarıda,

kapiller permabilitesinde artışla ilişkili olan epitelyum hücrelerinin şekil değişikliğini

ortaya çıkarabilir.

İnflamatuar hücrelerin migrasyonu hücre iskeleti aktini tarafından

düzenlenmektedir ve bu olayı düzenleyen en önemli mekanizmalardan birisi Rho-ile

indüklenen sinyal ileti mekanizmasıdır8. Rho ve alt efektörleri bu olayların bazılarının

patogenezinden sorumlu tutulabilir.

İskemi/reperfüzyon hasarlanmasında Rho/Rho-kinaz yolağı belirgin rol

oynamaktadır. Daha önceki çalışmalarda, ROCK inhibitörlerinin kardiyak9,10, renal11,

hepatik12, serebral13 ve nöronal14 iskemi/reperfüzyon hasarlanmalarını önlemede

oldukça etkili olduğu gösterilmiştir.

Bu sebepten, biz rho kinazın nötrofil infiltrasyonu-serbest oksijen radikalleri -

organ hasarı ekseni ile olası ilgisini ortaya çıkarmak için serum ve doku oksidatif

stres markerlarını (MPO,MDA ve Nitrit-Nitrat) araştırdık.

Çalışmamızda iskemi reperfüzyon yapılan grup ile kontrol grubu arasında

patolojik açıdan farklılık saptanmış olup iskemi reperfüyon uygulamamız sonucunda

hasar oluşturulabildik. Ayrıça çamalışmamız sonucunda iskemi reperfüzyon

46

uygulanan deneklerde rock aktivitesinin istatisiksel olarak anlamlı derecede arttığı

görüldü.

İskemi reperfüzyon ile kontrol grubu arasında mRNA ekspresyonu açısından

istatistiksel olarak anlamlı bir sonuç elde dilemedi. Bu durumun mRNA nın yapı

itibariyle labil olup çabuk yıkılması sonucunda incelemede ekprese mRNA tespitinde

güçlük yaşandı. Daha çok örnek ile çalışmanın tetkrarlanması halinde genetik

düzeyde daha anlamlı sonuçlar çıkabileceğini düşünmekteyiz

Çeşitli nedenlerle gelişen nötrofillerin aktivasyonu sonucu myeloperoxidase

(MPO) gibi enzimlerin üretimi ve salınımı gerçekleşir. MPO salınımı daha çok iskemi

aşamasında artış gösteren bir belirteçtir. Dokuda MPO aktivitesinin ölçümü ile nötrofil

aktivasyonu indirekt olarak saptanabilir66,69. Malondialdehit Lipit peroksidasyonunun

son ürünüdir. MDA yağ asidi oksidasyonunun spesifik ve kantitatif bir indikatörü

olmamakla beraber lipit peroksidasyonunun derecesiyle iyi korelasyon gösterir 72,76.

Lipit peroksidasyonuna bağlı MDA birikimi daha çok reperfüzyon fazında gelişen

hasarın önemli bir komponentidir.

NO, siklik guanozin monofosfat üzerinden etki gösteren güçlü bir çevresel

düz kas gevşeticisidir97. NO hem hücre içi hem de hücre dışında düzenleyici işlev

gören küçük, reaktif bir serbest radikal molekülüdür. Nitrik oksitin damar

tonusunun düzenlenmesi, bağışıklık sisteminin düzenlenmesi, düz kas

hücrelerinin çoğalmasında rol aldığı ve kollajen sentezini engellediği

gösterilmiştir 97,98. Nitrik oksit sentaz (NOS) arjininden sitrulin oluşumunu uyarır

ve bu reaksiyon sırasında NO oluşur. Nitrik oksit sentazın üç farklı şekli vardır69.

Nöronal (nNOS), indüklenebilir (iNOS) ve endotelyal (eNOS). Üç NOS izoformu

aminoasit dizilişi bakımından %50 benzerlik gösterir.

Kanda NO hızlı bir biçimde nitrit ve nitrata dönüşmektedir. Kandaki NO'nun

asıl dayanıklı olan metaboliti nitrattır. Ayrıca, NO amino asit ve proteinlerdeki tiyol

grupları ile de etkileşmekte ve nitrozotiyol bileşikleri biçiminde depolanabilmektedir.

NO bir serbest radikal olmasından dolayı oldukça reaktiftir ve çeşitli yapılar ile

etkileşmektedir. NO'nun serbest oksijen radikalleri ile de etkileşebilme özelliğinden

dolayı, serbest radikal yakalayıcısı ve dolayısı ile hücre koruyucusu olduğu

düşünülmektedir

Bir serbest radikal olarak NO da öteki serbest radikaller ile reaksiyona girerek

peroksidan veya antioksidan etkilerini oluşturur. NO'nun lipit peroksidasyonu

üzerindeki etkisi ile ilgili bulguların çelişkili olmasının çeşitli nedenleri bulunmaktadır.

