4
Kontinuierliche Nitratreduktion mit immobilisierten Mikroorganismen AXEL RATHJEN * , UND MARKUS HASCH Herrn Prof. Dr.-Ing. habil. HELMAR SCHUBERT zum 65. Geburtstag 1 Problemstellung Nitrat gilt als unerwünschter Bestandteil unserer Nahrung, auch wenn in jüngster Zeit die Ansicht vertreten wird, dass eine Warnung vor dem Verzehr nitrathaltiger Lebensmittel nicht gerechtfertigt sei [1, 2]. Die Gründe für die Besorgnis um die Gesundheit wurden in einem Statusbericht ¹Nitrat, Nitrit, Nitrosamineª referiert [3]. Ungeachtet des Meinungs- spektrums hinsichtlich seiner Bedenklichkeit haben die Verordnungen über zulässige Nitrat-Höchstmengen in Trinkwasser, diätetischen Lebensmitteln, Kleinkindnahrung sowie in frischem und tiefgekühltem Spinat weiterhin Gül- tigkeit. Zeitweise können diese Grenzwerte nur eingehalten werden, wenn hochbelastete Partien der Rohware entweder verworfen oder beispielsweise während des Blanchierens durch Verdünnung des Heiûwasserbads mit Frischwasser in ihrem Nitratgehalt reduziert werden. Hierbei gehen jedoch auch wertgebende Inhaltsstoffe verloren. Aus wirtschaft- lichen und ökologischen Gründen besteht deshalb ein Inte- resse an der Entwicklung eines Verfahrens, mit dessen Hilfe sich das Nitrat selektiv entfernen lässt. Vielversprechend erscheinen mikrobiologische Verfahren, nachdem in dem Bakterium Paracoccus denitrificans DSM 65 (neue Bezeich- nung: P. pantotrophus) ein Typstamm gefunden wurde, der bei vergleichsweise hoher Nitratabbauleistung im Gegen- satz zu anderen untersuchten Organismen keine interme- diäre Nitrit-Akkumulation zeigte [4]. Zwar sollen die Bakte- rien in engen Kontakt mit dem flüssigen Lebensmittel kommen, jedoch aus sensorischen Gründen nicht in gröûe- ren Mengen darin verbleiben. Für die räumliche Abgrenzung der Mikroorganis- men wurde die Membranabtrennung einer Submerskultur [5, 6] sowie als Alternative dazu der Einschluss in feste Gele aus Na-Alginat und k-Carrageen untersucht [7]. Nach den bisher vorliegenden Erfahrungen bietet die Geleinschluss- methode grundsätzlich die Möglichkeit, das bioaktive Gel in Form von einfach zu handhabenden Kartuschen herzustel- len und zu vertreiben, die im Anwendungsbetrieb nur noch in einen bestehenden Flüssigkeitskreislauf integriert zu werden brauchen. Die Versuche sollten zeigen, ob derartige Gelbioreaktoren über einen längeren Zeitraum hinweg war- tungsfrei betrieben werden können. 2 Versuchsaufbau und Versuchs- durchführung 2.1 Versuchsaufbau Dem Ziel des Vorhabens entsprechend, den kontinuier- lichen Nitratabbau während einer möglichst langen Be- triebszeit verfolgen zu können, wurde der Bioreaktor (1) (s. Abb. 1) in einen Flüssigkeitskreislauf integriert. Ein Klein- fermenter (2) mit Steuereinheit (2a) diente auûer der Tem- perierung der zirkulierenden Modelllösung vor allem der Überwachung des Prozesses durch Sensoren (pH-Wert, Re- dox-Potential, Sauerstoffgehalt) und der kontinuierlichen Dosierung (2b) der Nitrat- bzw. Nährstofflösungen (Glucose und Spurenelemente [4]) sowie von pH-Korrekturmitteln (2c). Über einen Mikrofilter (3) wurde ein kontinuierlicher Probenstrom entnommen und in der HPLC-Anlage (4a bis 4d: Pumpe, Säule, Detektor, Eluenten-Recycler) analysiert [8]. Um die Menge der während eines bestimmten Zeit- raums freigesetzten Zellen zu ermitteln, wurde zeitweise eine Hochgeschwindigkeits-Durchlaufzentrifuge (5) an den Kreislauf angeschlossen. Als Bioreaktoren wurden Gelblöcke aus k-Carra- geen (GENUGEL X-0909, Firma CP Kelco, Gel-Konzentra- tion: 3% w/w, bezogen auf die bakterienfreie Lösung) mit zwei unterschiedlichen Längen und Querschnittformen ein- gesetzt (s. Abb. 2 bzw. Tab. 1). Ihre Herstellung erfolgt durch Formguss einer bei 121C autoklavierten Gelschmelze, de- ren Erstarrungstemperatur durch Zugabe von Kaliumionen (hier: 0,1 % w/w) eingestellt werden kann [9]. Das ange- wärmte Bakterienkonzentrat (P. pantotrophus DSM 65, Abbildung 1. Flüssigkeitskreislauf mit Online-HPLC-Analytik. M M PC 2a 2 5 3 1 2b 2c 4d 4c 4b 4a 4 Abbildung 2. Gelblock-Bioreaktoren (Querschnitt) Typ I (li) bzw. Typ II (re). 2.9 5 13 60 50 5 ....................................................................................... * Dipl.-Ing. A. RATHJEN ([email protected]), Dipl.-Ing. (FH) M. HASCH , Bundesfor- schungsanstalt für Ernährung und Lebens- mittel (BFEL), Standort Karlsruhe, Institut für Verfahrenstechnik (IVT), Haid-und- Neu-Straûe 9, D-76131 Karlsruhe, Germany. Mikroorganismen 479 Chemie Ingenieur Technik 2004, 76, No. 4 Life Sciences and Engineering 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim DOI: 10.1002/cite.200403377

