Guia de Problemas de Enzimologia y Cinetica Enzimatica

8/12/2019 Guia de Problemas de Enzimologia y Cinetica Enzimatica

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CTEDRA: BIOQUMICACarreras: FarmaciaProfesorado en QumicaLicenciatura en QumicaLicenciatura en Alimentos

ENZIMOLOGA Y CINTICA ENZIMTICA

Definiciones ti les Unidad de enzima (U): cantidad de enzima que cataliza la conversin de 1

mol de sustrato en producto(s) en 1 minuto de reaccin, bajo condic ionespreviamente determinadas.

Actividad enzimt ica o concentracin de enzima: unidades de enzima porml de solucin. (U/ml)

Actividad especf ica (U/mg): act iv idad enzimt ica (U/ml)/concentracin deprotenas (mg/ml) de la solucin.

ndice de recambio (min-1

s-1

):a) nmero de moles de sustrato transformados por minuto por mol deenzima (actividad molar molecular).

b) si es una enzima con n subunidades, cada una con un sitio activo, es elnmero de moles de sustrato transformados por minuto por mol desubunidad activa o centro cataltico (actividad de centro cataltico)

Ciclo cataltico (min s): t iempo que transcurre un ciclo cataltico. Katal: cantidad de enzima que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato

en producto (s) en 1 segundo. Act ividad especfica: katal/kg de protena.

Para resolucin de tablas de pur ificacin:.Actividad total: Actividad enzimtica x vo lumen total..Protenas totales: Concentracin de protenas x volumen total..Rendimiento parcial (%): (Activ idad total etapa/Actividad total etapa anterior) x100..Rendimiento to tal (%): (Actividad total etapa/Actividad total pr imera etapa) x 100..Puri ficacin parcial: Actividad especfica etapa/ Act ividad especfica etapa ante-rior..Purificacin total: Actividad especfica etapa/ Actividad especfica primera etapa.

ENZIMOLOGA:

PROBLEMAS:

1- Sea la reaccin A+B AB. Concentraciones iniciales de A y de B de 1 mM y 2 mMrespectivamente llegan al equilibrio despus de 45 horas de incubacin. Lasconcentraciones en el equilibrio son [A]= 0,5mM, [B]=1,5 mM y [AB]=0,5 mM. Enpresencia de una enzima adecuada el equilibrio se alcanza en un minuto. Cualessern las concentraciones alcanzadas en este caso? Cul es el valor de la Keq enambos casos?

2- Un extracto libre de clulas de Escherichia coli contiene 24 mg de protena por

mililitro. Veinte microlitros de este extracto en un volumen de incubacin patrn de 0,2ml catalizaron la incorporacin de la glucosa-14C al glucgeno con una velocidad de 1,6


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nmoles/min. Calcular la actividad expresada (U/ml) y la actividad especfica (U/mg) enla cubeta y en la muestra.

3- Un extracto crudo libre de clulas contiene 20 mg de protena por mililitro. Diez mi-crolitros de este extracto en un volumen de reaccin total de 0,5 ml catalizaron la for-

macin de 30 nmoles de producto en un minuto en condiciones de ensayo ptimas (pHy fuerza inica, concentraciones saturantes de todos los sustratos, coenzimas, activa-dores y otros). (a) Expresar la velocidad inicial v ien mM/min. (b) Cul ser visi losmismos 10 l del extracto se ensayaran en un volumen total de 1,0 ml? (c) Cul es laconcentracin de enzima en la mezcla de ensayo y en el extracto (en U/ml)? (d) Cules la actividad especfica de la preparacin?

4- Quince microlitros de la preparacin de una enzima catalizaron la produccin de 0,52moles de producto en un minuto en condiciones ptimas en un ensayo patrn (a)Cunto producto se producir en un minuto por 150 microlitros de la preparacin enlas mismas condiciones de reaccin? (b) Cunto tiempo necesitarn los 150 microli-

tros de la preparacin para producir 0,52 micromoles de producto en las mismas condi-ciones de ensayo?

5- Una enzima pura tiene una actividad especfica de 120 unidades/mg de protena.(a) Calcular el ndice de recambio si el PM= 360000. (b) Calcular el tiempo requeridopara un ciclo cataltico.

6- Un microgramo de una enzima pura (PM= 92000) cataliz una reaccin a la veloci-dad de 0,5 moles/min en condiciones ptimas. Calcular (a) la actividad especfica dela enzima expresada en U/mg de protena y en U/mol, (b) el ndice de recambio y (c)cunto tiempo dura un ciclo cataltico?

7- Una preparacin comercial de enzima tiene una actividad especfica de 42 U/mg deprotena y contiene 12 mg de protena por mililitro. Para corroborar estos datos unoperador ensaya una medida de actividad de la enzima en un medio de reaccin de 1ml. El mtodo utiliza una concentracin de sustrato en el medio de 30 mM y un tiempomnimo de lectura de 1 min. El volumen mnimo de la preparacin enzimtica que sepuede utilizar es de 5 l. (a) Puede el operador hacer el ensayo o debe dilurpreviamente la preparacin? (b) En caso de que deba dilur y suponiendo que laenzima se descompone si lo hace, qu actitud debera tomar el operador?

8- Las -lactamasas son enzimas capaces de hidrolizar la penicilina segn la reaccin:penicilina + H2O cido peniciloico.Esta reaccin puede estudiarse monitoreando el descenso de absorbancia a 230 nm(coeficiente de absorcin = 1,09 mM-1cm-1). Se determina la actividad de -lactamasaen una muestra cuya concentracin de protena es de 20 g/ml empleando penicilina aconcentracin saturante (1mM) en amortiguador de pH 7 y t =30C, observndose unadiferencia en la absorbancia de 0,3 para un tiempo de 100 segundos. El volumen finalen la cubeta de reaccin es 2 ml, el camino ptico 1 cm y el volumen de muestraempleado es 15 l. Cules son la actividad en U/ml y la actividad especfica de lamuestra?

9- La actividad de una muestra de lctico deshidrogenasa (LDH) pura con unaconcentracin de protena de 2 mg/ml se ensay por un mtodo discontnuo (aparicinde piruvato). Diez microlitros de la muestra se incubaron con concentraciones


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saturantes de lactato y NAD+ en un volumen final de 3 ml. Luego de 3 minutos lareaccin se detuvo por la adicin de 0,5 ml de DNFH (reactivo de color). Despus de10 minutos se agregaron 1,5 ml de NaOH 0,4 N y se midi la absorbancia de lahidrazona formada a 505 nm. Se obtuvo una variacin de absorbancia de 0,6. Pararealizar la curva de calibracin de la reaccin del piruvato con la DNFH se trabaj en

idnticas condiciones utilizando una solucin de cido pirvico (PM= 88) conteniendo4,4 mg/ml. Los valores obtenidos se muestran en la tabla. Calcule el nmero derecambio de la LDH considerando que el PM de la enzima es 130000 y que posee dossitios activos por molcula.

ml de testigo 0,00 0,05 0,10 0,20 0,30 0,40absorbancia 0,05 0,15 0,25 0,44 0,66 0,85

10- Cincuenta mililitros de un extracto libre de clulas que contenan 24 mg de protenapor ml del mismo y cuya actividad era de 0,08 U/ml se fraccionaron por precipitacincon sulfato amnico. La fraccin que precipitaba entre el 30% y 50% de saturacin seredisolvi en un volumen total de 10 ml y se dializ. La disolucin despus de la dilisisocupaba 12 ml y contena 30 mg de protena por ml. Veinte microlitros de la fraccinpurificada catalizaron la reaccin de la fosforilasa con una velocidad de 5,9nnmoles/minuto en condiciones de un ensayo patrn. Calcular (a) la recuperacin de laenzima y (b) el grado de purificacin obtenido mediante la etapa del sulfato amnico.

