Ratlarda renal iskemi reperfüzyon hasarında profilaktik ... · ve dünyada birçok Ozon terapi merkezinde . Ratlarda renal iskemi reperfüzyon hasarında profilaktik ozon uygulamasının

BAŞKENT

ÜNİVERSİTESİ

BAŞKENT ÜNİVERSİTESİ

Ratlarda Renal İskemi Reperfüzyon Hasarında Profilaktik Ozon

Uygulamasının Etkileri

Dr. Öznur Kal

Başkent Üniversitesi Konya Hastanesi, Nefroloji BD.


• Böbrek transplantasyonunda iskemi reperfüzyon hasarına bağlı gelişen akut böbrek hasarı ve akut böbrek rejeksiyonunun insidansı hastanede yatan hastalarda 2% ile 7% dir.


• Klinik olarak 30% ile 70% e kadar ulaşan mortalite hızına sahiptir.

• Hsu CY et. al., Nonrecovery of kidney function and death after acute on chronic renal failure. Clin J Am Soc Nephrol. 2009;4(5):891-98.


• Ozon ilk olarak 1. Dünya savaşı sırasında Alman fizikçi Dr. Albert Wollf tarafından lokal cerrahi işlemlerde enfeksiyona karşı koruyucu olarak kullanıldı.


• Ayrıca iskemi, inflamasyon, basınç yaraları, DM, periferik vasküler hastalıklar, inme ve diğerlerinde kullanılarak koruyucu etkileri gösterildi.


• Ancak küçük dozlarda antioksidan ozon terapisinin endojen sistemi stümüle ettiği gösterildikten sonra çalışmalar bu yönde ilerlemeye başladı.


• Ozon tedavisinin serebrovasküler iskemi, kronik ülser, arteriosclerozis obliterans, immün yetmezlik, hepatik yağlanma, kalp ve kc iskemisinde faydaları deneysel ve klinik çalışmalarla gösterilmiştir.


• Ozon immün sistem için modulatör olarak bilinmekte ve (0xygen+ Ozon) 97%+ 3% karışımı şeklinde kullanılmaktadır.

• Tedavi edici olarak da yine bu oranda kullanılmaktadır.

• İntramüsküler, subcutan, ve intraarticüler uygulanabilmekte ve lokal irrigasyon yapabilmektedir.

• Uygulamadan hemen sonra plazmaya hızla geçebilir.

• DiFilipoet.al.,Intraperitoneal oxygen/ozone treatment decreases the formation ofexperimental postsurgical peritonealadhesions and the levels/activity of

the local ubiquitin-proteasome system. Mediators Inflamm 2011;2011:606718


• Literatürde böbrekte iskemi reperfüzyon hasarında ozon terapisi ile ilgili çok az sayıda çalışma olması nedeniyle bu çalışmayı planladık.

• Oztosun M et. al. The effects of medical ozone therapy on renal ischemia/reperfusion injury. Ren Fail.2012;34(7):921-5.

• Caliskan B et. al.,Ozone therapy prevents renal inflammation and fibrosis in a rat model of acute pyelonephritis. Scand J Clin Lab Invest. 2011;71:473–480.

• Demirbag S, et. al., Effects of medical ozone therapy on acetaminophen-induced nephrotoxicity in rats. Ren Fail. 2010;32:493–497.


Materyal Metod:

• Bu çalışma Selçuk Üniversitesi Hayvan Etik Kurulundan alınan onay ile planlandı ve Selçuk Üniversitesi deney hayvanları laboratuvarında yapıldı.

• 250-300 gr ağırlığında 27 adet dişi Wistar rat kullanıldı.


• Hayvanlar rastgele 4 gruba ayrıldı.

• Ratların sayısı önceki referans makalelerde belirtildiği şekilde belirlendi.





• 1. Grup (N:6) Sham grubu: SF ip olarak 7 gün boyunca verildikten sonra 8. Gün sol renal pedikül orta hat insizyon ve laparotomiyi takiben ayrıldı.

• Ancak IR hasarı oluşturulmadı.

• 8.gün intrakardiyak kan alınarak sakrifiye edildi.


• 2. grup (n:7) Ozon grubu: Ozon/Oxygen gaz karışımı (97%/ 3%) 1 mg/kg/gün dozunda 7 gün boyunca ip olarak verildi.

• 8. gün sol renal pedikül laparotomi sonrası ayrıldı.

• IR hasarı oluşturulmadan 8. gün sakrifiye edildi.


• 3. Grup (n:7) İskemi reperfüzyon grubu: Hayvanlara Ozon veya SF verilmeden 8. gün İskemi reperfüzyon hasarı oluşturuldu.


• 4. grup (n:7) (Ozon+ IR): 1 mg/kg/gün ip Ozon 7 gün boyunca verildi.

