Upload
others
View
13
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Laboratuvar Başarısında
Kriyoprezervasyonun Rolü
Ayşen Durmaz, PhD
Ege Üniversitesi Aile Planlaması
İnfertilite Araştırma ve Uygulama
Merkezi
Tanım
Kriyoprezervasyon; hücrelerin ve dokuların
sıfır derecenin altındaki ısılara kadar
soğutularak, bütün biyolojik aktivitelerinin
durdurulması ve gelecekte kullanılması
amacıyla saklanmasını ifade eder.
(ASRM 2012)
Tarihçe
M.Ö. 2500 soğuğun medikal alanda kullanımı.
1776 Spallanzani L. kar içerisinde dondurduğu spermleri
çözdükten sonra hareketlilik gözlemiştir.
İlk kriyoprezervasyon denemeleri başarısız!
1940 yılında gliserolün sperm hücresini kriyo hasarına
karşı koruduğu keşfedilmiştir.
1953 yılında Bunge ve ark. dondurulmuş-çözülmüş insan
sperminden elde edilen ilk canlı doğumu bildirmişlerdir.
Tarihçe
1970 yılında propanediol, EG, DMSO keşfi
1972 programlanabilen dondurucuların kullanıldığı yavaş
dondurma tekniğinin geliştirilmesi
1984 dondurulmuş-çözülmüş insan embriyosundan elde
edilen ilk canlı doğum
1986 dondurulmuş-çözülmüş insan oositinden elde
edilen ilk canlı doğum
IVF Laboratuvarında Kriyoprezervasyon
Gamet (oosit ve sperm)
Testis ve over dokusu
Embriyo (2PN, Klivaj, Blastosist)
Laboratuvar Başarısında
Kriyoprezervasyonun Rolü
Laboratuvar Başarısı
Kriyoprezervasyon Başarısı
Laboratuvar Başarısı
Kullanılan indüksiyon ajanlarına
Mikromanipulasyon tekniğine
Kültür medyumunun içeriğine
Kültür ortamının pH, ısı ve osmolaritesine
Sterilite
Kriyoprezervasyon Başarısı
Gamet, zigot, ve embriyo kalitesine
Kullanılan malzemelere
Kullanılan yönteme
Yöntemi uygulayan kişinin tekniğine ve becerisine
bağlıdır.
Sterilite
Kriyoprezervasyon Hasarı
Hücre içi/dışı buz kristali oluşumu
Kimyasal toksisite
Osmotik şişme/büzüşme
Zona hasarı
Mayotik spindle hasarına ve dolayısıyla da anöploidilere
neden olmaktadır.
Kriyoprezervasyon Yöntemleri
Yavaş dondurma
Şok dondurma (ultra-rapid)
Vitrifikasyon
Yavaş Dondurma
CPA kons. düşük (1M Sukroz; 1,5M 1,2 propanediol)
-7oC’de seeding işlemi ile buz oluşumu başlatılır.
Dondurma hızı yavaş (0,3-0,5oC / dk.)
İşlem ~ 3 saat sürmektedir.
Dezavantajları
Uzun sürmesi
Pahalı olması
Buz kristali oluşturması
Şok Dondurma
Yavaş dondurma ile vitrifikasyon arasında bir yöntem
Yavaş dondurmaya göre daha hızlı ve pahalı ekipmana
gereksinim yok
Yavaş dondurmaya göre CPA kons. yüksek
Vitrifikasyona göre CPA kons. düşük
Vitrifikasyon
Herhangi bir sıvının yoğunluğunun arttırılarak buz kristali
oluşmaksızın camsı hale getirilmesi
Sıvı haldeki madde
Buz kristali oluşmadan camlaşma
Vitrifikasyon CPA konsantrasyonu yüksek (%15 EG, %15 DMSO)
Soğutma hızı yüksek (15,000 - 30,000oC/dk.)
Soğutma hızı ne kadar arttırılabilirse CPA kons.
İşlem süresi kısa (10 -15 dk.)
Buz kristali oluşmaz
Dondurma cihazına gereksinim yok.
Dezavantajı
Yüksek CPA kons. hücreler için toksiktir!!!
Hangi Yöntem?
1) Vitrifikasyon
2) Yavaş dondurma
3) Şok dondurma
Hangi Yöntem?
Vitrifikasyon-Yavaş Şok-Yavaş dondurma
Klinik gebelik oranı OR= 1,55
%95 CI=1,03-2,32
OR= 0,35
%95 CI= 0,16-0,76
Devam eden gebelik
oranı
OR= 1,82
%95 CI=1,04-3,20
OR= 0,37
%95 CI= 0,17 – 0,81
İmplantasyon oranı OR= 1,49
%95 CI=1,03-2,15 -
Yavaş dondurma - Vitrifikasyon Düşük oranda CPA
Dondurma hızı düşük
(0,3-0,5oC / dk.)
Yavaş dehidrasyona bağlı
olarak buz kristali oluşumu
İşlem süresi uzun (3 saat)
Pahalı ekipman
☻Yüksek oranda CPA
☻Dondurma hızı yüksek
(15,000-30,000oC / dk.)