11- Un extracto crudo libre de clulas de msculo esqueltico contiene 32 mg de pro-tena por ml. Diez microlitros del extracto catalizaron una reaccin con una velocidad de0,14 moles/min en condiciones ptimas en un ensayo patrn. Cincuenta ml del extrac-to se fraccionaron por precipitacin con sulfato amnico. La fraccin que precipit entre

el 20% y 40% de saturacin se redisolvi en 10 ml. Esta solucin contena 50 mg deprotena/ml. Diez microlitros de esta fraccin purificada catalizaron la reaccin con unavelocidad de 0,65 moles/min. Calcular (a) el porcentaje de recuperacin de enzima enla fraccin purificada, y (b) el grado de purificacin obtenido por el fraccionamiento.

12- Se purific una enzima obtenindose los datos que se indican a continuacin:

FRACCIN VOLUMEN(ml)

ACTIVIDAD(U/ml)

PROTENA(mg/ml)

I 1800,0 0,23 12,5II 75,0 3,00 14,0

III 20,0 5,00 1,0IV 1,5 40,00 0,5

Construya una tabla de purificacin.

13- Con los siguientes datos confeccione una tabla de purificacin para una deshidro-genasa indicando luego: (a) Cul es la purificacin total alcanzada?; (b) Cul es laetapa individual que dio mayor purificacin? (c) Cul es el rendimiento total? (d) Anali-ce la tabla obtenida y seale si todas las etapas empleadas estn justificadas. Funda-mente su respuesta.

FRACCIN VOLUMEN(ml)

A/min PROTENA(mg/ml)


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Extracto crudo 1000,0 124 5Sulfato de amonio 20,0 3100 10CM-celulosa 100,0 496 2Sephadex-G25 100,0 496 1

Coeficiente de absorcin a 340 nm = 6,2 mM-1cm-1.

14- La enzima gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (NADP+ dependiente) cataliza lasiguiente reaccin:

1,3-bisfosfo-glicerato + NADPH + H+gliceraldehido-3-fosfato + NADP++ PiAl purificar esta deshidrogenasa deA. nidulans, se obtuvieron por sonicacin de clulasenteras 120 ml de un extracto crudo conteniendo 25 mg/ml de protena y 20 U/ml deactividad enzimtica. Posteriormente se realiz un fraccionamiento salino. La actividadenzimtica se recuper en la fraccin 40-70 % de saturacin con sulfato de amonio, es-ta fraccin se redisolvi en 40 ml dando una concentracin de protena de 20 mg/ml yuna actividad de 40 U/ml. Luego se realiz una cromatografa de afinidad con RojoProcin (anlogo de NADP+) donde la deshidrogenasa qued unida pudiendo ser elu-da con 0,7 M NaCl, recuperndose as 5 ml con una actividad de 240 U/ml y una con-centracin de protena 0,4 mg/ml. Finalmente se realiz una cromatografa de exclusinmolecular en Sephacryl-S300 donde se recuperaron 6 ml y 0,2 mg/ml de protena. Laactividad de la enzima fue medida como consumo de NADPH, cuyo coeficiente de ex-tincin a 340 nm es 6200 M-1 cm-1 en un volumen de reaccin de 3 ml y una cubeta de1cm de paso de luz. El agregado de 2 l de esta ltima fraccin produjo una disminu-cin de absorbancia de 0,992 al cabo de 2 minutos. Construya la tabla de purificacin.Indique cul es el rendimiento y la purificacin total alcanzados. Indique cul es la eta-pa de mayor purificacin y cul la de mayor rendimiento. Indique si todos los pasos se

justifican fundamentando su respuesta.15- La enzima malato deshidrogenasa NADP+dependiente cataliza la reaccin

malato + NADP+oxalacetato + NADPH + H+A partir de 500 g de hojas de espinaca se obtuvieron 1500 ml de un extracto crudo conuna concentracin de protena de 20 mg/ml. La actividad se determin con una alcuotade 30 microlitros midindose por un mtodo continuo la aparicin de NADPH a 340 nm(coeficiente de absorcin del NADPH= 6200 M-1cm-1) en una cubeta de 3 ml y 1 cm decamino ptico obtenindose una variacin de absorbancia para 10 minutos de 1,24. Serealiz luego una cromatorafa en DEAE celulosa recogindose 180 ml que contenan10 U/ml de actividad enzimtica y 12,5 mg/ml de protena. El paso posterior fue una

columna de hidroxilapatita recogindose 10 tubos de 4 ml c/u con actividad dedeshidrogenasa. La concentracin de protena en el conjunto fue de 0,94 mg/ml conuna actividad de 22,5 U/ml. Como ltimo paso se realiz una cromatografa en columnade Sepharosa 6B y se recuper un volumen de 15 ml con una actividad de 50 U/ml yuna concentracin de protena de 2,1 mg/ml. En base a estos datos construya la tablade purificacin indicando adems (a) cul es la purificacin y el rendimiento totalalcanzados, (b) cul es la etapa individual de mayor purificacin y cul la de mayorrendimiento, (c) seale si todas las etapas empleadas se justifican; fundamente surespuesta.

16- A partir de un extracto libre de clulas se intenta purificar una enzima que cataliza

la reaccin:M + N R + S


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La actividad enzimtica se determina espectrofotomtricamente aprovechando lapropiedad del sustrato M de poseer un pico de absorbancia a 550 nm (coeficiente deextincin = 10,00 mM-1cm-1) que desaparece cuando se produce la reaccin. Esta serealiza en cubetas de 1 cm de paso de luz, en un volumen de 2 ml. En una primeraetapa se realiz un fraccionamiento con sulfato de amonio. La enzima precipit entre el

60 y el 40 % de saturacin. El precipitado obtenido fue resuspendido en un buffer defosfato de potasio 100 mM y dializado contra el mismo. En el dializado se determinactividad enzimtica obtenindose una variacin de absorbancia (A/min) de 0,15. Laconcentracin de protena fue de 3 mg/ml. El volumen total dializado (100 ml) fuedividido en dos volmenes iguales. Una de las fracciones fue sometida a filtracinmolecular por Sephadex G-100 mientras que la otra fue sometida a una cromatografade intercambio inico en DEAE celulosa. Las fracciones activas provenientes de lafiltracin molecular rindieron una preparacin de 200 ml conteniendo 0,04 mg/ml deprotena. Del ensayo de actividad se obtuvo un A/min= 0,03. En cambio, lasfracciones activas provenientes de la cromatografa de intercambio inico rindieron unapreparacin de 50 ml conteniendo 0,02 mg/ml de protena y el ensayo de actividad di

un A/min= 0,02. En todos los casos se emplearon 0,01 ml de las preparacionescorrespondientes para el ensayo de actividad. (a) Calcule el rendimiento y lapurificacin para cada uno de los procedimientos alternativos empleados. (b) Cul delos dos procedimientos (Sephadex o DEAE celulosa) elegira para purificar estaenzima? Fundamente.

17- Una enzima bacteriana que metaboliza la destruccin de un antibitico ha sidoestudiada en vas de obtener un mtodo de purificacin de la misma. La enzimacataliza la destruccin del antibitico segn una reaccin que puede seguirseespectrofotomtricamente a 540 nm con un coeficiente de extincin de 10 mM-1cm-1. La

actividad del extracto crudo se determin empleando una alcuota de 10 microlitros queprodujo la aparicin de 0,02 micromoles de producto en 5 minutos. Luego se intentarondos protocolos de purificacin a partir de un extracto crudo que tena una concentracinde protena de 2 mg/ml en un volumen de 5 litros. La primera etapa, comn a los dosprotocolos, fue una precipitacin con sulfato de amonio, etapa en la que se obtuvo un60% de rendimiento y una purificacin de 5 veces. El precipitado se redisolvi en 100ml y con la mitad del material se realiz una cromatografa de afinidad seguida de unafiltracin por gel recogindose en esta ltima 25 ml con una actividad de 10 U/ml y unaconcentracin de protena de 2 mg/ml (mtodo A). La otra mitad se someti a unacromatografa de adsorcin seguida de una de intercambio inico obtenindose unvolumen de 5 ml con una actividad de 20 U/ml y una concentracin de protena de 1

mg/ml (mtodo B). Calcule la actividad inicial del extracto crudo y las actividades finalesobtenidas con cada mtodo de purificacin. Indique cul mtodo (A o B) empleara parapurificar la protena y por qu. Qu actividad recuperara a partir del volumen totalinicial?

