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1

ENZIMAS

1

Las enzimas son proteínas

� Catalizan reacciones químicas necesariaspara la sobrevivencia celular

� Sin las enzimas los procesos biológicosserían tan lentos que las células no podríanexistir.

� Las enzimas pueden actuar dentro de lacélula , fuera de ésta, y en el tubo de ensayo.

E + SE + S�������� ESES��������EP EP �������� E + PE + P

E E E E

2

La enzima disminuye la energía de activación

Tiempo de la reacción

E + S

E + P

Sin enzimaCon enzima

• La Ea de la hidrólisis de la urea baja de 30 a 11 kcal/mol con la acción de las enzimas, acelerando la reacción 1014 x

• El aumento de temperaturanecesario para producir la reacción no catalizada seria de 529ºC

3

Enzima - Catalizador

� Tanto la enzima como el catalizadoraceleran la velocidad de una reacciónquímica.

� Una enzima puede transformar 1000moléculas de sustrato/ segundo

� Las enzimas tienen 3 propiedades que loscatalizadores NO tienen

• Especificidad por el sustrato

• Se inactivan por desnaturación

• Pueden ser reguladas

4

� Las enzimas se unen a los reactivos(sustratos) reduciendo la energía deactivación

� Cada enzima tiene una forma únicacon un sitio o centro activo en el quese une al sustrato

� Después de la reacción, enzimas yproductos se separan.

� Las moléculas enzimáticas no hancambiado después de participar en lareacción

5

Las enzimas cumplen su papel catalítico gracias a:

• Fijación estereoquímica complementaria del

sustrato

• Transformación catalítica del mismo

En ambas funciones participan:

• Cadenas laterales de los aminoácidos

• Grupos o moléculas no proteicas:

� Grupos prostéticos

� Iones metálicos

� Cofactores

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2

Los siguientes hechos:� Especificidad de la reacción enzimática� Carácter heterogéneo de la catálisis enzimática

Nos llevan a postular la existencia de un CentroActivo en la molécula de enzima, capaz de:

� Fijar específicamente al sustrato� Transformarlo catalíticamente.

7

Enzima

Sitio activoSitio activo

SustratoSustrato

8

� Complementariedad geométrica

� Complementariedad de cargas, unionesiónicas

� Modelos:

� Encaje inducido

� Llave – cerradura.

� Estado de transición

La unión del sustrato es muy específica

9

Teorías de la acción enzimática, 1

Modelo de Llave y CerraduraModelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer)(Emil Fischer)

Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecífica,

de la misma manera que una llave se ajusta a su

cerradura.

Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy se

considera insuficiente al no explicar algunos fenómenos

de la inhibición enzimática

10

Teorías de la acción enzimática, 2

Modelo de Ajuste InducidoModelo de Ajuste Inducido (Koshland)(Koshland)

Tanto la enzima como el substrato sufren una alteración

en su estructura por el hecho físico de la unión.

Está mucho más de acuerdo con todos los datos

experimentales conocidos hasta el momento.

11

Teorías de la acción enzimática, 3

La teoría del Ajuste Inducido se amplía en la actualidad

definiendo la acción enzimática como

Estabilización del Estado de TransiciónEstabilización del Estado de Transición

Según lo cual, el Centro Activo enzimático es en realidad

complementario no al substrato o al producto, sino al

estado de transición entre ambos.

12

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3

Una enzima puede unir dos sustratos en su sitio activo

13

Cinética Enzimática

14

Cinética Enzimática

� La cinética enzimática es el análisis cuantitativo del efecto de cada uno de los factores que intervienen en la actividad enzimática, que se evalúa a través de la velocidad de la reacción catalizada.

� Las variables más importantes son:

• Concentración de enzima, sustratos y productos (incluyendo inhibidores y/o activadores)

• pH

• Temperatura

15

� Ella está basada en la medición de la velocidad de reacción. Así en la reacción:

� Se tendrá:

� La velocidad de reacción (pendiente) disminuye continuamente a partir de unvalor máximo inicial. Esto se puede deber a:

� Desaturación de la enzima con sustrato, por disminución de laconcentración del sustrato

� Inactivación de la enzima por su inherente inestabilidad

� Inhibición por el producto

� Desplazamiento del equilibrio, si la reacción es reversible

dt

ds

dt

dpv −==

ES P

16

Baja concentración de sustrato

ALTA concentración de sustratoSATURACION

17

v

[s]

Efecto de la concentración de substrato

.