47

Aşırı veya eşit derişimde süperoksit ile NO aynı anda ve yerde bulunduklarında güçlü

bir oksidan molekül olan peroksinitrit oluşumuna neden olarak lipit peroksidasyonuna

neden olurken, aşırı miktarda oluşan NO ise süperoksit ve lipit peroksit radikallerini

nötralize ederek, SOD'u etkinleştirerek ve NADPH oksidaz veya sitokrom P450 gibi

süperoksit kaynaklarını inhibe ederek oksidatif strese karşı koruma da

sağlamaktadır100-103.

Bu çalışmada iskemi grubunda sarum nitrit-nitrat düzeyleri kontrol grubuna

göre istatistiksel olarak anlamlı birşekilde yükselmiş olup bu durum doku örneklerine

yansımamıştır. Buda deneklerde iskemi reperfüzyon hasarının serum düzeyindeki

nitrit nitrat artışını oksidan stres artışı olarak yorumlamak mümkündür.

Bizim çalışmamızda iskemi reperfüzyon uygulanan deneklerin doku

örneklerindeki MPO seviyesi kontrol grubuna göre anlamlı derecede yükselmiştir.

Buna karşılık çalışmadaki deneklerin doku örneklerinde MDA düzeylerinde beklenen

değişiklik saptanmadı. Deneklerin serum örneklerinde gruplar arasında MPO ve MDA

seviye arasında anlamlı farklılık saptanmadı. İskemi reperfüzyon uygulanan

deneklerde NO seviyesinin yükselmesi NO nun oksidan özelliğinin yanında

antioksidan özelliğinin sonucunda MPO ve MDA yı baskılaması mümkündür. Bu

nedenle iskemi reperfüzyon uygulanan deneklerde MPO ve MDA yükselmemiştir.

Çalışmamızdaki iskemi reperfüzyon uygulanan ve Y27632 uygulanan grupları

karşılaştırmasında elde edilen major bulgularının ilki intestin iskemi reperfüzyon

hasarı yapılan denekler ile rho kinaz inhibitörü Y-27632 uygulanan denekler arasında

farklılık saptanmıştır. Y-27632 uygulanan deneklerde ROCK proteininin aktivitesinin

azalırken iskemi reperfüzyon uygulanan deneklerinde aktivite artmıştır. Çalışmanın

ikinci major bulgu ise histopatolojik inceleme olarak değerlendirilen düşük doz (1

mg/kg) uygulaması intestinal hasarı azaltmasına rağmen yeterli koruma

sağlıyamamıştır. Buna karşılık yüksek doz (5 mg/kg) uygulaması halinde intestinal

hasarın oluşumunu engellediği görülmüştür. Buna ek olarak Y-27632 uygulanan ve

ulanmayan denek gruplarının biyokimyasal değerlendirmeleri sonucunda sadece

ratların selektif Rho-kinaz inhibitörü olan Y-27632 (1-5mg/kg) ile ön işlemi serum

nitrit-nitrat düzeylerini karşlaştrması istatistiksel olarak anlamlı sonuç verdi. Diğer

yandan doku nitrit-nitrat düzeyi ,serum ve doku mpo ve mda ya yönelik yapılan

biyokimyasal inceleme sonucunda istatistiksel olarak anlamlı bir sonuç elde edilmedi.

Bulgularımız, Rho-A/Rho-kinaz yolunun etkinliğindeki artışın önlenmesi

durumunda serum düzeyinde aşırı miktarda NO oluşumu ve antioksidan enzimlerin

48

etkinliğindeki artmaya lipit peroksidasyonu ve nötrofil infiltrasyonunun eşlik ettiği

İ/R'ye bağlı olarak gelişen inflamasyon ve oksidatif stres sonucunda ortaya çıkan

organ hasarının doz bağımlı önlenebileceğini düşündürmektedir

. Bu bulgular gösterdiki oksidatif strese bağlı nötrofil infiltrasyonu sadece

5mg/kglık Y-27632 uygulaması ile engellendi. Fakat 1mg/kg lık Y-27632 uygulanan

iskemi reperfüzyon grubundaki ratlarda oksidatif stresi ve organ hasarını önlemede

yetersiz kaldı. Bu yetersizlik ajan dozunun az oluşuna bağlı olabilir. Bu sebepten Y-

27632 nin yüksek dozlarına biyokimyasal parametreleri geliştirmek için ihtiyaç

duyulabilirdi.