18- Un grupo de investigadores que estn estudiando la enzima L-glutamato deshidro-genasa de una bacteria deciden realizar la purificacin de la misma. Luego de varios in-tentos disean un mtodo de purificacin. En la tabla que sigue se detallan los resulta-dos obtenidos.

FRACCIN VOLUMEN(ml)

ACTIVIDAD(U/ml)

PROTENA(mg/ml)

Extracto crudo 220 42,0 21,0


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DEAE-celulosa 35 224,0 16,0Sulfato de amonio 20 157,5 10,5Sephadex-G50 60 50,0 2,5Crom. de afinidad 10 279,8 1,6

(a) Complete la tabla. (b) Se decide omitir uno de los pasos de purificacin a partir delos datos obtenidos, cul debera ser ese paso y por qu? Cul fue el paso que pro-dujo la mayor purificacin y cul el de mejor rendimiento? (c) Dicha enzima reduce -oxoglutarato a glutamato asociado a la oxidacin de NADH a NAD+, lo que fue utilizadopara seguir espectrofotomtricamente la actividad de la enzima. En una preparacinanterior 0,01 ml de enzima con una concentracin de 10 mg/ml de protena produjeronuna variacin de absorbancia de 0,125/min en condiciones ptimas. Qu actividadespecfica tena esa preparacin? Volumen del ensayo: 1 ml; 340NADH: 6,22 mM

-1

cm-1.

19- La asparaginasa cataliza la reaccin:asparagina + H2O aspartato + H3N

Esta enzima es usada con fines teraputicos en caso de leucemia. Las clulas tumora-les en rpida divisin necesitan cantidades mayores de asparagina que las normales.La administracin de asparaginasa reduce los niveles de asparagina disponible en losindividuos enfermos, lo que reprime la viabilidad del tumor. Un laboratorio farmacuticoque desea comercializar asparaginasa le encarga que realice la purificacin de la en-zima del hongo Boticamyces pharmaceae. A tal fin, parte de 200 ml de un extracto cru-do libre de clulas conteniendo 20 mg/ml de protena. Para medir actividad enzimticaincuba una alcuota de 10 l del extracto con el sustrato a 37C en 0,2 ml de medio dereaccin, finalizndose sta a los 5 min directamente por el agregado de 1 ml de reacti-

vo de color para H3N. La lectura de absorbancia a 540 nm (descontando el blanco) enuna cubeta de 1 cm de camino ptico fue de 0,44 (para la reaccin de color = 2200 M-1cm-1). Luego realiza un fraccionamiento salino, recuperando la asparaginasa en lafraccin 40-80 % de sulfato de amonio. Al redisolver esta fraccin en 20 ml del bufferde purificacin Ud. recupera el 95% de actividad enzimtica y 3800 mg de protena.Luego realiza una cromatografa en columna de DEAE-celulosa y recupera 80 ml quecontenan 600 U de asparaginasa (U es la cantidad de enzima que produce 1 mol deH3N por minuto en las condiciones de ensayo) purificada 20 veces respecto al extractocrudo. Como ltimo paso realiza una cromatografa en columna de hidroxi-apatita de laque recupera 20 ml conteniendo 0,12 mg/ml de protena y 17 U/ml de actividad enzim-tica.

a- Construya la tabla de purificacin y analcela, indicando la purificacin y el rendi-miento total alcanzados. Seale la etapa de mayor purificacin y la de mayor rendi-miento.b- Aconseja iniciar la preparacin de la asparaginasa en gran escala usando los mis-mos pasos de purificacin o sugiere alguna modificacin? Justifique su respuesta.

20- Se purific prcticamente a homoqeneidad la dUTPasa (deoxiuridinatrifosfatasa) deEscherichia coli. Esta enzima hidroliza el dUTP a dUMP y PPi jugando un importanterol en la biosntesis del dTTP para la replicacin de DNA, ya que provee el sustrato pa-ra Ia timidilato sintetasa. Las etapas del procedimiento de purificacin se indican en lasiguiente tabla. Complete la tabla de purificacin.


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FRACCIN VOLUMEN (ml) ACTIVIDAD(U/ml)

PROTENA(mg/ml)

I 1690,0 0,134 2350,0II 340,0 0,503 6060,0III 440,0 0,208 173,0

IV 196,0 0,224 4,0V 19,0 2,420 10,5

I = sobrenadante del lisado celular, II = fraccionamiento con sulfato de amonio, III =cromatografa en DEAE celulosa, IV = cromatografa en fosfocelulosa y V = filtracin enBiogel P-150.

21- Se realiz la purificacin de la enzima glucosa-6-fosfatasa que cataliza la siguientereaccin:

glucosa-6-fosfato + H20 glucosa + fosfatoSe parti de 200 g de hgado bovino obtenindose un extracto inicial de 1200 ml quetena una concentracin de protena de 10 mg/ml. Para medir actividad enzimtica seincub una alcuota de 50 microlitros con el sustrato a 30C en 1 ml de medio de reac-cin, cortndose sta a los 10 min directamente por agregado de 2 ml de reactivo decolor para fosfato. La lectura de Abs a 740 nm en una cubeta de 1 cm de camino pticofue de 0,49 con un blanco de medida de 0,12 (el coeficiente de extincin para la reac-cin de color es de 3700 M-1cm-1). Se realiza luego un corte con sulfato de amonio al50 % rescatndose la fosfatasa en el precipitado. Este precipitado fue redisuelto en unvolumen de 80 ml, siendo la concentracin de protena de 21 mg/ml y la actividad 6,3U/ml. Posteriormente se realiz una cromatografa en Sephadex G-200 recogindose10 tubos de 12 ml c/u con actividad enzimtica. La concentracin de protena en el con-

junto fue de 10,8 mg/ml y la actividad de 3,36 U/ml. Como ltimo paso se realiz una

cromatografa de afinidad y se obtuvieron 20 ml de preparacin con una actividad de7,2 U/ml y una concentracin de protena de 0,5 mg/ml. En base a estos datos constru-ya la tabla de purificacin e indique:a-Cul es la purificacin y el rendimiento alcanzado?b-Cul es la etapa individual que proporcion mayor rendimiento y cul la de mayorpurificacin?c- Seale si todas las etapas empleadas se justifican. Fundamente su respuesta.

22- La piruvato carboxilasa (PCasa) es una enzima que usa biotina como cofactor cata-lizando la reaccin:

piruvato + ATP + HC03oxaloacetato + ADP + Pi

A fin de realizar la purificacin de la PCasa de Eschericia coliUd. parte de 300 ml de unextracto crudo libre de clulas conteniendo 1500 mg protena. La actividad enzimticase midi por un mtodo continuo determinando la produccin de oxaloacetato a 272 nm( 272 = 920 M

-1 cm-1) a 30C y en un volumen final de 3 ml. Utilizando 10 l del extractocrudo para medir la actividad Ud. obtiene un A = 0,46 luego de 5 min de reaccin(medido en cubeta de 1 cm de camino ptico). Luego realiza un fraccionamiento salino,recuperando la PCasa en la fraccin 30-50% de sulfato de amonio. Esta fraccin se re-disolvi en 5 ml del buffer de purificacin que contenan 30 mg/ml de protena y el 90 %de la actividad enzimtica. A continuacin realiza una cromatografa en columna deSephadex G-200, recuperando 30 ml que contenan 150 mg de protena y 270 U/ml (Uest expresada en mol/min) de actividad enzimtica. Como ltimo paso realiza unacromatografa en columna de CM-celulosa de la que recupera 45 ml conteniendo 6750U de PCasa purificada 900 veces respecto del extracto crudo. En base a estos datosa- Construya la tabla de purificacin.