Kontinuierliche Nitratreduktion mit immobilisierten Mikroorganismen

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Kontinuierliche Nitratreduktion mit immobilisierten Mikroorganismen

������������� ���� ���������� ����������������� �������� ������

� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � ! � � ! " �

����� #��$% �%&'��% � ��% � � ��� � ! " � � ( � �� )�� *+% ,������� �

� ������������

������ ���� ��� ��� ������ ���������� ����� ��������� �� � � ����� ���� ��� ������ �������� ����� ������� ���� ��� ��� ������� ������������� ��������������� �������������� ��� � � !"# $�� %� �� � � ��� ��������� ��� %������� ���� � ���� &����������� '�������������� ����������( ��������� �)"# *�������� ��� +����,�-�.���� ����������� ����� ����.����.��� ���� ����������� ��� ��/����� ������,01�������� �2��.������� ��/�������� ������������ 3���.����������� � �������� � ������. ����� &-��� �������� % �,���.���# ��������� .1� ����� %�������� � ��������������� �� ������������� 4����� ��� 5������ ��������������� ���� ����-��������� �/���� ��� �������������� ���� � ��� 0��6���������� ��� 7����������� ������ ������������ �������� �����# 0������ ���� ��������� ���������� 8����������� �������# �� ����������,����� � 1.��������� %� �� ������� ������� �� 8��,����� � ��� 9����.�� ���� ���������� ��� ����� 0�������� ��� ������ ����.��� ������ �/���# ��������-�������������� ��.������������� ��������� ������ � �����.����� ���������� ����� ���� $&+ :; <�� �������,�= �� �����������> �� 2?-����� ����� ����� ������ ��������������� ����� ���������������� �� %���,���� � ����� �������� @������� .��� ������,��/�� ������,�..������ ������ �A"# ���� ����� ��� ��.��,��� � ��� 3���.� ��� ��� �� ����� �����������.����� ������ �� ���������� %� �� ���� � ��16�,�� +��� ���� ���������#