..

. . . . .

18

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4

dt

t

s

p[ ]

Concepto de velocidad inicial

d[P]v = , t 0

19

E + S ES E + Pk+1

k-1

k+2

Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante:

Hay un número limitado de sitios en la enzima para

fijar el sustrato; una vez que están ocupados todos,

por mucho que aumente la concentración de sustrato,

la velocidad permanecerá constante tendiendo a un

valor asintótico

20

El sistema de ecuaciones diferenciales que describe la dinámica

del sistema

E + S ES E + Pk+1

k-1

k+2

Sistema No admite solución analítica.

- Simulaciones numéricas

- Hipótesis que lo simplifiquen

21

Hipótesis de Michaelis Hipótesis de Michaelis -- MentenMenten

E + S ES E + Pk+1

k-1

k+2

- La primera parte del mecanismo,

E + S ESk+1

k-1Tiene lugar mucho más rápidamente que la segunda:

ES E + Pk+2

22

[ ][ ]

[ ]

( )K

E S

ES

es

x

e x s

xm = = =−0

xe s

K sm

=+

0

vk e s

K sm

=+

+2 0

k e V+

=2 0 max

vV s

K sm

=+

max

Hipótesis de

Michaelis-Menten

Equilibrio rápido

v k x= +2

23

Hipótesis de estado estacionarioHipótesis de estado estacionario

Según veíamos en la simulación numérica, hay un tiempo

relativamente prolongado en el curso de la reacción en el

que la variación de complejo [ES] es prácticamente igual

a cero:

dx/dt = k+1es - (k-1 + k+2) x = 0

A partir de esta expresión podemos llegar a obtener una

expresión que nos da la velocidad para la concentración

de substrato

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5

( )dx

dtk es k k x= = − +

+ − +0 1 1 2

( ) ( )k es k e x s k k x+ + − +

= − = +1 1 0 1 2

xe s

k k

ks

e s

K sm

=+

+

=+− +

+

0

1 2

1

0

vV s

K sm

=+

max

v k x=+2

k e V+ =2 0 max

Hipótesis de

estado estacionario

25

A partir de las suposiciones de Michaelis-Menten y

Estado estacionario, llegamos a la ecuación

Km + sv =

Vmax * s

La única diferencia radica en el significado de Km:

Km = k-1/k+1 en mecanismo de M.M.

Km = (k-1 + k+2)/k+1 en mecanismo de E.E.

26

Significado de la constante Km

1. Constante de equilibrio de disociación del complejo ES

(en condiciones de equilibrio rápido)

2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato

(en condiciones de equilibrio rápido)

3. Mide la función de fijación (en cond. de equilibrio rápido)

4. Concentración de sustrato para la que la velocidad se hace

igual a la mitad de la máxima (s0.5)

Se define para una pareja enzima-sustrato

Se mide en unidades de concentración

27

Significado de la constante Vmax = k+2 e0

1. Velocidad asintótica para s

2. Directamente proporcional a la concentración de

enzima (hoy se prefiere caracterizar a la enzima

por k+2)

3. Mide la función de transformación catalítica

4. Se expresa en unidades de velocidad

28

Modelo Cinético de Michaelis Menten

E + S ES E + Pk+1

k2

k3

29

V1 = k1[E][S]

V2 = k2 [ES]

V3 = k3 [ES]

En el equilibrio la V de formación de ES es igual a la

velocidad de descomposición

V1 = V2 + V3

k1[S][E] = (k2 + k3) [ES]

[E] = [ET] – [ES][ES] = [ET] [S] / (Km + [S])

Km = (k2 + k3) / k1

Según la hipótesis del estado estacionario, la [ES] es pequeña y constante a lo largo de la reacción

Leonor Michaelis

(1875-1949)

Maud Menten

(1879-1960)

producto

sustrato

enzimaES

Modelo de la reacción)

Modelo cinético de Michaelis-Menten

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Verificación del modelo cinético de Michaelis-Menten

Cuando la [S] es pequeña, la reacción

enzimática es de orden 1

Cuando la [S] es grande, la reacción

enzimática es de orden 0

Relación entre Km y VmaxMichaelis y Menten

Concentración de Sustrato [S]

Ve

loc

ida

d d

e la

re

ac

ció

n (

v)

Km

Vmax

Vmax/2

La Km es la concentración de sustrato donde se obtiene la mitad de la Vmax

32

Estimación gráfica de los parámetros cinéticos

Concentración de Sustrato [S]