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b- Analice la tabla indicando purificacin y rendimiento total alcanzados, as como elpaso de mayor purificacin y el de mayor rendimiento.c- Indique si todos los pasos se justifican, explicando su respuesta

23- Durante la purificacin de la enzima ureasa (urea + H2O 2 NH4++ CO2) se obtu-

vieron 900 ml de extracto crudo con una concentracin de protena de 3,33 mg/ml. Suactividad se sigui midiendo la disminucin de absorbancia a 340 nm utilizando la reac-cin acoplada NH4

++ cetoglutarato + NADH + H+ glutamato + NAD+(NADH= 6200M-1 cm-1). El agregado de 20l de extracto crudo a 1 ml de la mezcla de reaccinprodujo una A = -0,800 en 4 minutos en una cubeta de 1 cm de paso ptico. Un cortecon sulfato de amonio dio lugar a un precipitado que se redisolvi en 150 ml de buffer.De esta manera la ureasa se purific 10 veces con un rendimiento del 82,8 %. Estafraccin se cromatografi en una columna de Sephadex G25 recolectndose 80 ml deeluato con el 90 % de la actividad de la etapa anterior conteniendo 45 mg de protena ysiendo la purificacin respecto del extracto crudo de 50. Su actividad se determin porel metodo discontnuo ( NH4

++ fenol + hipocloritoazul de indofenol ) cuya curva decalibracin de NH4+ present una pendiente de 0,6557 UA/mol NH4+. Las condicio-nes de la colorimetra fueron las mismas para la curva y la muestra.a) Cul fue la absorbancia medida por este ltimo mtodo para la muestra si se em-

plearon 40 l de ureasa obtenida en la ltima etapa?b) Realice la tabla de purificacin.

24- Su profesor de Bioqumica le ha asignado como trabajo prctico para aprobar la mate-ria que determine la masa molecular de la -lactamasa de Azospirillum lipoferumRG20.Como material de partida le provee 25 ml de un extracto crudo obtenido por sonicacin deun cultivo del microorganismo en fase logartmica de crecimiento.

Mediante una bsqueda bibliogrfica Ud halla la siguiente tabla de purificacin:

TABLA 1: Purificacin de la -lactamasadeAzospirillum lipoferumRG20.

ETAPAActividadespecfica

(U/mg)

Actividadtotal(U)

Purificacin(veces)

Rendimiento(%)

Extracto crudo 4 3,349 1 100

Ppcin con sulfato de amonio 8 3,208 2 96

CM-Sephadex 1251 1,847 301 55Chromatografa de afinidad 2155 1,373 518 41

La determinacin de la actividad enzimtica del extracto crudo empleando nitrocefina comosustrato (=16000 M-1cm-1) result en una variacin de absorbancia de 0,32 en dos minu-tos cuando emplea 20 l de muestra (volumen de cubeta=1ml, camino ptico=1cm).Para determinar la masa molecular de la enzima realiza una electroforesis en condicionesdesnaturalizantes y obtiene los resultados que se muestran. La calle A corresponde a laenzima purificada y la B a los marcadores de masa molecular: albmina bovina srica (67kDa), ovalbmina (43 kDa), anhidrasa carbnica (30 kDa), inhibidor de tripsina (20,1 kDa) y

-lactalbmina (14,4 kDa).a-Cual es la actividad del extracto crudo?


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b-Cuntas unidades de enzima espera obtener luego de realizar la purificacin?Qu ac-tividad especfica espera obtener?c-Qu masa molecular informar?. Qu otro mtodo podra haber usado para realizaresta determinacin?

A B

25- Se desea purificar una deshidrogenasa de planta (Punto Isoelctrico 3,1) a partir de5 litros de extracto crudo. Con el propsito de poner a punto el mtodo de purificacinse ensaya un protocolo que consta de tres etapas: fraccionamiento salino (etapa 1),cromatografa de intercambio inico (etapa 2) y cromatografa de afinidad (etapa 3). Semidi espectrofotomtricamente la actividad de muestras provenientes de cada etapaempleando 5 l de muestra, en un volumen de reaccin de 1ml, durante 3 minutos a

25c (340= 6000 M-1.cm-1). Los valores de variacin de absorbancia obtenidos, la con-centracin de protena y los volmenes totales se muestran en la tabla.

Etapa Volumen(ml)

Protena(mg/ml)

A(340nm)

Extracto crudo 50 3 0,091 7 10 0,452 10 0,5 0,2253 2 0,05 0,675

a-Complete la tabla de purificacin.b-Indique cul ser la cantidad de enzima (U totales) y la actividad especfica obtenidasi purifica la enzima a partir del resto de extracto crudo.c-Explique brevemente el fundamento de la cromatografa de intercambio inico e indi-que qu tipo (aninico o catinico) empleara para purificar la deshidrogenas del enun-ciado y a qu pH lo hara.

26- Su profesor de Bioqumica le ha asignado como trabajo prctico que purifique la -lactamasa deAzospirillum lipoferumRG20 y determine su masa molecular. Como materialde partida le provee 25 ml de un extracto crudo obtenido por sonicacin de un cultivo delmicroorganismo en fase logaritmica de crecimiento con una actividad de 8 U/ml y una con-

centracin de protena de 2 mg/ml.Mediante una bsqueda bibliogrfica Ud halla un mtodo de purificacin que arroja los da-tos de la siguiente tabla.


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ETAPA Actividad

especfica(U/mg)

Actividadtotal(U)

Purificacin(veces)

Rendimiento(%)

Extracto crudo 4 3,349 1 100

Ppcin con sulfato de amonio 8 3,208 2 96

CM-Sephadex 1251 1,847 301 55

Cromatografa de afinidad 2155 1,373 518 41

Ud realiza todos los pasos de purificacin y obtiene 8 ml de enzima purificada. La determi-nacin de la actividad enzimtica de la protena purificada empleando nitrocefina comosustrato (=16000 M-1cm-1) result en una variacin de absorbancia de 0,48 en dos minu-tos cuando emplea 3 l de muestra (volumen de cubeta =1ml, camino ptico = 1cm) siendola concentracin de protena 0,002 mg/ml .

La determinacin de masa molecular la realiza mediante una cromatografa de filtracinmolecular empleando una columna previamente calibrada segn se indica en la siguientetabla:

Protena marcadora Volumen de elucin (ml) Masa molecular (kDa)

Ribonucleasa 250 13,7

Quimotripsingeno 230 25,0

Ovoalbmina 210 43,0

Albmina 195 67,0

Aldolasa 165 158,2

Catalasa 150 231,9

El volumen de elucin de la protena en estudio fue de 220 ml, el volumen total de la co-lumna fue de 260 ml y el volumen de exclusin de 100 ml.a-Cual es la actividad especfica de la enzima por Ud. purificada?b- Cual es el rendimiento y la purificacin obtenidas por Ud. con respecto a los publicados?c-Qu masa molecular informar? (determinacin por mtodo grfico) Cmo determinar-a si se trata de una enzima monomrica o no?

RESPUESTAS:

1- a) Las mismas. B) Keq= [A B]/ [A] [B] = 0,67/mM

2- Cubeta: 8 x 10-3U/ml ; 3,3 x 10-3U/mgMuestra: 8 x 10-2U/ml ; 3,3 x 10-3U/mg

3- a) 6 x 10-2mM/minb) 30 nanomoles/min ml

c) 0,06 U/ml 3 U/ml (ext)d) 0,15 U/mg


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4- a) 5,2 moles (Se deben verificar condiciones de linealidad)b) 6 segundos

5- a) 720 s-1; 43200 min-1

b) 0,0014 s

6- a) 500 U/mg; 4,6 x 1010U/molb) 46000 min-1c) 1,3 x 10-3s

7- a) debe diluirb) agregar glicerol, gelatina , albmina bovina srica, etc. Otra forma es aumen-

tar la concentracin de sustrato en el medio de reaccin.