• 8. gün iskemi reperfüzyon hasarı oluşturuldu.


Ozon gazı elde edilmesi:

• Ozon makinesi (Humazon promedic humaen gmbH, Germany) tarafından üretildi.



• Her hayvana verilen ozon miktarı yaklaşık 3,5-4,5 ml arasındaydı.

• İlk doz Ozon uygulaması, iskemi reperfüzyon hasarı (IR) oluşturulmadan 7 gün önce kullanıldı.

• Toplamda her hayvan için 7 doz, 1mg/kg Ozon uygulandı.

• Ozon uygulamasının şekli, dozu, referans makalelere göre belirlendi.

O. Merin et. al., Ozone administration reduces reperfusion injury in an isolated rat heart model,” Journal of Cardiac Surgery. vol. 22, no. 4, pp. 339–342, 2007.

S. Ekici, et. al.,Comparison of melatonin and ozone in the prevention of reperfusion injury following unilateral testicular torsion in rats. Urology, vol. 80, no. 4, pp. 899–906, 2012.

Oztosun M et. al. The effects of medical ozone therapy on renal ischemia/reperfusion injury. Ren Fail.2012;34(7):921-5.


İskemi reperfüzyon modeli:• Sağ ve sol renal pediküller orta hat insizyon ve laparotomi sonrası

ortaya çıkarıldı. • Sol renal pedikül, arter, ven klemplendi ve oklüde edildi. (Bulldag

arter klamp; Harvard apparatus , Holliston,MA,USA)• İskemi, pulsasyonun olmaması, böbreklerde nabız olmaması ve

böbreklerde renk değişimi ile teyit edildi. • 1 saatlik iskemik periyod sonrası mikrovasküler klemp açıldı ve

reperfüzyon sağlandı. • Böbreklerin restorasyonu inspeksiyonla teyit edildi.• 2 saatlik reperfüzyon sürecinden sonra, hayvanlar intrakardiyak kan

alınarak sakrifiye edildi.




• İntrakardiyak alınan kandan TAC (Total Antioksidan Capacity) ve TOS (Total Oxidan Status) bakıldı.

• Ayrıca böbrek dokusunda SOD (Superoxide dismutase), GSH-Px ( Glutathione peroxidase), MDA (Malondyaldehide) bakıldı.

• Çıkarılan sol böbrekten histopatolojik değerlendirme yapıldı.


Renal dokuların histomorfolojik incelenmesi:

• Çıkarılan sol böbrek bütün hayvanlarda histopatolojik inceleme için hazırlandı. Renal dokular formol solüsyonu içinde fixe edildi. Oda sıcaklığında ve parafin blokla kaplandı.

• Parafin kaplı dokular 4 µm kalınlığında kesitlere ayrıldı, polylisin kaplı slideslara yayıldı ve (H&E ) hematoksilen eozin ile boyandı.


• Renal doku kesitleri önce ışık mikroskobi kesitiyle bir patolog tarafından kör olarak incelendi.

• Proksimal tüplerdeki strüktürel değişiklikler (tübüler atrofi, tübüler kenar kaybı, vacualizasyon, tübüler dilatasyon, cast formasyonu ) mononücleer hücre infiltrasyonu, interstisyel yapısal değişiklikler, renal korpuskul morfoloji, nekrotik ve apopitotik hücreler incelendi.

• Kesit görüntüleri tübülointersitsiyel hasar açısından semikantitatif olarak değerlendirildi ve 0-yok, 1- hafif, 2-orta, 3-şiddetli hasar şeklinde skorlandı.


• Total histopatolojik hasar skoru tüm skorların toplamıyla elde edildi.


• Renal dokulardaki apopitozis oranını tespit için insitu TUNEL (terminal deoxynucleotidil transferaz dUTP nick and labeling) testi kullanıldı ve kabul edilen bir apopitozis markerı olarak (incitu cell death POD, Roche) bir histolog tarafından değerlendirildi.

• Apopitotic index (AI): Total apopitotic hücre ölçümü/100 ile hesaplanmıştır.

C. Uyuyan Howard, Unbased stereology, PP:20,BIOS scientific publishers,1998.


İmmünohistokimyasal metod

• Böbrek dokuları % 10 luk buffered formaldehit solüsyonuna rutin histolojik işlemlerden sonra alındı, parafin kaplı böbrek dokusu 3 µm kalınlığında kesitler halinde microtom yardımıyla kesildi.

• Daha sonra bir rat spesifik monoclonal antibody (RB-10287-r7 Lab vision) anticaspase 3 immünreaksiyonu göstermek için kullanıldı.


Figure 1.TUNEL ile Apopitotik hücre işaretleme A (Kontrol Grubu, DAPI), B (Kontrol Grubu, TUNEL): Çok az sayıda apopitotik hücre görüldü(beyaz ok başları). C (Ozon Grubu, DAPI), D (Ozon Grubu, TUNEL): Kontrol Grubuna göre biraz daha fazla sayıda apopitotik hücre görüldü (beyaz ok başları).