Ek olarak bu çalışmada tedavi grubundaki histopatolojik sonuçlar

biyokimyasal incelemelerdeki kısmi olumsuz sonuçlara rağmen doz bağımlı olarak

yüksek dozda olumlu etkisi istatisksel olarak gösterilebildi. Y-27632 uygulamak

(1mg/kg ve 5mg/kg) intestinal histolojide doz bağımlı olarak anlamlı bir korumaya

sebep oldu. Başka bir deyişle biyokimyasal parametereler sadece serum nitrit- nitrat

düzeyleri intestinedeki yapısal değişikliklerin iyileşmesinden daha önce

düzelmektedir. İskemi reperfüzyon yapılan dokularda histopatolojik iyileşmede daha

iyi sonuçlar alabilmek için Y-27632nin daha yüksek dozlarına ihtiyaç vardır. Y-

27632nin etkisizliğinin bir diğer sebebide bu ajanın hasarlı bölgeye arteryel kan akış

miktarını azaltarak hasarı kötüleştiren splankinik kan damarlarının hasar

alanlarından başka bölgede vazodilatasyonu indüklemesi olabilir. Bu iskemi

süresinin genişlemesine ve intestinal iskeminin agreve olmasına ağırlaşmasına yol

açar. Bu sebepten ratların düşük doz Y-27632 ile ön tedavisi intestinal histolojiyi

olumlu yönde etkiliyemedi.

49

SONUÇ ve ÖNERİLER

Sonuç olarak bu çalışma ratlarda intestinal iskemi reperfüzyon hasarında

rho/rho-kinaz iletişiminin (etkileşiminin) etksini ve ilgisini kanıtlamaya çalştık.

Çalışmadaki bazı parametreler ile intestinal iskemi reperfüzyon hasarında rho/rho-

kinaz iletişiminin belli ölçüde gösterebildik. Bunun yanında ratların bir Rho kinaz

inhibitörü olan Y-27632 ile ön tedavisi lipit peroksidasyonunu kısmi olarak engelledi.

Y-27632 uygulaması intestinal hasarı engellemede doz bağımlı olarak başarılı oldu.

Böbrek, kalp ve karaciğer gibi çeşitli iskemi perfüzyon hasarı modellerinde yagın

olarak koruyucu ajan olarak gösterilmesinin yanında bizim modelimizde Y-27632 doz

bağımlı bir koruma sağladı.İntestinal histolojide daha güçlü iyileşme saptanabilmesi

için daha yüksek doz ile araştırmalara yetki verilmesi gerekmektedir. Ayrıca Y-27632

uygulanma süresi, iskemi süresinde, reperfüzyon süresinde değişikliklerle yapılacak

çalışmalar ile intestinal iskemi reperfüzyon hasarında rho/rho-kinaz iletişiminin

arasındaki ilişkiyi daha net ortaya koyabilir.

Sonuçta ratlarda intestinal iskemi reperfüzyon hasarı Rho/ Rho kinaz

etkileşimi iletişimi gerektirmektedir.

50

KAYNAKLAR

1.Collard ,C.D., Gelman,S.: pathophysiology , clinical manifestations and prevention

of İschemiareperfusion injury. Anesthesiology,94,1133-1138(2001

2.Granger DN.Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischaemia-reperfusion

injury.Am L Physiol 1988;255.HI269-75 ).

3.Vural KM., öz MC.: Endothelial adhesivity, pulmonary hemodynamics and nitric

oxide synthesis in ischemia – reperfusion. Eur.J.Cardiothorac. Surg.,18,348-352

(2000

4.Toyokuni S: Reactive oxygen species-induced molecular damage and its

application in pathology.Pathol int 1999;49:91-102)

5.Wellbourn CRB, Goldman G, Paterson IS, Valeri CR, Shepro D, Hectman HB.:

Pathophysiology of ischaemia-reperfusion: central role of the neutrophil. Br J Surg

1991; 78:651-5.

6.Sward K, Dreja K, Susnjar M, Hellstrand P, Hartshorne DJ, Walsh MP. Inhibition of

Rho associated kinase blocks agonist-induced Ca2+ sensitization of myosin

phosphorylation and force in guinea-pig ileum. J. Physiol., 522: 33-49, 2000.

7.Breslin JW, Yuan SY. Involvement of Rho A and Rho kinase in neutropil-stimulated

endothelial hyperpermeability. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 286: H1057-1062,

2004.

8.Fukata Y, Amano M, Kiabuchi K. Rho-Rho-kinase Pathway in smooth muscle

contraction and cytoskeletal reorganization of non-muscle Cells. Trends Pharmacol.

Sci., 22: 32-39, 2001.

9.Yamamoto Y, Ikegaki I, Sasaki Y, Uchida T. The protein kinase inhibitor fasudil

protects against ischemic myocardial injury induced by endothelin-1 in the rabbit. J.

Cardiovasc.Pharmacol., 35:203-211, 2000.