Ve

loc

ida

d d

e la

re

ac

ció

n (

v)

Km

Vmax

Vmax/2

A mayor Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustratoA menor Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato

33

R eprese ntac ión d irec ta

s

0 20 40 60 80 100

v

0

20

40

60

80

100

Km

Vmax

vV s

K s

mx

m

=+

34

Representación de Lineweaver-Burk (doble recíproca)

Representación doble recíproca

(1/v vs. 1/[S])

Representación de Lineweaver-Burk

Cálculo de KM y Vmax (método alternativo)

1/v vs. 1/[S]v vs. [S]

La estimación de los parámetros cinéticos se

hace a partir de una línea recta y permite

calcular KM y Vmax con mayor exactitud

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7

1/s

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

1 1 1

v

K

V s V

m

mx mx

= ⋅ +-1/Km

1/Vmax

Representación Lineweaver-Burke

37

s-20 0 20 40 60 80 100 120

s/v

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

s

v Vs

K

Vmx

m

mx

= ⋅ +1

-Km

Representación Hanes

38

v/s0 2 4 6 8 10 12 14 16

v

0

20

40

60

80

100

v Kv

sVm mx= − ⋅ +

Vmax

Representación de Eadie-Hofstee

39

Métodos de linealización para determinación parámetros cinéticos

Método Eje Y Eje X Intercepto

Eje Y

Intercepto

Eje x

Pendiente

Lineweaver-Burke

1/v 1/s 1/V -1/K K/V

Hanes s/v s K/V -K 1/V

Eadie-Hofstee

v v/s V V/K -K

40

Definición Actividad Enzimática

� Es el número de moles de sustrato quereaccionan para formar producto, por mol deenzima y por unidad de tiempo. Esto suponeque la enzima está plenamente saturada consustrato y por tanto que la reacción se efectúacon su máxima rapidez

� El índice de recambio muestra la eficienciaimpresionante de la catálisis enzimática

41

Efecto del pH en la ENZIMAEfecto del pH en la ENZIMA

Cada enzima tiene un pH óptimo para su actividadCada enzima tiene un pH óptimo para su actividadEl pH afecta las interacciones iónicasEl pH afecta las interacciones iónicas

42

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8

1. Sobre la fijación del substrato al centro activo:

- Grupos disociables de la enzima

- Grupos disociables del substrato

2. Sobre la transformación catalítica del substrato

3. Sobre la estructura de la proteína enzimática

Efecto del pH

43

En el efecto de la temperatura hay dos posibles mecanismos:

1. Aceleración de la reacción según la ecuación

de Arrhenius

k = A exp (-Ea/RT)

2. Desnaturalización térmica de la proteína

44

Efecto de la temperatura en la ENZIMAEfecto de la temperatura en la ENZIMA

Cada enzima tiene una temperatura óptima.Cada enzima tiene una temperatura óptima.

Temperatura

15º 40º 75º

Aumento de la velocidad

Desnaturación por calor

45

ORGANISMOS TERMÓFILOS

� Son organismos que viven a altas tº y realizansus reacciones enzimáticas a estas altas tº

� Ejemplos son los que viven en las aguastermales

� Es tema de investigación el aislamiento de lasenzimas de estos organismos para desarrollarprocesos industriales en condiciones másextremas

46

CoenzimasCoenzimas

�� Las coenzimas son pequeñas moléculas Las coenzimas son pequeñas moléculas orgánicas, que se orgánicas, que se unen unen a la enzima.a la enzima.

�� Las coenzimas colaboran en la reacción Las coenzimas colaboran en la reacción enzimática recibiendo transitoriamente enzimática recibiendo transitoriamente algún grupo químico: Halgún grupo químico: H+ + , OH, CH, OH, CH33 . .

�� La enzima sin la coenzima recibe el nombre La enzima sin la coenzima recibe el nombre de APOENZIMAde APOENZIMA

47

El NAD es una coenzima aceptora de H

Sustrato oxidado

48

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9

Algunas enzimas requieren metales para Algunas enzimas requieren metales para mejorar su actividad mejorar su actividad

49

� Así esta actividad corresponde al máximo potencialcatalítico que las enzimas poseen para un determinadoconjunto de condiciones ambientales. Luego, estasdeben ser consideradas en las expresiones matemáticasrepresentativas del proceso enzimático.

� Existen situaciones (sustratos heterogéneos) donde lavelocidad inicial de reacción no es representativa del realpotencial catalítico de la enzima.