Figure 2.TUNEL ile Apopitotik hücre işaretleme A (İskemi Reperfüzyon Grubu, DAPI), B (İskemi Reperfüzyon Grubu, TUNEL): Oldukça fazla sayıda apopitotik hücre görüldü (beyaz ok başları). C (Ozon+ İskemi Reperfüzyon Grubu, DAPI), D (Ozon+ İskemi Reperfüzyon Grubu TUNEL): İskemi Reperfüzyon grubundan daha az, Ozon Grubundan daha fazla apopitotik hücre görüldü (beyaz ok başları).


Biyokimyasal analizler: • Böbrekteki biyokimyasal analizler için renal

dokular soğuk salin solüsyonunda 2 kez yıkandı ve -80 derece de derin dondurucuda muhafaza edildi.

• Frozen flep dokular phosfat tamponu (ph:7,4) ile bir buz küpü içinde homojenize edildi, santrifuj edildi ve analiz edildi.

• Bu dokuların protein konsantrasyonu Lowry metodu kullanılarak ayrıştırıldı.

• Daha sonra SOD,GSH-Px, MDA ölçümleri renal dokularda yapıldı.


• Kandaki biyokimyasal incelemeler ise alınan intrakardiyak kan örneklerinden (2 ml) TAC ve TOS ölçümleri yapılarak tamamlandı.


İstatistiksel Analiz• SPSS 15 (SPSS Inc. IL,USA) for Windows

kullanılarak yapıldı. Sonuçlar ortalama+/-Standard deviasyon kullanılarak hesaplandı. Çalışma grupları arasındaki patolojik bulgulardaki farklılıklar Kruskal-Wallis testi kullanılarak analiz edildi.

• İstatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gözlenirse çift yönlü kıyaslamalar Mann-Whitney U testi kullanılarak yapıldı.

• P değeri <0.005 olarak anlamlı kabul edildi.


Histopatolojik Sonuçlar

• Toplam hücre hasarı açısından değerlendirildiğinde 4 grup arasında anlamlı fark vardı (p<0,001).

• Çift yönlü analizlerde toplam skor en yüksek IR grubunda en düşük ise Ozon grubunda idi.

• Ozon+ IR grubunda ise IR grubuna göre anlamlı azalma vardı. (p=0,002).


Apopitotik Hücre İndeksleri

• Kontrol Grubu: % 2,21

• İskemi Reperfüzyon Grubu: %20,70

• Ozon Grubu: % 5,08

• Ozon+ İskemi Reperfüzyon Grubu: %10,58

• Apopitotik hücre indeksleri açısından 4 grup arasında anlamlı fark var (p<0,001).


Biyokimyasal Sonuçlar• Biyokimyasal sonuçlar açısından 4 grup arasında anlamlı

olarak fark vardı (P<0.0001)

• Antioksidan parametreler olan SOD, GSH-PX, TAC değerleri açısından bakıldığında ozon grubunda artış en yüksek, IR grubunda ise en düşüktü ve gruplar arasında anlamlı fark vardı (p<0,005). Grup 2> Grup 1> Grup4> Grup 3

• Oksidan parametreler olan MDA ve TOS açısından, IR grubunda en yüksek artış ve Ozon grubunda ise düşme tespit edildi. (p<0,005)Grup 2< Grup1< Grup 4< Grup3


Tartışma:

• Renal iskemi reperfüzyon hasarı akut böbrek hasarlarının en önemli sebebidir.

• Yüksek mortalite ve morbiditeye sahiptir.

• Renal I/R hasarı konusunda bazı çalışmalar yapılmıştır ama hala etkili bir tedavi stratejisi geliştirilememiştir.

• Wen, X., et. al., Pathophysiology of acute kidney injury: a new perspective. Contrib. Nephrol. 2010. 165, 39-45.

• Wang, Z., et. al., Protective effects of aliskiren on ischemia-reperfusion induced renal injury in rats. Eur. J. Pharmacol. 2013.718:160-166.


• Oksidatif stres, iskemi reperfüzyon hasarını tetikleyen en önemli mekanizmadır.

• Serbest oksijen radikallerine bağlı olarak gelişir ve iskemi sonrası reperfüze olan dokuda ortaya çıkar.

• Doku hasarı hücre membranındaki lipid, protein, nükleik asitlerine bağlanarak ve peroksidasyona yol açarak meydana gelir.


• Düşük dozlarda (%3) Ozon oksidatif preconditioningi teşvik edebilir ve bu da endojen antioksidan sistemi aktive eder.

. Hücrenin redox durumunun korunmasını

sağlar.