8- 22 U/ml ; 1100 U/mg

9- 271 s-1

10- a) R= 88,5 %b) P= 2,94

11- a) 93%b) P= 3

12- Rt= 14%Pt= 4347

13- a) 20b) IIc) 40 %d) No. Se puede eliminar la etapa III

14- Rt= 30 %; Pt= 750; Etapa de mayor purificacin= III; Etapa de mayor rendimien-to= III; se eliminara la etapa IV

15- a) Pt= 240; Rt= 25 %b) la de mayor purificacin es la etapa III, la de mayor rendimiento la IV

c) No. Se podra eliminar la etapa IV16- a) Filtracin molecular: R= 80 %, P= 15

Intercambio inico: R= 13 %, P= 20

17- Actividad extracto crudo= 0,4 U/mlActividades finales: Mtodo A= 10 U/ml

Mtodo B= 20 U/mlEmpleara BActividad recuperada= 200 UT

18- b) el paso omitido debera ser III y IVMayor purificacin= paso VMayor rendimiento= paso IV


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c) 0,2 U/mg

19- a) Pt= 592; Rt=35 %Mayor purificacin= IVMayor rendimiento= II

b) se eliminara la etapa II

20- Pt= 4044; Rt=20 %

21- a) Pt= 240; Rt=20 %b) Mayor rendimiento= paso III

Mayor purificacin= paso IVc) No. Se eliminara la etapa III (podra dejarse para desalar la muestra)

22- b) Pt=900; Rt=75 %Mayor rendimiento= paso II

Mayor purificacin= paso IV

23- a) Abs= 0,34b) Pt= 50; Rt=75 %

24- a) 0,5 U/mlb) 5125 U 2155 U/mg

c) 31000 Filtracin molecular

25- 4950 U totales; 150 U/mg

26- a) 2500 U/mgb) rendimiento 20 % - menor; purificacin 625- mayorc) 31000


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CINTICA ENZIMTICA

PROBLEMAS:

1- Utilizando la ecuacin de Michaelis-Menten demuestre que v = Vmx/2 cuando

[S]= Km.

2- Estudiando el efecto del pH sobre la actividad de una enzima se trabaj de acuerdoa dos protocolos diferentes. En uno de ellos (A) se preincub la enzima a distintos pHsy luego se midi la actividad de la misma a pH 7. En el otro caso (B) se determin laactividad de la enzima a distintos pHs. Los resultados obtenidos se muestran acontinuacin.

pHACTIVIDAD

Protocolo A Protocolo B4.0 7,9 1,04.5 8,1 1,95.0 8,0 3,25.5 8,2 4,96.0 7,8 7,36.5 8,0 9,07.0 8,0 8,07.5 8,1 6,38.0 4,0 2,58.5 2,0 1,09.0 0,2 0,0

Explique el comportamiento enzimtico en cada caso .

3-Una enzima posee la curva de actividad versus pH que aparece en la figura:

pH

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

%Actividad

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0(a) Explique este comportamiento

(b) Como probara su hiptesis?(c) Suponga que se inform que unresiduo de Asp es el responsable deuna parte de esta curva de pH,cmo explicara estecomportamiento ?


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p H

3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

%Actividad

0

2 0

4 0

6 0

8 0

10 0

4- En la figura se muestra el comportamiento de la actividad de una enzima en funcindel pH. Qu aminocidos del sitio activo seran los responsables del comportamientoobservado? No tenga en cuenta el efecto de la falta de ionizacin causada por el medio

hidrofbico.

5- La actividad de una enzima se determin a diferentes temperaturas obtenindose losvalores que se indican a continuacin.

Temperatura () 0 10 20 25 30 40Actividad (U/ml) 5 10 21 30 20 10

Cuando la enzima se preincub a cada una de las temperaturas anteriores y su

actividad se ensay a la temperatura ptima se obtuvieron los mismos valores develocidad, excepto para las alcuotas de enzima provenientes de la incubacin a 30C y40C , las que fueron significativamente menores. Con los datos anteriores, indique:a) Cul es la temperatura ptima de reaccin? b)Por qu la actividad enzimticacuando se ensay a la temperatura ptima no fue constante para todas las muestraspreviamente incubadas a distintas temperaturas?

6- La Kmpara el etanol de la alcohol deshidrogenasa de levadura es de 1,3.10-2M. Si la

concentracin de alcohol en el medio de reaccin es de 59,2 g/ml qu proporcin deenzima estar libre y que proporcin estar combinada con el sustrato?, cuando lavelocidad de reaccin sea igual a Vmax ,qu valores tomarn estas proporciones?

7- Calcular qu velocidad se obtendr en una reaccin enzimtica si la velocidadmxima es igual a 100 mol/min y la concentracin de sustrato es a) 10 Kmy b) Km/3.

8- Calcular qu concentracin de sustrato expresada en funcin de la Kmnos dar unavelocidad de reaccin enzimtica igual al 60 % de la Vmax.

9- Una disolucin al 1% de almidn se digiere a pH 6,7 mediante 15 g de amilasa (PM= 152000). La velocidad inicial mxima de liberacin de maltosa es de 8,5 mg/min.Calcular el nmero de recambio de dicha enzima.

10- Una enzima tiene un peso molecular de 60000 y 6 sitios activos por mlecula. Lavelocidad inicial de la reaccin que cataliza es 12 moles de sustrato cada 12 min en


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presencia de 18 g de enzima. Calcule la actividad molecular por centro cataltico de laenzima.

11- Los datos de velocidad y concentracin que se muestran en la tabla se obtuvieronpara una enzima que cataliza una reaccin S P.

a- Calcular Kmy Vmx.b- Comprobar que la enzima sigue una cintica de saturacin hiperblica

[Sustrato]M

velocidadnmol/l.min

2,5 10-6 243,3 10-6 304,0 10-6 345,0 10-6 401,0 10-5 602,0 10-5 804,0 10-5 961,0 10-4 1092,0 10-3 1191,0 10-2 120

12- Una enzima con un Kmde 2,4 10-4M se ensay con las siguientes concentraciones

de sustrato: (a) 2,0 10-7M, (b) 6,3 10-5M, (c) 1,0 10-4 M, (d) 2,0 10-3M y (e) 5,0 10-2M.La velocidad observada a 5,0 10-2 M fue de 128 nmol/l/min. Calcular las velocidadesiniciales con las otras concentraciones de sustrato.

13- Si la concentracin de enzima del problema anterior se aumentara 5 veces, culsera la velocidad inicial a cada una de las concentraciones dadas? y si se aumentarala concentracin de sustrato cinco veces?

14- Se hicieron diez mezclas de reaccin. Cada una contena la misma concentracinde enzima, a varias concentraciones de sustrato, y las velocidades iniciales sedeterminaron como se muestra en la tabla. Utilizando la ecuacin de Lineweaver-Burk,determine grficamente el Kmy la Vmx. Observe que uno de los factores crticos en laexactitud de esta determinacin son las escalas seleccionadas para la ordenada y laabcisa. Cules son los intervalos de concentraciones de sustrato son ms tiles para

estas determinaciones?[Sustrato]

Mvelocidadnmol/min

[Sustrato]M

velocidadnmol/min

1,0 10-3 65,0 2,0 10-5 27,05,0 10-4 63,0 1,0 10-5 17,01,0 10-4 51,0 5,0 10-6 9,55,0 10-5 42,0 1,0 10-6 2,23,0 10-5 33,0 5,0 10-7 1,1

15- Se hicieron varias mezclas de reaccin que contenan concentraciones iguales deuna enzima, a las concentraciones de sustrato indicadas en la tabla y se determinaronlas velocidades de reaccin iniciales. Utilizando la ecuacin de Eadie-Hofstee, (v =f(v/S)determine grficamente la Kmy la Vmx. Cul es la ventaja de este tipo de grficasobre la de Lineweaver-Burk?