10.Bao W, Hu E, Tao L, Boyce R, Mirabile R, Thudium DT, Ma XL, Willette RN, Yue

TL. Inhibition of Rho-kinase protects the heart against ischemia/reperfusion injury.

Cardiovasc. Res., 61, 548-558, 2004.

11. Teraishi K, Kurata H, Nakajima A, Takaoka M, Matsumura Y. Preventive effect of

Y 27632, a selective Rho-kinase inhibitor, on ischemia/reperfusion-induced acute

renal failure in rats. Eur. J. Pharmacol., 505 205-211, 2004.

12.Takeda K, Jin MB, Fujita M, Fukai M, Sakurai T, Nakayama M, Taniguchi M,

Suzuki T, Shimamura T, Furukawa H, Todo S. A novel inhibitor of Rho-associated

51

protein kinase, Y 27632, ameliorates hepatic ischemia and reperfusion injury in rats.

Surgery, 133:197-206, 2003.

13.Satoh S, Utsunomiya T, Tsurui K, Kobayashi T, Ikegaki I, Sasaki Y, Asano T.

Pharmacological profile of hydroxy fasudil as a selective rho kinase inhibitor on

ischemic brain damage. Life Sci., 69:1441-1453, 2001.

14.Yamashita K, Kotani Y, Nakajima Y, Shimazawa M, Yoshimura S, Nakashima S,

Iwama T, Hara H. Fasudil, a Rho kinase (ROCK) inhibitor, protects against ischemic

neuronal damage in vitro and in vivo by acting directly on neurons. Brain Res.,

1154:215-224, 2007.

15.Büyükafşar K, Levent A. Involvement of Rho/Rho-kinase signalling in the

contractile activity and acetylcholine release in the Mouse gastric fundus. Biochem.

Biophys. Res. Commun., 303, 771-781, 2003.

16.Şahan-Fırat, Tiftik RN, Nacak M, Büyükafşar K. Contribution of Rho-kinase in

human gallbladder contractions. Eur. J. Pharmacol., 540:162-167, 2006.

17.Büyükafşar K, Akca T, Tiftik RN, Sahan-Firat S, Aydin S. Contribution of Rho-

kinase in human gallbladder contractions. Eur. J. Pharmacol., 540:162-167, 2006.

18.Funakoshi Y, Ichiki T, Shimokawa H, Egashira K, Takeda K, Kaibuchi K, Takeya

M, Yoshimura T, Takeshita A. Rho-kinase mediates angiotensin II-induced monocyte

chemoattractant protein-1 expression in rat vascular smooth muscle cells.

Hypertension, 38: 100-104, 2001.

19.Kawamura H, Yokote K, Asaumi S, Kobayashi K, Fujimoto M, Maezawa Y, Saito

Y, Mori S. High glucose-induced upregulation of osteopontin is mediated via Rho/Rho

kinase pathway in cultured rat aortic smooth muscle cells. Arterioscler. Thromb.

Vasc. Biol., 24:276 281, 2004.

20.Hiroki J, Shimokawa H, Higashi M, Morikawa K, Kandabashi T, Kawamura N,

Kubota T, Ichiki T, Amano M, Kaibuchi K, Takeshita A.. Inflammatory stimuli

upregulate Rho-kinase in human coronary vascular smooth muscle cells. J. Mol. Cell

Cardiol., 37:537-546, 2004.

21.Büyükafşar K, Arıkan O, Ark M, Kubat H, Özveren E. Upregulation of Rho kinase

(ROCK-2) expression and enhanced contraction to endotelin-1 in the mesenteric

artery from lipopolysaccharide-treated rats. Eur. J. Pharmacol., 498: 211-217, 2004.

22.Arıncı K, Elhan A. Anatomi dolaşım sistemi (1.baskı) Güneş Kitabevi Ltd. Şti,

Ankara 1995 , syf. 68-78.

52

23.Wiesner W, Khurana B, Ji H, et al. CT of acute bowel ischemia. Radiology

2003;226:635-50

24.Arıncı K, Elhan A. Anatomi dolaşım sistemi (1.baskı) Güneş Kitabevi Ltd. Şti,

Ankara 1995 , syf. 68-78

25.Rosenblum JD, Boyle CM, Schwartz LB. The mesenteric circulation, anatomy

and physiology. Surg Clin N Am 1997; 77: 289-306.

26.Törüner A. Mezenterik vasküler hastalıklar: Sayek İ (Ed). Temel Cerrahi.

Ankara:Güneş Kitabevi, 2004: 1499-1502.

27.Valji K. Vascular İnterventional Radiology mesenteric arteries (1th ed. ) W.B.