• Yine Ozon+ IR grubunda apoptozisin IR grubuna göre anlamlı olarak azaldığını gördük. (p< 0,005)

• Bizim sonuçlarımıza göre , Ozon tek başına veya kombinasyon halinde kullanıldığında IR hasarında anlamlı olarak MNC infiltrasyonunu, glomerülotübüler değişiklikleri ve total hasar skorunu düşürmektedir.


• Bir oksidatif stres markerı olan lipid peroksidasyonunun belirteci olan MDA, IR grubunda en yüksek bulunurken Ozon+ IR grubunda azalmış olarak bulundu.

• Plasma TOS seviyeleri IR grubunda anlamlı olarak en yüksek iken (p<0,005) Ozon+ IR grubunda anlamlı olarak düştü. (p<0,005)


• Antioksidan enzimler SOD ve GSH-Px aktiviteleri de Ozon grubunda en yüksek bulundu.

• Hayvanlarda Ozona bağlı olarak Ozon ve Ozon+ IR gruplarında diğer gruplara göre renal antioksidan defans sistemlerinin artışına bağlı plasma TAC seviyelerinde anlamlı bir yükselme tespit ettik.

• Bu da Ozon uygulamasının, Renal IR hasarını antioksidan etkisiyle önlediğini göstermektedir.


• Renal iskemi reperfüzyon hasarının eşlik ettiği renal transplantasyonun hala çözülemeyen klinik problemleri vardır.

• Bu çalışmada IR hasarı renal transplantasyon işlemine yakın kullanıldı ve etik prensipler nedeniyle insanlarda uygulanamayan bir akut böbrek hasarı modeli çalışıldı.


• Ozonun pozitif etkilerinin mekanizması henüz tam olarak anlaşılamamış olsa da, çeşitli mekanizmalar aydınlatılmıştır.

• Bunlara göre en önemli faktör hücresel antioksidan enzim aktivitesinin upregülasyonu ve reaktif oksijen radikallerinin down regülasyonudur.

• Bocci et. al., Ozone as Janus: this controversial gas can be either toxic or medically useful. Mediators Inflamm 2004.13:3–11


• Bizim çalışmamızda 7 gün boyunca Ozon/ oxygen karışımı vermenin, bizden önce yapılmış çalışmalarla hem biyokimyasal hemde histopatolojik sonuçları ile paralel olduğu görülmüştür.





• Çalışmamızda oksidatif stres ve lipid peroksidasyonu belirteci olan MDA renal IR hasarı oluşturulmuş ratlarda artmıştır.

• Antioksidan enzimlerin (SOD ve GSH-Px) aktiviteleri de Ozon uygulanan gruplarda (Ozon grubu ve Ozon+ IR grubu) artmıştır.


• Klinik kullanımda ; kc, böbrek, göz ya da kompozit doku transplantasyonunda transplantasyon protokolüne ozon ilavesi yapılması, IR hasarından koruyucu olabilir.

• Her ne kadar insanlarda Ozon kullanımı tedavi sınırları için de kabul edilmese de ülkemizde ve dünyada birçok Ozon terapi merkezinde yaygın olarak kullanılmaktadır.


Çalışmanın Kısıtlılıkları

• Bu çalışmanın en önemli sınırlayıcı özelliği Ozonun IR hasarından önce verilmesidir. Ancak planlı bir organ transplantasyonunda bu sınırlayıcı bir özellik olarak görülmeyebilir. Yine de Ozon hem IR hasarından önce (preconditioning) hem de sonra (postconditioning) verilse idi ve bu 2 grubu birbiriyle karşılaştırabilseydik daha değerli bir çalışma olurdu.


• İkinci sınırlayıcı özellik ise hayvanların metabolik tabloları hakkında çok fikir sahibi olma fırsatımızın olmamasıdır.

• Özellikle böbrek hasarının iyi dökümente edilmiş biomarkerı kreatin klirensi ve idrar microproteini düzeylerine bu çalışmada bakılamadı.


Sonuç:• Ozon tedavisinin farklı klinik tablolarda yararlı etkileri

gösterilmiştir.

• Bizim bu çalışmadaki sonuçlarımız ozon terapisinin böbreklerdeki iskemi-reperfüzyon hasarına karşı koruyucu ve önleyici etkisinin olabileceğini, doku hasarını azaltabilceğini ve rat modelindeki endojen antioksidan sistemi arttırabileceğini gösterdi.

• Ancak insanlardaki kullanımı açısından daha ileri çalışmalar Ozonun IR hasarından koruyucu ve önleyici etkisini işaret etmesi açısından gereklidir.


Documents

Ratlarda renal iskemi reperfüzyon hasarında profilaktik ... · ve dünyada birçok Ozon terapi merkezinde . Ratlarda renal iskemi reperfüzyon hasarında profilaktik ozon uygulamasının