� Se asume que la velocidad inicial de reacción esproporcional a la concentración de proteína enzimática.

50

Inhibición enzimática

51

Inhibidor:

Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través de

interacciones con el centro activo u otros centros específicos

(alostéricos).

Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan a la

enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática.

De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:

I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo

II. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la

molécula, causando un cambio conformacional con

repercusión negativa en la actividad enzimática.

52

Inhibición enzimática isostérica

53

Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre,

con el complejo enzima-substrato o con ambos:

E + I EI

2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:

E + I E’

ES + I ESI

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10

Inhibición reversible

(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre,

impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo

haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la

fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción

catalítica: Inhibición No Competitiva

(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato

una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo

se conoce como Inhibición Anticompetitiva

55

Inhibición Competitiva

56

Inhibidores Competitivos

� Compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima

� Se une solo a la enzima libre� V máx no se altera y K M cambia

57

Inhibición competitivaInhibición competitiva

AlAl aumentaraumentar lala cantidadcantidaddede SUSTRATOSUSTRATO elelinhibidorinhibidor competitivocompetitivo esesdesplazadodesplazado yy sese formaformaproductoproducto

58

59

E ES

EI

I

S

E + P

Características:

- Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente exclusivas

- A muy altas concentraciones de sustrato desaparece la inhibición

- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del

sustrato.

- El inhibidor es tan específico como el sustrato

Se define una constante de

equilibrio de disociación del

inhibidor:Ki =

[E] [I]

[EI]

60

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11

En condiciones de equilibrio rápido, llamando y a la concentración

del complejo EI, para la inhibición competitiva obtenemos el siste-

ma de ecuaciones

vV s

Ki

Ks

mx

m

i

=

+

+1

Ke x y s

x

Ke x y i

y

m

i

=− −

=− −

( )

( )

0

0

Que resuelto para x nos da

xe s

Ki

Ksm

i

=

+

+

0

1

De donde

61

Por tanto, en la inhibición competitiva,

1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la

Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki)

2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy

altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor

3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia

del inhibidor competitivo.

62

KmSin

inhibidor

Kmcon

inhibidor

Sin inhibidor

Con inhibidor

El inhibidor competitivo aumenta la Km

63

1/s-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

-1/Km

-1/(Km(1 + i/Ki))

1/Vmax

Inhibición competitiva - Representación recíproca doble

64

Ejemplo Inhibidor Competitivo

� Ácido succínico + FAD == ácido fumárico + FADH2

� El inhibidor competitivo es el ácido malónico

� Es un análogo estructuralmente parecido al ácido succínico

65

Ácido Fólico y Sulfanilamida

� La sulfanilamida es un análogo estructural del ácido p - aminobenzoico (PABA)

� PABA es el punto de partida para la síntesis de ácido fólico en las bacterias

� El ácido fólico es una vitamina esencial para la proliferación (división) bacteriana

� Sulfanilamida se usa en el tratamiento algunas infecciones

66

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12

Metotrexato y Dihidrofolato

� El ácido fólico en sus formas de dihidro y tetrahidrofolato es coenzima de la reacción catalizada por la dihidrofolato reductasa

� Esta reacción es parte del metabolismo de los nucleótidos para la síntesis de DNA

� Metotrexato se usa en la terapia de algunos cánceres, inhibiendo la síntesis de DNA

67

Inhibidor competitivosu estructura es similar a la del sustrato

No se forma producto

68

Inhibición No Competitiva

69

Inhibidor No Competitivo

� Se une a un lugar diferente del sitio activo la enzima

� Se une a la enzima libre y también al complejo enzima-sustrato

� Por acción del inhibidor disminuye la Vm

pero el valor de Km no se altera

70

Inhibición NO competitivaInhibición NO competitivaInhibición NO competitivaInhibición NO competitiva

71

Inhibidor NO competitivoInhibidor NO competitivo

El inhibidor NO competitivo se une a la enzima en un sitio diferente del sitio activo

72

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13

73

E ES

EI

I

S

E + P

I

ESI

SInhibición

No Competitiva

Características:

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E

y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI

ni el complejo ESI son productivos

74

75

Inhibición Acompetitiva o Incompetitiva

76

Inhibidor AcompetitivoEn este tipo de inhibición el inhibidor se enlaza al centroactivo pero solo después de que el sustrato lo haya hecho y,por tanto, inhibidor y sustrato no compiten. De esta manera,aunque todo el sustrato esté saturando la enzima y toda laenzima esté como complejo ES, el inhibidor puedeenlazarse produciendo un complejo inactivo ESI.