Saunders Company , California 1999, pp.182-203

28.Wiesner W, Khurana B, Ji H, et al. CT of acute bowel ischemia. Radiology

2003;226:635-50

29.Lin E, Lowry SF, Calvano SE. The systemic response to injury. Schwartz SI (ed),

Principles of Surgery. McGraw-Hill 7th Edition 1999; Vol I: 13-32.

30.Semenza GL. Cellular and molecular dissection of reperfusion injury ROS within

and without. Circ Res, 2000; 86: 117-118.

31.Granger DN, Korthuis RJ. Physiologic mechanisms of postischemic tissue injury.

Annu Rev Physiol, 1995; 57: 311-332.

32.Grace PA. Ischaemia-reperfusion injury. Br J Surg, 1994; 81: 637-647.

33.Kuzu MA, Koksoy C, Kale IT, Tanık A, Terzi C, Elhan AH. Reperfusion injury

delays healing of intestinal anastomosis in a rat. Am J Surgery, 1998; 176: 348-351.

34.Zimmerman BJ, Granger DN. Mechanisms of reperfusion injury. Am J Med Sc,

1994; 307: 284- 292.

35.Carden DL, Granger DN. Pathophysiology of ischemia-reperfusion injury. J

Pathol, 2000; 190:255-66.

36.Davidge ST. Prostaglandin H synthase and vascular function. Circ Res, 2001;

89(8): 650-660.

37.De Rougemont O, Lehmann K, Clavien PA. Preconditioning, organ

preservation, and postconditioning to prevent ischemia-reperfusion injury to the liver.

Liver Transpl, 2009; 15(10):1172-1182.

38.Gourdin MJ, Bree B, De Kock M. The impact of ischaemia-reperfusion on the

blood vessel. Eur J Anaesthesiol, 2009; 26(7): 537-547.

39.Granger DN, Korthuis RJ. Physiologic mechanisms of postischemic tissue injury.

Annu Rev Physiol, 1995; 57: 311-332.

53

40.Latanich CA, Toledo-Pereyra LH. Searching for NF-kappaB-based treatments of

ischemia reperfusion injury. J Invest Surg, 2009; 22(4): 301-315.

41. Machado NG, Alves MG, Carvalho RA, Oliveira PJ. Mitochondrial involvement in

cardiac apoptosis during ischemia and reperfusion: can we close the box

Cardiovasc Toxicol, 2009 (baskıda).

42.McCord JM. Oxygen-derived free radicals in postischemic tissue injury. N Engl J

Med, 1985; 312:159-163.

43.Phillips L, Toledo AH, Lopez-Neblina F, Anaya-Prado R, Toledo-Pereyra LH.

Nitric oxide mechanism of protection in ischemia and reperfusion injury. J Invest

Surg, 2009; 22(1): 46-55.

44.Raat NJ, Shiva S, Gladwin MT. Effects of nitrite on modulating ROS generation

following ischemia and reperfusion. Adv Drug Deliv Rev, 2009; 61(4): 339-350.

45.Seekamp A, Ward PA. Ischemia-reperfusion injury. Agents Actions Suppl, 1993;

41: 137-52.

46.Snoeijs MG, van Heurn LE, Buurman WA. Biological modulation of renal

ischemia-reperfusion injury. Curr Opin Organ Transplant, 2009.

47.Steffens S, Montecucco F, Mach F. The inflammatory response as a target to

reduce myocardial ischaemia and reperfusion injury. Thromb Haemost, 2009;

102(2): 240-247.

48.Vanlangenakker N, Vanden Berghe T, Krysko DV, Festjens N, Vandenabeele P.

Molecular mechanisms and pathophysiology of necrotic cell death. Curr Mol Med,

2008; 8(3): 207-220.

49.Welbourn CRB, Goldman G, Peterson IS. Pathophysiology of ishemia-

reperfusion injury: central role of the neutrophil. Br J Surg, 1991; 78: 651-5.

50. McCord, JM. (1985). Oxygen-derived free radicals in postischemic tissue injury.

The New England Journal of Medicine, 312, 159-163.0

51. Parks, DA., ve Granger, DN. (1986). Contributions of ischemia and reperfusion to

mucosal lesion formation. The American Journal of Physiology, 250, 749-753.

52. Massberg, S., ve Messmer, K. (1998). The nature of ischemia/reperfusion injury.

Transplantation Proceedings, 30, 4217- 4223.

53.Cuzzocrea, S., Chatterjee, P., Mazzon, E., Dugo, L., De Sarro, A., Van de Loo,

FAJ., ve diğerleri. (2002). Role of induced nitric oxide in the initiation of the

inflammatory response after postischemic injury. Shock, 18, 169-176.

54.Cuzzocrea, S., Chatterjee, P., Mazzon, E., Dugo, L., De Sarro, A., Van de Loo,

54

FAJ., ve diğerleri. (2002). Role of induced nitric oxide in the initiation of the

inflammatory response after postischemic injury. Shock, 18, 169-176.