☻ Buz kristali oluşmaz
☻ İşlem süresi çok kısa (10-15 dk)
☻ Dondurma cihazına ihtiyaç yok
Ege Üniversitesi IVF Lab. Sonuçları
Siklus
sayısı
Transfer
sayısı
Gebe
sayısı
Gebelik oranı
(%)
2010 yavaş
2010 vit.
55
27
42
24
9
5
21,42
20,83
2011 yavaş
2011 vit.
38
107
29
98
4
37
13,79
37,75
2012 yavaş
2012 vit.
13
121
7
111
1
48
14,28
43,24
2013 yavaş
2013 vit.
13
91
5
82
2
35
40,00
42,68
Vitirifikasyon Başarısı
1985 Rall ve Fahy fare embriyoları ile gerçekleştirilmiştir.
CPA kombinasyonu denenmiş,
Çeşitli taşıyıcı sistemler tasarlanmıştır.
Dondurma – çözme hızı
CPA konsantrasyonu
Kriyoprotektanlar
Hücre içine geçebilen
☻ DMSO, EG, PROH, Gliserol
Hücre içine geçemeyen (Sakkaritler)
☻Sukroz, Trehaloz
Makromoleküller
☻Fikol, PVP, PEG
Hücre içi su
Kriyoprotektan
CPA Seçimi
Hücre üzerine olan toksik etkisi
Diffüzyon hızı yüksek olan CPA seçilmelidir.
En çok kullanılan ve kabul edilen EG dür.
Kriyoprotektan toksisitesini azaltmak için iki farklı CPA
kombinasyonu kullanılabilir!!!
Major CPA kombinasyonu EG/DMSO kombinasyonudur.
Hücre içine geçemeyenler
Başarılı bir vitrifikasyon için gerekli olan CPA kons.
Toksik etkiyi azaltırlar
Osmotik etki
Çözme işlemleri sırasında osmotik tampon gibi
davranarak osmotik şoku engeller.
Ice
H2O
Kontrolsüz rehidrasyon sonucu şişme
Çözme Solüsyonları
1.0 M Sükroz
0.5 M Sükroz
Sükrozsuz
Çözme Solüsyonu
Dilüsyon Solüsyonu
Yıkama Solüsyonu
Makromoleküller
Fikol, PVP, PEG
Vitrifikasyonu kolaylaştırmakta
Etki mekanizmaları konusunda farklı yorumlar
bulunmaktadır.
Soğutma Hızı
Örnek hacmi ne kadar az olursa soğutma hızı
Vit. solusyonu ne kadar az olursa toksik ve ozmotik etkisi de o kadar azalır.
VitMaster sıvı azotun ısısını -205/ -210 kadar düşürür
Taşıyıcı sistemlerin ısı iletim hızları farklıdır.
Taşıyıcı Sistemler
Açık Sistemler
☺Soğutma ve ısıtma oranlarını hızlandırarak hücrelerin vitrifikasyon
solüsyonlarında tutulma zamanlarını azaltırlar.
Kapalı Sistemler
☺İzolasyon katının bulunması soğutma ve ısıtma oranlarını yavaşlatır.
Taşıyıcı Sistemler
Açık sistemler → Cryotop
→ OPS
→ Flexipet-denuding pipet
→ Hemistraw sistemi
→ Cryoloop
→ Cryoleaf
→ Elektron mikroskop grid
→ Fibre-plug
Kapalı sistemler
→ Cryotip
→ High security straw
→ Rapid-I
→ Straw-straw sistemi
→ Cryopet
Açık Sistemlerin Dezavantajı
Açık sistemlerde oosit/embriyo kaybolma ihtimali
Bakteriyel, viral ve fungal kontaminasyon riski
Kontaminasyon embriyonun in vitro yaşamını olumsuz
yönde etkiler.
Lab. da high security straw kullanmaktayız
Azot Kontaminasyonu
Azot sterilizasyonu
Azot Buharında Saklama
Oosit Kriyoprezervasyonu
Isı değişimlerine ve ekstrasellüler ozmotik basınca karşı
oldukça duyarlıdır.
Hücre içi sıvı miktarı yüksek
CPA kons. ve soğutma hızı yüksek olan vitrifikasyon!!
En uygun CPA ise EG’dur.
Literatürde 900’ün üzerinde doğum
Anomali insidansı normal
İmmatür oosit kriyoprezervasyonu
Mayotik iğcik hasarını engellemek için bir alternatif
Mayoz bölünme profaz I evresindedir
İmmatür oosit vitrifikasyonu
immatür oosit cryo + IVM
prematüre ovaryan yetmezliği ☺
İmmatür oosit vitrifikasyonu
İmmatür oosit vitrifikasyonu
→ PCO’li hastalardan alınan immatür oositlerin vitrifikasyon
yöntemi ile dondurulması sonrasında %90’ında klivaj
gördüklerini ancak implantasyon elde edemediklerini
açıklamışlardır.