Como I solo se une a ES estimula la formación de ES y, portanto, incrementa la unión del sustrato a la enzima,disminuyendo Km . Sin embargo, el complejo ESI noconduce a productos y Vm disminuye.

77

Inhibidor Acompetitivo

� Se une a un lugar diferente del sitio activo de la enzima

� Se une sólo al complejo enzima-sustrato� Los efectos que tiene: disminuye el valor

de Km y también el de Vmáx

78

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E ES

S

E + PI

ESI

Inhibición

Anticompetitiva

El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES;

el complejo ESI no es productivo

79

Modelo Kap Vap

Inh comp Km(1+i/Ki) Vm

Inh no comp total Km Vm/(1+i/Ki)

Inh acomp Km/(1+i/Ki) Vm/(1+i/Ki)

Determinación de parámetros cinéticos de inhibición

80

Inhibición Irreversible

- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo

químico de la enzima, modificándola covalentemente

- Su acción no se describe por una constante de equilibrio Ki,

sino por una constante de velocidad ki:

E + I E’

- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los

inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación

del inhibidor.

- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente

tóxicos.

81

Inhibidores Irreversibles

� Producen inactivación permanente de laactividad enzimática

� Se interfiere con el normal desarrollo deuna reacción o vía metabólica

� Ejemplos: p-cloromercuribenzoato,yodoacetato, diisopropilfluorfosfato

82

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

83

Inhibición enzimática alosterica

84

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Enzimas Alostéricas

� Son enzimas cuya estructura proteica está formadade varias subunidades

� No se rigen por la cinética de M - M� Además del sitio o centro activo tienen sitios

alostéricos o de regulación� Sitio activo/sustratos;� Sitio alostérico/moduladores o reguladores� La relación entre la velocidad de reacción y la

concentración de sustrato sigue cinética sigmoídea

85

Enzimas alostéricas

� Las enzimas alostéricaspresentan estructuracuaternaria.

� Tienen diferentes sitiosactivos, unen mas de unamolécula de sustrato

� La unión del sustrato escooperativa

� la curva de velocidadpresenta una formasigmoidal

86

87

Concepto de Cooperatividad

� La unión de los sustratos al sitio activo deuna subunidad produce un cambioconformacional que por contacto físico setransmite a las subunidades vecinas,facilitando las interacciones

� Modelos de unión: secuencial y concertado� Ejemplos: unión Hb-O2, enzimas alostéricas

y sus sustratos

88

Moduladores Alostéricos

� También reciben el nombre de efectoresy pueden ser positivos o negativos

� Se unen al sitio alostérico que puedeestar en la misma subunidad que tieneal sitio activo o en las subunidadesregulatorias

� Su unión produce un cambioconformacional que afecta al sitio activo

89

Aspartato Transcarbamilasa

� Ác L-asp + Carbamil-P === Carbamil-asp + Pi . Primera reacción en la síntesis de pirimidinas

� Efector positivo: CTP Efector negativo: ATP

� Tiene dos subunidades catalíticas para los sustratos y tres subunidades regulatorias para los efectores

90

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91

RESUMENRESUMEN

�� LasLas enzimasenzimas sonson proteínasproteínas queque catalizancatalizanlaslas reaccionesreacciones biológicasbiológicas

�� PresentanPresentan especificidadespecificidad porpor susu sustratosustrato�� CadaCada enzimaenzima presentapresenta dosdos parámetrosparámetros

importantesimportantes VmaxVmax (saturación(saturación dede lalaenzima)enzima) yy lala KmKm (medida(medida dede lala afinidadafinidadporpor elel sustrato)sustrato)

92

RESUMENRESUMEN

�� LaLa actividadactividad enzimáticaenzimática puedepuede serserinhibida,inhibida, porpor inhibidoresinhibidores competitivoscompetitivos(similares(similares alal sustrato)sustrato) oo porpor inhibidoresinhibidoresnono competitivoscompetitivos..

�� LaLa temperaturatemperatura yy elel pHpH afectanafectan aa lalaenzimaenzima enen susu actividadactividad catalíticacatalítica..

�� AlgunasAlgunas enzimasenzimas requierenrequieren dedecoenzimascoenzimas y/oy/o cofactorescofactores parapara susuactividadactividad..

93 94