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[Sustrato]

Mvelocidadnmol/min

4,0 10-4 130,02,0 10-4 110,0

1,0 10-4 89,05,0 10-5 62,04,0 10-5 53,02,5 10-5 38,02,0 10-5 32,0

16- Dos estudiantes A y B aislaron independientemente la enzima lactatodeshidrogenasa de msculo de caballo que cataliza la reduccin de piruvato siguiendolos mismos pasos de purificacin. Una vez obtenida una solucin concentrada deenzima midieron actividad en funcin de la concentracin de sustrato obteniendo lossiguientes datos:

Sustrato] (M) 2,0 10-6 5,0 10-6 1,0 10-5 5,0 10-5 1,0 10-4 2,0 10-4 1,0 10-3

VA mol.min.mg-1 16 33 50 83 90 95 100

VB mol.min.mg-1 25 50 75 125 136 143 150

a- Sin graficar haga una estimacin aproximada de Kmy Vmxobservando los datos deA y B. Justifique.b- Intente una explicacin para la discrepancia observada entre los parmetroscinticos de A y B.c- Qu variables graficara para obtener Kmy Vmx. Justifique.

17- A partir de un experimento de inhibicin se obtuvieron los datos de la tabla. Median-te una grfica de Lineweaver-Burk. Determine si el compuesto en estudio es un inhibi-dor competitivo o no competitivo. Determine Ki (la concentracin del inhibidor es 1M)

[ Sustrato ](moles/l)

v sin inhibidor(mol/min)

v con inhibidor(mol/min)

0,50.10-4 0,42 0,170,67.10-4 0,50 0,201,00 10-4 0,60 0,24

1,30 10

-4

0,66 0,272,70 10-4 0,80 0,325,30 10-4 0,88 0,36

18- Calcule el Kmy la Vmxde la enzima E y de la enzima E en presencia del compuestoI a partir de los datos que se indican en la siguiente tabla:

[S] (mM) 0,100 0,125 0,250 0,500 0,750 1,000vcontrol (U/mg) 0,154 0,185 0,250 0,345 0,370 0,400v con inhibidor (U/mg) 0,065 0,081 0,133 0,217 0,263 0,294

Indique qu tipo de inhibidor es el compuesto agregado.


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19- Sobre una enzima que cataliza la reaccin S P se prueba el efecto de dos inhibi-dores X e Y obtenindose los datos de velocidad que se muestran en la tabla. Determi-nar qu tipo de inhibidor es cada uno de ellos. Calcule Kmy Vmx.

[S] (mM) sin agregado [x]=12M [I]=60M

2,00 66,67 40,00 22,222,50 71,40 45,45 23,813,33 76,92 52,63 25,644,00 80,00 57,14 26,675,00 83,33 62,50 27,77

Los datos de velocidad de estn expresados en U/ml.

20- El salicilato inhibe la accin cataltica de la glutamato deshidrogenasaa) Determine el tipo de inhibicin mediante el anlisis grfico de los datos de la tabla. b)Calcule la Kmpara el sustrato.Suponga que la concentracin de salicilato se mantiene constante y es de 40 mM.

[Sustrato](mM)

V (mg de producto/min)sin salicilato con salicilato

1,5 0,21 0,082,0 0,25 0,103,0 0,28 0,124,0 0,33 0,138,0 0,44 0,1616,0 0,45 0,18

21- A partir de los siguientes datos obtenidos al estudiar el efecto de un inhibidor sobreuna reaccin enzimtica, determine el tipo de inhibicin y la Kmpara el sustrato.

[Sustrato](mM)

V (g de producto/min)[inhibidor] = 0mM [inhibidor]=6mM

2,0 139 883,0 179 1214,0 213 14910,0 313 25715,0 370 313

22- Se determinaron los parmetros cinticos de una enzima en ausencia y enpresencia de una serie de compuestos, algunos de los cuales se supone podran serinhibidores de la misma. Los resultados obtenidos con la enzima sin agregados sedetallan en la tabla 1. En la tabla 2 se presentan los valores de Vmx y de Kmobtenidosen presencia de los compuestos en estudio.a- Calcule los valores de Vmxy de Kma partir de los datos de la tabla 1.b- Indique qu tipo de inhibidor es cada uno de los compuestos agregados.

TABLA 1[S]

(M)

Act.

(mol/min/mg)2,0 0.0292,5 0.032


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18

3,3 0.0375,0 0.043

10,0 0.05350,0 0.063100,0 0.063

TABLA 2Vmax (mol/min/mg) Compuesto Km(M)

0,033 A 2,50,065 B 5,00,064 C 2,40,033 D 1,3

23- Al estudiar el efecto de una serie de compuestos sobre la enzima hexoquinasa(Glc + ATP Glc-6-P + ADP) se observ que es inhibida por piruvato. La tabla

muestra los valores de actividad en mol/min obtenidos cuando se vara laconcentracin de sustrato y/o de piruvato.

[I] (mM) [S]=1,00 mM [S]=1,82 mM [S]=2,50 mM [S]=10,00mM0,0 1,25 2,00 2,50 5,000,2 0,83 1,33 1,67 3,330,4 0,63 1,00 1,25 2,500,6 0,50 0,80 1,00 2,000,8 0,42 0,67 0,83 1,671,0 0,36 0,57 0,71 1,43

En base a estos datos indique:

a- qu tipo de inhibidor es piruvatob- el valor de Kmc- el valor de Vmxd- el valor de Ki.

24- Para estudiar el efecto de una serie de compuestos sobre la actividad de unaenzima se incuba la misma con los mismos durante 5 min. Luego se agrega el sustratoen la misma cubeta y se determina la velocidad inicial de la reaccin. Se obtienen lossiguientes resultados:

Preincubacincon

Vi(M/min)

- 10,10A 12,5B 9,8C 5,30D 0,50

Qu efecto ejerce c/u de los compuestos sobre la enzima? Cmo puede determinarsi la interaccin en cuestin es reversible o irreversible?

25- Se ha determinado que dos compuestos B y C son inhibidores irreversibles de laenzima E. Con el objeto de caracterizar la inactivacin se realiz lo siguiente:


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a- Se incub la enzima con distintas concentraciones del compuesto en estudio durantedistintos tiempos.b- Se tom una alcuota de la mezcla anterior y se midi la actividad enzimtica. Seobtuvieron los siguientes resultados:

CONTROLTiempo (min) Vi(U/ml)

0 1,891 1,872 1,905 1,88

10 1,8620 1,89

COMPUESTO B

[B]=20Mt (min)Vi(U/ml)

[B]=30Mt (min)Vi (U/ml)




1 1,78 1 1,74 1 1,63 1 1,55 1 1,475 1,34 5 1,25 2 1,40 2 1,23 2 1,17

10 0,98 10 0,83 5 0,89 5 0,72 5 0,5715 0,70 12 0,57 7 0,65 7 0,49 7 0,3620 0,50 20 0,37 10 0,41 10 0,26 10 0,17

COMPUESTO C

Tiempo(min)

Vi(U/ml)[C]=5M

Vi(U/ml)[C]=10M

Vi(U/ml)[C]=20M

Vi(U/ml)[C]=50M

Vi(U/ml)[C]=100M

Vi(U/ml)[C]=200M

0,5 1,68 1,59 1,55 1,51 1,47 1,451,0 1,47 1,34 1,29 1,21 1,15 1,132,0 1,17 0,96 0,89 0,76 0,72 0,663,0 0,89 0,68 0,60 0,49 0,44 0,414,0 0,72 0,49 0,42 0,32 0,27 0,25

De acuerdo a los datos obtenidos qu mecanismo de inactivacin puede postularsepara cada uno de los compuestos? Calcule las constantes de velocidad y de equilibrioinvolucradas.