7 � ��� �/������ ������� ��� +�.��������,�� ���� ��� +����������� ���� &�����.����;� :" ����� ��� ���������� ��� ��� 9������� � ����� %����� ��,������ � �,B������� ������� �C"# ���� �������� ���������� 9������� ������ ��� %����������,������� ����/������ ��� +1�����.���� ��� ����.���� %�� �7��� �� ������ � ��������� 3������� ��������,�� � � ���������� ��� �� ������������� � ���� ��� ��������� 7� ����.����.������� ��������� ������ ������# $�� ������� ������ ������ �� ���������%��������.���� ��� ��� �/���� ������� ����� ���,������� �������� ����� .1�#

� ������������ ��� ������������������

��� ������������

$�� ���� ��� �������� ���-������� �� .������,����� ���������� �/���� ���� �1������� ���� ��,���������� �������� � .1�� ���� ��� ������.��� < > <�#���# > � ��� 7� ����.����.������� ���������# 9� 3���,�������� <!> ��� &���������� <!�> ����� �6�� ��� 2��,-������ ��� ���.������� +������1�� ��� ����� ���D�������� ��� 4�������� ���� &����� <-0,����� 5�,��E,4�������� &��������������> � ��� .�����������$������ <!�> ��� ������, ���# �/��������1��� <%������ &-��������� �A"> ����� �� -0,3����.��������<!�># D��� ��� +�.�������� <)> ���� �� .������������4��������� ������ � � ��� 04�B,����� <A� ���A�= 4�-�� &/��� $���.���� 9����,5��?����> ���?������F"# *� ��� +��� ��� �/���� ���� ��������� ����,���� ������������ ����� � ��������� ���� ������������ 0�������������.����,$�������������� <;> � ��3������� �����������#

��� ������.���� ���� %����1�.� �� �,B����,��� <%9�*%9� G,HIHI� 7���� �� ������ %��,3������,���= )J �K�� ������ �� ��� ��.���������� �1��> ������� �������������� �/�� � L������������� ��,������� <�# ���# ! ���# 2��# ># 8��� 0�������� ������� ����7������ ���� ��� ! MB ���.�������� %����������� ��,�� 9�����������-����� ���� ����� �� 3�������<����= H� J �K�> ���������� ����� .� �I"# $�� ���,�/���� ��.�����.������� <�� ����������� $&+ :;�

��������� ������������������ �� ��������������������

M

M

PC

2a

2

5

31

2b 2c

4d 4c 4b

4a

4

��������� ������������������� ������ ��! "�# $ ���! �%&� "�# $$ ��!�

2.9 5

13

6050

5

N $�-�#,8�# � % � ��� � �� <�E��#������O����#��>�$�-�#,8�# <70> � % �� ! "� � �������,����������� � � 9�/��� � �����,������ <�79�>� &������ 3�������� 8������ � ��������������. <8�2>� 0���,�,��,&���6� I� $,C: ) 3�������� %����?#

� � � � � � � � � � � � � ACI������ ������� ������ '(()� ��� ��� �

������������

�������� ���

� ���� ��������� ��� � !�"� # ��� $! %� ��������*�$+ &��&���'�� (�������))��

Page 2: Kontinuierliche Nitratreduktion mit immobilisierten Mikroorganismen

AH MB> ���� ��� ��� �� ��# ;; MB ����. ���� &������� ��,���� ���������# ���� ��� 9������� � 9�������� <H MB>� �������6���� �����/��� ��� 3������������1��<C MB> ���/�� �� ��� ��� 2��-������ �� ��� � ); MB��������� ������� ����.� ��� �� ���������� 3�/���������� ���# 8 ���� ��� �, � ���������� �����,��� ���/���� ������� ���� ��� ������.��� ��� ����� ���P�� � ������� � H"� ������ ��� ��.������������%��.1�-�� ���/�� �� 0/���� �� ����� ��������� <�����,����������> � ����� � ���� F:J �� ������ �������#