55.Lodato, RF., Khan, AR., Zembowicz, MJ., Weisbrodt, NW., Pressley, TA., Li, YF.

ve diğerleri. (1999). Roles of IL-1 and TNF in the decreased ileal muscle contractility

induced by lipopolysaccharide. The American Journal of Physiology, 276(6), 1356-

1362.

56.Poussios, D., Andreadou, I., Papalois, A., Rekka, E., Gavalakis, N., Aroni, K., ve

diğerleri. (2003). Protective effect of a novel antioxidant non-steroidal anti-

inflammatory agent (compound IA) on intestinal viability after acute mesenteric

ischemia and reperfusion. European Journal of Pharmacology, 465(3), 275-280.

57.Takahashi, A., Tomomasa, T., Kaneko, H., Watanabe, T., Tabata, M.,

Morikawa, H., ve diğerleri. (2001). Intestinal motility in an in vivo rat model of

intestinal ischemia-reperfusion with special reference to the effects of nitric oxide on

the motility changes. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 33(3), 283-

288

58.Turnage, RH., Guice, KS., ve Oldham, KT. (1994). Endotoxemia and remote

organ injury following intestinal reperfusion. The Journal of Surgical Research, 56,

571-578.

59.Cuzzocrea, S., Rossi, A., Serraino, I., Di Paola, R., Dugo, L., Genovese, T., ve

diğerleri. (2003). 5-Lipoxygenase knockout mice exhibit a resistance to splanchnic

artery occlusion shock. Shock, 20, 230-236.

60.Hassoun, HT., Weisbrodt, NW., Mercer, DW., Kozar, RA., Moody, FG., ve

Moore, FA. (2001). Inducible nitric oxide synthase mediates gut

ischemia/reperfusion-induced ileus only after severe insults. The Journal of

Surgical Research, 97(2), 150-154.

61.Hierholzer, C., Kalff, JC., Audolfsson, G., Billiar, TR., Tweardy, DJ., ve Bauer, AJ.

(1999). Molecular and functional contractile sequelae of rat intestinal

ischemia/reperfusion injury. Transplantation, 68(9), 1244-1254.

62.Takahashi, A., Tomomasa, T., Kaneko, H., Watanabe, T., Tabata, M.,

Morikawa, H., ve diğerleri. (2001). Intestinal motility in an in vivo rat model of

intestinal ischemia-reperfusion with special reference to the effects of nitric oxide on

the motility changes. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 33(3), 283-

288.

55

63.Takahashi, A., Tomomasa, T., Kaneko, H., Watanabe, T., Tabata, M.,

Morikawa, H., ve diğerleri. (2001). Intestinal motility in an in vivo rat model of

intestinal ischemia-reperfusion with special reference to the effects of nitric oxide on

the motility changes. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 33(3), 283-

288.)

64.Okatani, Y., Wakatsuki, A., Reiter, RJ., Enzan, H., ve Miyahara, Y. (2003).

Protective effect of melatonin against mitochondrial injury induced by ischemia and

reperfusion of rat liver. European Journal of Pharmacology, 469(1-3), 145-152.

65.Hernandez, LA., Grisham, MB., Twohig, B., Arfors, KE., Harlan, JM., ve Granger,

DN. (1987). Role of neutrophils in ischemia- reperfusion-induced microvascular

injury. The American Journal of Physiology, 253(3), 699-703.

66.Sisley, AC., Desai, T., Harig, JM., ve Gewertz, BL. (1994). Neutrophil

depletion attenuates human intestinal reperfusion injury. The Journal of Surgical

Research, 57(1), 192-196.

67. Kurose, I., Anderson, DC., Miyasaka, M., Tamatani, T., Paulson, JC., Todd,

RF., ve diğerleri. (1994). Molecular determinants of reperfusion-induced leukocyte

adhesion and vascular protein leakage. Circulation Research, 74(2), 336-343.

68.Xia, G., Martin, AE., ve Besner, GE. (2003). Heparin-binding EGF-like growth

factor downregulates expression of adhesion molecules and infiltration of

inflammatory cells after intestinal ischemia/reperfusion injury. Journal of Pediatric

Surgery, 38(3), 434-439.

69.Grace, PA. (1994). Ischaemia-reperfusion injury. The British Journal of

Surgery, 81, 637-647.

70.Amano M, Fukata Y, Kaibuchi K. Regulation and function of Rho-associated

kinase. Exp Cell Res, 2000; 261: 44-51.

71.Barman SA, Zhu S, White RE. RhoA/Rho-kinase signaling: a therapeutic target in

pulmonary hypertension. Vasc Health Risk Manag. 2009;5:663-71. Epub 2009 Aug

20.