26- La accin teraputica de la mayora de las drogas actualmente utilizadas estbasada en la inhibicin que estas causan sobre determinadas enzimas. Laquimioterapia moderna tuvo sus comienzos con el uso de las sulfas, compuestos quehan sido ampliamente usados para tratar infecciones bacterianas. Las bacterias nopueden absorber cido flico (AF) del medio y deben sintetizarlo ya que estecompuesto es escencial para el crecimiento celular porque es una coenzima dediversas vas metablicas. La sntesis de AF involucra una serie de reacciones, entreellas la catalizada por la enzima dihidropteroato sintetasa (DHPT STasa). La accin delas sulfas se basa en que inhiben la DHPT STasa y la bacteria queda privada de AF no

pudiendo crecer y dividirse. Ya que las clulas del individuo infectado obtienen AF de ladieta (el AF es vitamina para el hombre) la sulfa no es txica en las dosis usadas. Al


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estudiar el efecto de la dimetilsulfanilamida (DMSF) sobre la actividad de la DHPTSTasa se obtuvieron los siguientes resultados:i- La incubacin de la enzima con DMSF, seguida de dilisis por 6 horas no afect laactividad enzimtica.ii- El ensayo de actividad usando concentraciones variables de PABA (el otro sustrato

se mantiene fijo y saturante) y diferentes concentraciones de DMSF resultaron losvalores de velocidad que muestran en la tabla.

[PABA](mM) [DMSF] = 0

Velocidad (U/mg)[DMSF] = 16 M [DMSF]= 50 M

0,10 1,67 1,00 0,600,15 2,00 1,25 0,700,20 2,50 1,67 1,000,40 3,33 2,50 1,670,80 4,00 3,33 2,50

En base a estos datos:a- Determine qu tipo de inhibidor es DMSF y postule el modelo de inhibicincorrespondiente.b- Determine el Kmpara PABA, la Vmaxde la DHPT STasa y el Ki para DMSF.c- Indique si los niveles de PABA en la clula bacteriana afectan la efectividad de lasulfa como medicamento. Justifique la respuesta.

27- Se estudia el efecto de un compuesto I sobre la actividad de una enzima. Para ellose midi la actividad de la enzima preincubada a distintos tiempos con distintas concen-traciones del compuesto obtenindose los resultados de la tabla:

[I]=1M [I]=2M [I]=5M [I]=10Mt (min) Vi/V0 t (min) Vi/V0 t (min) Vi/V0 t (min) Vi/V00 1,00 0 1,00 0 1,00 0 1,002 0,92 2 0,86 1 0,83 1 0,694 0,85 4 0,75 2 0,68 2 0,47

10 0,68 10 0,50 4 0,45 3 0,3215 0,56 15 0,35 7 0,25 4 0,2220 0,46 20 0,24 10 0,45 5 0,15

a- Calcular las constantes de pseudo primer orden k.b- A partir del anlisis del comportamiento de k en funcin de [I] de los resultados obte-nidos, indique qu mecanismo puede postular para la inhibicin.

28- Se estudia el efecto de un compuesto I sobre la actividad de una enzima. Para ellose midi la actividad de la enzima preincubada a distintos tiempos con distintas concen-traciones del compuesto obtenindose los resultados de la tabla:

[I]=1M [I]=2M [I]=4M [I]=8M [I]=14Mt (min) Vi/V0 t (min) Vi/V0 t (min) Vi/V0 t (min) Vi/V0 t (min) Vi/V0

0 1,00 0 1,00 0 1,00 0 1,00 0 1,001 0,95 1 0,90 1 0,80 1 0,65 1 0,562 0,91 2 0,80 2 0,69 2 0,40 2 0,30

4 0,82 4 0,63 4 0,46 3 0,25 3 0,109 0,64 9 0,34 9 0,17 4 0,06 4 0,00514 0,50 14 0,19


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a- Calcular las constantes de pseudo primer orden k.b- A partir del anlisis del comportamiento de k en funcin de [I] de los resultados obte-nidos indique que mecanismo puede postular para la inhibicin.

29- Una de las enzimas ms importantes de la va de biosntesis de cido flico (coen-zima indispensable en la sntesis de purinas y pirimidinas) es la dihidrofolato reductasa.Se purific esta enzima a partir de leucocitos humanos obtenindose un extracto alta-mente purificado (concentracion de protena: 0,1 mg/ml ) al que se le midi la actividadespectrofotomtricamente ( Coeficiente de extincin: 6220 M-1cm-1) empleando distintosvolmenes del mismo (1 l, 2 l y 3 l) en una cubeta de reaccin de 1 ml y 1 cm decamino ptico. Se obtuvieron las variaciones de absorbancia en el tiempo que semuestran a continuacin:

Explique las formas de las curvas observadas enlos distintos ensayos. Cul elige para calcular la

actividad de la enzima y por qu? Calcule la acti-vidad especfica de la enzima purificada.El metotrexato se emplea en el tratamiento de ni-os con leucemia, ya que se trata de un potenteinhibidor de la enzima mencionada. Con el objetode conocer cul es el mecanismo de inhibicin seha determinado la velocidad de reaccin de la en-zima a distintas concentraciones de sustrato enpresencia de distintas concentraciones del inhibi-dor obtenindose los resultados que se indican enla tabla.

[S] mM v (nM/min)[I]=0

v (nM/min)[I]=0.2 nM

v (nM/min)[I]=0.4nM

v (nM/min)[I]=0.6nM

0,1 1,25 0,83 0,58 0,500,2 2,00 1,42 1,04 0,910,4 2,86 2,22 1,72 1,540,8 3,63 3,07 2,56 2,351,2 4,00 3,53 3,05 2,851,6 4,21 3,81 3,38 3,202,0 4,35 4,00 3,62 3,44

2,4 4,44 4,14 3,79 3,63

Indique cul es el mecanismo de inhibicin, calcule el K i para el metotrexato. Consi-dera que el nivel de dihidrofolato en la clula es capaz de alterar el efecto del meto-trexato?

30- La hidroxiurea (U-OH) es un medicamento utilizado para el tratamiento de tumores.El uso de esta droga est basado en que es un inhibidor reversible de la enzima ribo-nucletido reductasa (RRasa), la que cataliza la sntesis de deoxirribonucletidos(dNDP) a partir de los ribonucletidos (NDP) correspondientes segn la reaccin:

NDP + tiorred red dNDP + tiorred ox

As, la U-OH inhibe la proliferacin de clulas tomorales ya que disminuye considera-blemente la sntesis de los dNDP necesarios para la replicacin del DNA. Al estudiar lainhibicin reversible de la U-OH sobre la RRasa se midi actividad enzimtica a con-

Tiempo (s)

0 20 40 60 80 100 120 140

Variacion

de

absorbancia

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


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22

centraciones variables de NDP (el otro sustrato se mantuvo fijo y saturante) en ausen-cia o presencia del inhibidor.

[NDP](M) [U-OH] = 0

Velocidad (U/mg)[U-OH] = 4 M [U-OH]= 12 M

6,25 0,80 0,40 0,208,30 1,00 0,50 0,25

12,50 1,33 0,67 0,3325,00 2,00 1,00 0,50

Esta tabla muestra los resultados obtenidos. En base a ellos:a- Determine que tipo de inhibidor es U-OH, indicando el modelo de la reaccin de in-hibicin.b- Determine Kmy Vmax para NDP de la RRasa y el Kipara U-OH.c- Indique si los niveles de NDP en la clula tumoral afectan la efectividad de la U-OHcomo medicamento. Justifique su respuesta.