��� �����������������

$�� �� �� ������1����� %��6.��� �������� � �3������������1�� <!J �K�> ������/����� %����1�.����� ��� ����6���� ������ �����- �� � ���� ���,����������� ���/�� � ��� �� 4++� ���������� �?�����,���� ���������/���� ����-����# 7 � �� %������. ���2?- 8 �E������� ��� �-������ ������������ �������������,��� ��� ��� � &��1��������� ��� � ���������7���� � �/������� ) 3�/�� ������� �� .����� &������������# $�� ���� ���������� &�����/��� ��� %��,����.� ���� ���� ��� -���������� ���� ������ ���� ���,�� ������ ������ ��� ��16�� ��� ��� ��� ���-�����,�� 3�������������# $���� 3����.��� �����.�� �������� .��� ���/������ $��..�/��� �� �� &�����/������ 5��.���� ���# �� ������� ��� 3�/�� ����� .1���� ���� ���� � � ��� ������� � ���� ������ ��������,�� %������. ��� ���.�� ����� ���� -���1�� �������������� &-������� ����#

$�� %������. 2?- 88 ���� �������� ������� ��,������ &������ ���������# ���� ��� +����� ���� ���%������.���.��� ������� ���- �� � ���� &���������,����� ��� �������������� 3--��� � �� 3����,��� ����� ��# �������� ����� ���� ��� ���������2�/������ ���.������� ���� � ��� ��� 9����� ������������� �������� ��� ������ ���.����� ������,�� ����� �������� ���� ������� &������� ��� ����,������� �������# $�� 4��E���������.��� ��� 8�������,��������������� ������ ��� ���� ������� ������ �����-������� ��� &?���� ���� ��� 7����.���� ����������� �� ����-��������� �� �� %�� ��-���.� ��������3���� ��� ��������� ��������� ��� �������6����5 �.���.���� ��� ���������� 4����� ���1���������� �� ��� %������� �� 7����.���� ��� ����.�����/���� ��������������� ��.����� ������/������#

$�� ������� ����� ��� ������� ��� ������ ��,.��������� ���� ��� 5��.�������� ��� &?����� ��� ��9������� ��� ������/�� ������ ���������� ��������� ������ ��� 4������ ��������� ���� <2��-�����=)H MB� -0 C�H� 5��.���� 2?- 8 � 88 � 5���� �����������$�������,����������= C�H ��Q > ���� ��� ��� �������,��� 4��������16� ���/���� ����� ���������� ���������,$��������� <H ��� H�C ��Q > ���# ��� %�����K������,����/���� <H�! ��� H�: ���K���>#

$�� ��������� �������������� �������� ���� ���������� ��� 04�B,B������������� �� �� ����,��� ������.���������� � ��� ��� ���1���� ��,��������� ��� �/������� �, � ���� ���# $�� 9������������ �������� ���� �� ��� &�������������/��� ���%��.1�-��� ������� ���� �� ��� %�������� ���� ������������/���� ������ ���� ����� ��� $������ ��� ����,�������� 7�.��� � ��� �������� ���� �� ���.� &��������� %��� ��� 5��.������� � �������� .����# ��/������ ��� �����.�� ��� 9�?�.����. ��������� ���� ����-��������� �������� ��� ������� &������.���������,� ��� ���� ��� �������� �������� %��/���� �� ���� ����� ��� 9��������������� ����� 9���.�� ��������#

� �� �����

$�� ���������� 9������ ��� 9�-���� ��� ��������� ������� � ����� ���� ��� ��� 9������� �� ������ +�,.���������� � ��� ������������ %������. ��� +�,����� ��������� ��� ��� �� ��-��������� ������������ &?�,��� �� ������� ����� � ��� ������ � ������������ �--���� ���� ��� ����� .�� ���� ���� ����� ����������� � ���-������ .���.������� �������� ��� �� ������ ����� .� ��� �� �� ���� ���,������� ���.����� ����������� 3����?�����# ���� ��� ���,������ ���.� ��� 3����� ��� ��������� ����� � ���,��� ���� ��� � ��������� &������ �������� HH ��3���� -�� .� ������� ���� ��� ��� �� ������ %�� ,������ ��� 7��� ���#