72.Boettner B, Van Aelst L. The role of Rho GTPases in disease development. Gene,

2002; 286: 155-174.

56

73.Calò LA, Pessina AC. RhoA/Rho-kinase pathway: much more than just a

modulation of vascular tone. Evidence from studies in humans. J Hypertens, 2007;

25(2): 259-264.

74.Dhanasekaran N, Dermott JM. Signaling by the G12 class of G proteins. Cell

Signal, 1996; 8:235-245.

75.Fukata Y, Amano M and Kaubuchi K. Rho-Rho-kinase pathway in smooth muscle

contraction and cytoskeletal reorganization of non-muscle cells. Trends Pharmacol

Sci, 2001; 22(1): 32-39.

76.Hirano K. Current topics in the regulatory mechanism underlying the Ca+2

sensitization of the contractile apparatus in vascular smooth muscle. J Pharmacol

Sci, 2007; (104): 109-115.

77.Kume H. RhoA/Rho-kinase as a therapeutic target in asthma. Curr Med Chem,

2008;15(27): 2876-2885.

78.Lee DL, Webb RC, Jin L. Hypertension and RhoA/Rho-kinase signaling in

the vasculature: highlights from the recent literature. Hypertension, 2004; 44(6): 796-

769.

79.Liao JK, Seto M, Noma K. Rho kinase (ROCK) inhibitors. J Cardiovasc

Pharmacol, 2007; 50(1): 17-24.

80.Lo Grasso PV, Feng Y. Rho kinase (ROCK) inhibitors and their application

to inflammatory disorders. Curr Top Med Chem, 2009; 9(8): 704-723.

81.Loirand G, Guilluy C, Pacaud P. Regulation of Rho proteins by

phosphorylation in the cardiovascular system. Trends Cardiovasc Med, 2006; 16(6):

199-204

82.Nobes C, Hall A. Regulation and function of the Rho subfamily of small GTPases.

Curr Opin Genet Dev, 1994; 4: 77-81.

83.Noma K, Oyama N, Liao JK. Physiological role of ROCKs in the cardiovascular

system. Am J Physiol Cell Physiol., 2006; 290(3): C661-C668.

57

84.Puetz S, Lubomirov LT, Pfitzer G. Regulation of smooth muscle contraction by

small GTPases. Physiology, 2009; 24: 342-356.

85.Rikitake Y, Liao JK. Rho GTPases, statins, and nitric oxide. Circ Res, 2005;

97(12): 1232-1235.

86.Seasholtz TM, Brown JH. Rho signalling in vascular diseases. Mol Interv, 2004;

4(6): 348-357.

87.Shimokawa H, Takeshita A. Rho-kinase is an important therapeutic target in

cardiovascular medicine. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2005; 25: 1767-1775.

88.Somlyo AP, Somlyo AV. Signal transduction by G-proteins, rho-kinase and protein

phosphatase to smooth muscle and non-muscle myosin II. J Physiol, 2000; 15: 177-

185.

89.Somlyo AV. New roads leading to Ca2+ sensitization. Circ Res, 2002; 91: 83-84.

90.Takai Y, Sasaki T, Matozaki T. Small GTP-binding proteins. Physiol Rev, 2001;

81: 153-208.

91.Zhou Q, Liao JK. Rho kinase: an important mediator of atherosclerosis and

vascular disease. Curr Pharm Des, 2009; 15(27): 3108-3115.

92.Casey PJ, Seabra MC. Protein prenyl transferases. J Biol Chem 1996;

271:5289-5292.

93.Olofsson B. Rho guanine dissociation inhibitors: pivotal molecules in cell

signaling. Cell Signal 1999; 11:545-554.

94.Casey PJ, Seabra MC. Protein prenyl transferases. J Biol Chem 1996;

271:5289-5292.

95.Olofsson B. Rho guanine dissociation inhibitors: pivotal molecules in cell

signaling. Cell Signal 1999; 11:545-554.

96.Somlyo AV. New roads leading to Ca2+ sensitization. Circ Res 2002;91:83-

84.

97.Radomski MW, Palmer RM, Moncada S. Endogenous nitric oxide inhibits human

platelet adhesion to vascular endothelium. Lancet. 1987;2:1057-1058.

98.Garg U, Hassid A. Nitric oxide-generating vasodilatators and 8- bromocyclic

guanosine monophosphate inhibits mitogenesis and proliferation of cultured rat

58

vascular smooth muscle cells. J Clin Invest. 1989;83:1774-1777.

99.Payne D, Kubes P. Nitric oxide donors reduce the rise in reperfusion induced

intestinal mucosal permeability. Am J Physiol. 1993;265:189-195.