31- El compuesto I es un inhibidor irreversible de la enzima E. Se preincub E con dis-tintas concentraciones de I tomndose, a distintos tiempos muestra en las que se de-termin la actividad residual. A todas las concentraciones de I ensayadas se observun decaimiento exponencial simple de la actividad, lo que permiti calcular las constan-tes de pseudo-primer orden (kobs) mostradas en la tabla. En base a estos datos postuleun mecanismo para la inactivacion observada y calcule las constantes cinticas y/o deequilibrio correspondientes.

[I] (M) kobs(min-1)

2,5 0,0503,3 0,0675,0 0,100

10,0 0,20020,0 0,400

32- Se estudi el efecto de un medicamento sobre la actividad de una enzima oli-gomrica. Para este estudio se midi actividad de la enzima frente a este reactivo, ob-tenindose los siguientes resultados:

Concentracin de sus-trato (mM)

Velocidad control (U/ml) Velocidad frente a reac-tivo 1 mM (U/ml)

0,2 2,0 0,020,3 2,9 0,080,4 3,8 0,30,8 7,4 3,91,0 9,1 9,15,0 33 9810,0 50 99

Explique como acta este medicamento y que efecto produce sobre la actividad de laenzima. Se podra utilizar en terapias, suponiendo que los productos de la actividadenzimtica son cancergenos? (Se sabe que la concentracin intracelular de sustrato

es aproximadamente 9 mM).Por otro lado se tomaron 0,2 ml de solucin de enzima y se la incub con un inhibidorreversible. Se dej pasar el tiempo que aparece en la tabla, se tom una alcuota de


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0,02 ml y se midi actividad enzimtica en 1 ml de un medio adecuado. Lo mismo sehizo con otros 0,2 ml, pero en presencia de otro inhibidor, en este caso irreversible.Anote en la tabla siguiente (con nmeros arbitrarios) los valores esperados de actividadenzimtica, sabiendo que la actividad de la enzima no inhibida a tiempo 0 es 5 U/ml.

1 min 3 min 5 min 10 min

Inh reversibleInh irreversible

33- Los siguientes datos se obtuvieron para una reaccin catalizada enzimticamente.Determinar si la enzima sigue una cintica hiperblica o sigmoidea y calcular o estimarlas constantes cinticas apropiadas ( Kmy Vmax o o K', [S]0,5 , nap y Vmax)

Concentracin inicial de sustra-to (M 10-4)

Velocidad inicial( mol l-1min-1)

6,25 1,5412,5 5,8825,0 20,0050,0 50,00

100,0 80,00200,0 94,12400,0 98,46800,0 99,61

34- Cul es el valor de napde una enzima si [S]0,9/[S]0,1 es 9?

35- Calcular la proporcin [S]0,9/[S]0,1 de una enzima alostrica en el que nap= 4.

36- Ud. est caracterizando el efecto de un frmaco X sobre una enzima clave de uncamino metablico. En la tabla se muestra el efecto de la concentracin de sustrato so-bre la actividad en presencia y en ausencia del frmaco X. Sabiendo que la concentra-cin intracelular de sustrato de la enzima es 0,5 mM, describa el efecto del frmaco ycalcule los parmetros cinticos de la enzima en presencia y en ausencia de X.

Sustrato(mM)

Control(U/mg)

Frmaco X(U/mg)

0,0 0,0 0,0

0,1 2,85 0,050,2 4,90 0,230,4 7,60 1,020,8 10,50 4,001,0 11,40 5,702,0 13,70 12,004,0 15,20 15,70

RESPUESTAS:1- consultar clases de teora2- ver curvas de actividad y de estabilidad enzimticas


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3- a) Un residuo de His no protonado (pKa= 6) y un grupo amino terminal protona-do (pKaalrededor de 8) o un grupo sulfidrilo (pKa= 8,1), necesarios para la acti-vidad enzimtica, seran los responsables, respectivamente, de las partes as-cendentes y descendentes de la curva. b) Cristalografa de rayos X c) Un mediono polar suprime la ionizacin de los grupos cargados. Tal efecto podria elevar el

pKa del grupo carboxilo del Asp a pH 64- ver aminocidos cuyos pKa de grupo R estn entre 6 y 8.5- dem respuesta preg. 26- 9 % combinada, 91 % libre; 100 % combinada7- a) 91 mol/min

b) 25 mol/min8- [s]= 1,5 Km9- 253.333 min-1o 4168 s-110- 555 min-1o 9 s-111- Km = 1,0 x 10-5M; Vmx= 120 nmol/l/min12- a) 0,1 mmol/l/min; b) 27 mmol/l/min; c) 38 nmol/l/min; d) 114 mmol/l/min

13- a) 0.5 mmol/l/min; b) 73 mmol/l/min; c) 86 mmol/l/min; d) 125 mmol/l/min; e) au-mentara 5 veces la V0.14- 0,33 S < Km < 2,0 S15- Km= 7,5 x 10-5M; Vmx= 154 nmol/min. La grfica de Eadie-Hofstee puededesplazar los datos en un intervalo mayor de concentraciones de sustrato. De estemodo, los datos que se presentan lineales en una grfica de Lineweaver-Burk, al-gunas veces exhiben desviaciones significativas de la linealidad con la grfica deEadie-Hofstee.16- consultar teora17- Km= 0,67 x 10-4 moles/l; Vmx= 0,99 mol/min; Kmi= 0,68 x 10

-4 moles/l;

Vmxi= 0,40 mol/min; Inhibidor no competitivo18- Km= 0,21 mM; Vmx= 0,48 U/mg; Kmi= 0,63 mM; Vmxi =0,48 U/mg; Competiti-vo.19- Km= 1 mM; Vmx= 100 U/ml; Kmx= 3 mM; Vmxx =100 U/ml; Kmy= 1 mM;Vmxy =33 U/ml; x competitivo; y no competitivo.20- a) Inhibidor no competitivo

b) Km= 2,4 mM21- Inhibidor competitivo

Km= 5,2 mM22- a) Km= 2,55 M; Vmx= 0,065 mol/min/mg

b) A: no competitivo

B: competitivoC: no tiene efectoD: acompetitivo

23- a) no competitivob) Km= 5 mMc) Vmx= 7,5 mol/mind) Ki= 0,385 mM

24- ver clases de teora25- B: mec. 1; C: mec 2

B: K1= 3 10-3M; C: Ki= 5 M, K2=0,54 min

-126- a) competitivo

b) Km= 0,21 mM; Vmx= 5,26 U/mg; Ki= 16,5 Mc) Afecta

27- k1= 0,038 M; mecanismo 1


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25

28- k1= 0,053 M29- Competitivo; Ki= 0,25 nM30- a) no competitivo

b) Km= 26 M, Vmx=4 U/mg, Ki= 3,9 Mc) no afecta

31- Mec n 1 k1= 0,02 M32- El medicamento produce un cambio en la cintica de la enzima, convirtindola

de hiperblica en sigmoidea. No se podra utilizar ya que a la concentracin intracelularde sustrato la velocidad de formacin de producto es mayor con el reactivo que sin el.Inh reversible: (arbitrario) 5,5,5,5Inh irreversible: (arbitrario) 4,3,2,1

33- K= 25 mM, Vmx= 100 mol/l/min, [S]0,5= 5 mM34- 235- 336- El frmaco produce un cambio en la cintica de la enzima, convirtindola de

hiperblica en sigmoidea.Sin frmaco: Vmax= 18,2 U/mg; Km= 0,59 mM.Con frmaco: nap= 2 ; [S] 0,5= 1,58 mM ; K= 2,51 mM

Grficas de Lineaweaver Burk

Inhibidor reversible competitivo

Inhibidor reversible no competitivo

Inhibidor reversible acompetitivo


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Grficas de Dixon Grficas de Cornish-Bowden


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Inhibicin irreversible

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Guia de Problemas de Enzimologia y Cinetica Enzimatica