� �� -���.���� ���� @�����/��� ��� %��,����.� ���� ��� ��� �/����� ������� ��� ����,������� � �?������� � ����� ������� <-0 C�)H MB> .��� ���/����� � ��.��� ��� �� ��� ��,������� ��� 7����.���� ��������� �/���# $��� ������ ������� ������� ��� ���/����� � �������������� ���������� 9������ ��� &�������� ��� %��.1�-������6� ���� ������ ���������� &-���� ����� ��� ������������� $������1�� ��������� � ��� ����7����.���� �������� .1��#

$�� ����������� ��� P�������� � P������������ ��� �� ������ �� !H �� ��������� 04�B,B������������� �������� ����� .��� <�# ���# )>� ��������� ���� .��� ���-����-���� ��� ��������� %����,���.�� ��� ������ ��� %������. ��� ��� ������ ������ /�������, � ������������ 4������������ � 3�,��.� �������� ����� ���# �/���� ��� ����� 2��� ������������������ .�� ��� .����������� ����������������� � ��������� ���� ��� ��� ���������� ��� 7������������������� +��� � ������ ������ ���# 9��� ������

� ����� �������� � ,���-��� ���%��� ������ �� "�.!�

%������. 2?- 8 2?- 88

���� ��� 3�/�� Q ) C

�6����������� �� ;H :H

01�� �� )H A:H

%���������� �� !;: )HH

����= %������� �� C: F)H

���������/��� �! H�H:) H� A;

�-��# ���������/��� �Q ):H CH

� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �� � � � � � � � � � � �AFH������ ������� ������ '(()� ��� ��� �

����

������

���

��

����

� ���

Page 3: Kontinuierliche Nitratreduktion mit immobilisierten Mikroorganismen

��� ���������� ������ ��������� ��������� ���� ������ ��� ������������ ������ ��# $����� �������� ��� �� ��,.� 2��� ��� ���# ) �����������# $�� ���� ����� ���� ���� ������ 4��.�1�� �� ���� �) �����-����������� ���-��,����� ������������ �� HHH �� �@) �Q ��� ��������� 5��������� <����/���� ��� ����.���������� �� %���������� ��� �����> ��� ���� ���,�������� �� �� F � ������/��� ��������� ���#

$����� � � ��� .����������� 9����� ���%������.� �������� �������� ��� +�.���������� /,����� ���� ���� ��� ���� ������� 4���� ��� ���-��� ������ ����� ��� �� ������ ��� ������� ��� ���������� ����� ��-���������� 9� .������� 4���� ������ ; �� ������ -�� ����� ��� � ���������� ������ ��.������������ &���� � ������ ���� ��� � �����������# ��� ���� *��������� ��� ���������� ���,������ ��� ��������/� ��������� ������ ������/���� ���� ��� ����� 9������ ��� ������������� ��������� �� ������� 4���� �������� <�# ���# )� ������># 8���� �-/���� 4���� ��� $����������� ���� ��� ����,������� ���� ��� ���� *��������� ��� ������������� �������� �1���� ����������� �������� � ������������ �� �� ��������������� ���� �� ; ���Q �,� �.������ <�# ���# A>#

��� �� ���# A ����������� ���� ��� ��������,����� �������� ��������� � ��� ���� ����������%�������������.��������� ��� ������1���� ��������,�� ����� � .1�# 9� ������ ����� ���� ��� 3���,������ � � �������/��� �������� .����� ������ ����,���� ���/����� ���� ��� 4���� ������ ��� ��� ������������� �������� 2����� �� ���� � � ��� �����-�� ���9������� ��� ������/�� ������ ��� �������� 3���,������ ���� ������ 8���-������ ��������� ����� �����#