100.Armitage ME, Wingler K, Schmidt HH, La M. Translating the oxidative stress

hypothesis into the clinic: NOX versus NOS. J Mol Med, 2009

101.Bloodsworth A, O'Donnell VB, Freeman BA. Nitric oxide regulation of free

radical- and enzyme- mediated lipid and lipoprotein oxidation. Arterioscler Thromb

Vasc Biol, 2000; 20: 1707-1715.

102.Esposito E, Cuzzocrea S. Superoxide, NO, peroxynitrite and PARP in

circulatory shock and inflammation. Front Biosci, 2009; 14: 263-296.

103.Hogg N, Kalyanaraman B. Nitric oxide and lipid peroxidation. Biochim Biophys

Acta, 1993; 1411:378-384.

104.Yagi K. Lipid peroxides and related radicals in clinical medicine. In: D. Armstrong

(eds). Free Radicals in Diagnostic Medicine. Plenum Press, New York: 1994: 1-15.

105.Golowich SP, Kaplan SD. Methods in enzymology. Vol. II. New York: Academic

Press, 1955; 769.

59

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

ATP : Adenozin Trifosfat

AMP : Adenozin Monofosfat

Ca : Kalsyum

COX : SİKLooksijenaz

eNOS : Endoteliyal Nitrik Oksit Sentaz

GDP : Guanin Difosfat

GTP : Guanin Trifosfat

H-E : Hematoksilen-Eozin

ICAM- : İntraselüler Adezyon Molekülü-1

İ/R: : İskemi Reperfüzyon

İMA :İnferiyor mezenterik arter

İMV :İnferior Mezenterik Ven

LT : Lökotrien

LPA : Lizofosfatidik Asid

MHZ : Miyozin Hafif Zincir

MPO : Miyeloperoksidaz

MDA : Malondialdehid

LTB4 : Lökotrien B4

NF-κB : Nükleer Faktör-κB

NO : Nitrik Oksit

PAİ: :Plazminojen Aktivatör İnhibitör-1

PG :Prostaglandin

PMNL : Polimorfonükleer Lökositler

SMA : Superior Mezenter Arter

SMV : Superior Mezenter Ven

SOD : Serbest Oksijen Radikali

TEF :Trombosit Etkinleştirici Faktör

TNF : Tümör Nekroze Edici Faktör

Y-27632 :Trans-4-[(1R)-1-Aminoetil]-N-4-Piridinilsiklohekzankarboksamit

Dihidroklorit

ZIPK : Zipper İnteracting Protein Kinase

60

ŞEKİLLER ve Resimler Dizini

Şekil-1 Çölyak trunkus ve dalları 10

Şekil-2 Superior mezenter arter 11

Şekil-3 İnferior mezenterik arter 12

Şekil-4: SMA ve İMA arasındaki kollateraller 13

Şekil-5. İ/R'ye maruz kalan postkapiler venüllerde gözlenen inflamatuvar 17

yanıtları açıklayan endotele bağımlı mekanizmalar.

Şekil-6 Hipoksi sırasında hücre içinde ATP derişiminin azalması ile

19

ilgili olarak hücre metabolizması, iyonik denge ve yapısal proteinlerde

ortaya çıkan değişiklikler.

Şekil-7 Rho ailesi GTPazların aktivasyonu 24

Şekil-8. Düz kas kasılmasının düzenlenmesinde Rho/Rho-kinaz 26

sinyal ileti yolunun rolü

Şekil-9: Serum MDA düzyi ile ilgili grafik

36

Şekil-10 Serum MPO düzyi ile ilgili grafik 37

Şekil-11 Serum Nitrit-Nitrat seviyeleri ile ilgili grafik 38

Şekil-12: Doku MDA düzyleri ile ilgili grafik 39

Şekil-13. Doku MPO düzeyleri ile ilgili grafik 40

Şekil-14. Doku nitrit nitrat seviyesi ile ilgili grafik 40

Şekil-15 mRNA ekspresyon düzeyi ile ilgili grafik 41

Şekil-16: Serum ROCK Aktivitesi ile ilgili grafik 42

Şekil-17: Chiu sınıflamasına göre gruplara ait grafik 42

Resim-1: A:Sma Diseksyonu , B : Sma Klemplenmesi,

C: Kontrol Grubu D: İskemi Reperfzüyon Grubu

30

Resim-2: Deneklerde Elde Edlilen İleal Dokunun Işık Mikroskobi Bulguları 43

61

Tablolar Dizini

Tablo-1: Rho kinazın substratları 22

Tablo-2: Deney grupları 29

Tablo-3: Çalışma gruplarıa ait doku ve serum mpo,mda,nitrit-nitrat, 44

patoloji, mrna ekspresyonuna ait OrtalamaStandart Sapma (Min-Max) değerleri ve p değerleri