$�� �� �� ��������� $��������� � ��� ��,� �.�������� ��� ������/���� ����������� ����������-��������� �������� ��� � ���# ; ��� 7.��� ��� ������,�� 3��������� �� ����������������� ���������#$�� ������ ��� ����������� &������.� ��� �� +�6 � � ���$���� ��� �������� 3���������� ������� ��� ��,����������������#

$��� ��������� �������� ��� ������,$�����,���� .��� ��� ���� �� �������� &��������-��� �������� 9�?�.����. ������� ��������� ������� ��,������ � ������.��������� ��������� � P������������������� �����#

$�� ������������ ��� ��� ��� ����������� ������ ��� 4������������ �� �������� ���/�������, ���# ������������� �� �� 4�������������������/.� ����� ������� �� ��� ����� ���� �� ��� ����,��� &������ ��� %������.� �����1��� ����� � �� 4������,.������� ������ � ���� � �� ����� @�����/��� �,����� .���� ����� ����� +�.���������� ���� ���� �� .����������� 4�������� ���������� 7���������������� ����# ��� �� �/���� ��� ������������������ ����� ��� 7��������.� ��� ���������2� �� ��� 4������������ ���� ������������ �����.���� .� ���� ������������ ������ ���� � ������� �� ��� &��1�� ���� ������� ����� ����-���������������� ��� &������.--���� ��� �������� ������� ���������� ���� ��� � ��� �������� ��������,�� �������� ���������� ���� .1�#

$�� ������� ���� ������ �������� ���� ��,������ �� ��� �.��-����� ��������������� �� %��,����.,������.��� ��� �������� .�� �� ���������������� �� ����� ������������ �� .����������� �������� ��������# ��� � �?��������� 0������ �������� ��

��������� �������������� ��������� �����#��� �/0�������%�� !/ %� ������ -�� 1.#������ �( 2 � 2 3 !�%&� �� ���� �#4��� � ��� &4 ��- ���� 5����� ���-� 6��%� � �7 2 � 2 89 !�

Nitrit

Nitrat

��������� �:�������� ��- ����� ��&�� ����%�������� ;�� 6���%&� 6�� ��� <�-������ -� 6���*�������

5 6 7Betriebsdauer / Wochen

0

400

800

Nitr

atm

g/kg

0

5

10

15

Nitr

itm

g/kg

0,2

0,6

1,0

nG

luc.

n-1

NO

3

0,0

0,6

1,2

Dos

ierr

ate

gN

O3

h-1

��������� �� 4������� -� �#�%� ��� �� 6���������� ;�� -�,��%�������

0 200 400 600 800

Konzentration / mg NO3 kg-1

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

Spe

zifis

che

Abb

aura

teg

NO

3h

-1m

-2

� � � � � � � � � � � � � AF ������ ������� ������ '(()� ��� ��� �

������������

�������� ���

Page 4: Kontinuierliche Nitratreduktion mit immobilisierten Mikroorganismen

��� ������� ����� ������� ������� ��� ��� �����%������. �1�����#

9������� �� !# 7����� !HHA �3 ))CC"

�������

� " %# +# +�3����� B# �# $��� B# �������� +# 0# �#%����� ����� �� ����� ����� ��� )AI#

�!" R# 7# $����� ���� � ��������� ����?,�B0�������� ����#

�)" 9# +�?��,+������ �� ��#� �79,5,I;,H � �������� ���� �������������� �� ��������3������� ����#

�A" 9# +�?��,+������� 0# &������� �������������� �� )A#

�;" +# 3����� 0# &������� ���� �� !��# ����� "#�): #

�:" +# ���.� 0# &������� ���� �� !��$ ����� "�� HF;#

�C" B# %�������� �# 5������ 9# +�?��,+������� 0#&������� ���%���� ����� �"� !H:#

�F" 2# ���������� �# 9# �# &-��6� ����� %���� ������������ � ������� ������ <9�= 8���# �����#�� B���# 9�# �8$B>� ���# A� !C:;$ +����� ����

�I" �# 5������ +# 0����� �# 3���-�� 2# �����������# 9# �# &-��6� � ������ �� %��� �� ��% �<9�= 5# R�����>� 4��� 8� � A � &�������� ��������4����� &�������� ����#

� H" �# 5������ +# 0����� �# 9# �# &-��6� � ���&�'(���� ���)������ *����� <9�= &# ���,���>� +���� ���� ����)����� *����� ���� H� H:� ��������������������� + ������� #

���-�������� ��� .� �$�����&������� �$ ��� .���/����0�� ( ��� ��� ������

' � , 1 � � � # � � � � � ' � � � 1 � � � � � � 2 � , ! " � 3 � � ! ������ #��$% �%&'��% � ��% � � ��� � ! " � � ( � �� )�� *+% ,������� �

� ������������

��� �������� �������� <�# ���# > ������ �� ���� � ��%���,-�������� ������.�����# 9� ���� ��������� �� ���,6� +�6���� �� 4���.��� ���� �������� �� 9�?��� ���.������ �����# � �� ��� �, � �,��?��,��� B���������� %�����,$��?��������� 6,%�������B?�����E���� ����� ������� ��������.� � 7������ � "#

$�� �����.�����/� �� �� �������� � � ���������� 4���������� ��� ����� �� ���� �� ������ 4���������������� ���������� �� ���� ������ &-�.��� �������� �/������������ ����� .��-����� �-��������/� �� �.�� ���# ������ ���������/�� 4���.��� ����������������� ��������,�� ��� ��� ���.������ ��� ����� �������� ��������,�� �� 7�������� ��� 4���.�� � ��� ������� +���,�# �� 5����� ��� 4���.�� ��� �� ������� � �������������� ��� ������ ��� ������ ���� ����,���# $�� ������������� �������� ��� ��� ������������ 7��������# $� ��� ����� ������������������ &�����,�� ��� 7��� � %�16� ��� ������ ���� ��� ���6� 9�,���� ����� ���� ��� 9����� ��� ��������������������� ��� 7��� � ��� %�16� ��� ���������� �.� � � ���������������� �������#

� !�"���#�" ��� ������������

�� ���.������ ��� ��.����� ���� ��� ���� �������,������ %��/�� � � �� ������������ �������# ����� ���� ��� 5 �����.�.���� ��� ���������# 8 ����������� ��� ����� ���� $��. � &��������-�����!" ���.������# $�� ���������� �-��������� 9����� ��,������ ���� ��� ����� >=

��-�� � �,�,H � !� �-&�- ��2+

< >

��� ��� ������ %��/� ������� �� ���� � ���0������.������������# 8 ��� ���� ��� ������-�������� 3������������������ ����� ���� &����� ���,�-���� �)"# $�� ����� ���������� �-��������� 9����� ��,������ ���� ��� �����=

��-�� � ����2+

<!>

��� ������� %��/� ���� �� *�����������������,����� ��������# 0��� ����� ��� �������� ��� ����� ��3������������������ � �� ������ ��������&����.�/��� �A"# $�� ����������� �-��������� 9����� ��,������ ���� ��� �����=

��-�� � � �-&�- ��2+

<)>

��������� �������� ��������/ �=>����>���+ 8 ���

N $�-�#,���������# ' % � ��#��� � % �1 �� � �4�������� $�#,8�# � % ! " �3� � !<�#��������O�,��#��>� 8����� � � +����,����� ��������������.� 2�������� *�,������/� ����������� ���.������� &���6�AK;� $,)F HA ����������� %����?#

> 9�� ������������ ��� 7������������������ ���� �� &����� ��� ��������#

� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �� � � � � � � � � � � �AF!������ ������� ������ '(()� ��� ��� �

����

������

���

��

����

� ���

� ���� ��������� ��� � !�"� # ��� $! %� ��������*�$+ &��&���'��(�������))�*