Zigot Kriyoprezervasyonu
Almanya
Danimarka
İsveç
Avusturya
İsviçre
İtalya
En iyi yöntem vitrifikasyon
IVF – ICSI
IVF/ ICSI sonrası dondurulan
2PN aşamasındaki zigotlarda
benzer canlılık ve gebelik oranı
bildirilmiştir.
Zigot Kriyoprezervasyonu
Griesinger ve ark. yaptığı çalışmada dondurulan zigotların doğal
sikluslarda çözülerek transfer edildiği çalışmada embriyonun
canlılığını sürdürme oranının %77, devam eden gebelik oranının
da %36 olduğu bildirilmiştir.
Embriyo kriyoprezervasyonu
En iyi yöntem vitrifikasyon
8 hücreli embriyolarda canlılık oranı %79,2
Hücre sayısı < 6 olanlarda canlılık oranı %21,1
Canlılık oranı blastomer sayısının artmasıyla artar
Embriyo kriyoprezervasyonu
Dondurma işlemleri sırasında ZP sertlerşir
Transfer öncesi AH uygulanması gebelik ve
implantasyon oranlarını arttırır.
Blastosist Kriyoprezervasyonu
Blastosistlerdeki hücre sayısı fazla
Birkaç hücre hasar görse bile embriyonun bütünlüğü
bozulmaz
En iyi yöntem vitrifikasyon
Blastosöl sıvısının boşaltılması başarıyı arttırmaktadır.
Needle used shrinkage
Laser pulse shrinkage
Mukaida et al., 2006
Artificial Shrinkage
Blastosist Kriyoprezervasyonu
Konjenital anomali insidansı normal
Saklama Süresi
Saklama Süresi
Oosit
☺Canlılık, fertilizasyon, klivaj, embriyo kalitesi,
implantasyon ve canlı doğum
Embriyo
☺ Yaşam kapasitesi
☺ Gebelik oranları
☺ İmplantasyon oranlarına etkisi yoktur.
Tekrar dondurma
Bir kez çözünmüş embriyoların tekrar dondurulması ile ilgili çok
fazla veri olmamasına rağmen Kumasako ve ark. yaptıkları
araştırmada tekrar vitrifiye edilmelerinin belirgin bir olumsuzluk
yaratmadığını bildirmişlerdir.
KOH – Kriyoprezervasyon İlişkisi
YÜT de başarıyı gösteren en önemli parametrelerden bir tanesi implantasyondur.
→ embriyo kalitesine
→ endometriyal reseptiviteye
→ embriyo-endometriyum arasındaki ilişkiye bağlıdır.
YÜT’de implantasyon başarısızlıklarının;
→ 3/2’den endometriyum hasarı
→ 3/1’den ise embriyo sorumludur.
KOH – Kriyoprezervasyon İlişkisi
↑E2 ve P düzeyleri
endometriyum morfolojisi ve
biyokimyasını bozar.
Embriyo ile endometriyum
arasındaki senkronizasyon
bozulur.
İmplantasyon Başarısızlığı !
KOH – Kriyoprezervasyon İlişkisi
FET’de endometriyum doğal ya da doğala yakın
dozlarda ilaç kullanılarak hazırlanmaktadır.
Bu nedenle FET’de endometriyum reseptivitesi fresh
siklusa kıyasla daha iyidir.
Fresh embriyo vs. FET
KOH’nun embriyo-endometriyum senkroznizasyonu
üzerine olan olumsuz etkisinden kaçınmak için elektif
embriyo kriyoprezervasyonun yapılması
Bir sonraki siklusta endometriyum reseptivitesinin yüksek
olduğu FET’nin yapılması YÜT’de kümülatif başarıyı
arttıracaktır.
Çoğul gebeliklerin önlenmesi
KOH protokolleri → çok oosit → çok embriyo
Siklusların %60’ında transfer için uygun çok
sayıda emb.
Embriyo kriyoprezervasyonundaki başarının
artması
Transfer edilen embriyo sayısının azaltılmakta
Çoğul gebelikler önlenebilmektedir.
Fertilitenin Korunması
Bayanlar
Ciddi ovaryan hastalıklar
Kistler
Over kanserleri
Kemoterapi
Radyoterapi
Baylar
Testiküler yetmezlik
Ejakülatuvar disfonksiyon
Cerrahi girişimler
Kemoterapi
Radyoterapi
SONUÇ
Oosit kriyoprezervasyonu yerine Embriyo
kriyoprezervasyonu
Klivaj aşamasında 8 hücreli embriyo
Transfer öncesi AH yapılması
Hücre sayısı fazla olduğundan blastosist dondurma daha
avantajlı
Blastosöl sıvısının boşaltılması
Fresh embriyo transferi yerine FET yapılması
TEŞEKKÜRLER
Sperm kriyoprezervasyonu
Sıvı içeriği az olduğu için daha dayanıklıdırlar.
İnsan semeninde en çok kullanılan CPA Gliserol egg
yolk sitrattır.
Daha çok manuel yöntem tercih edilmektedir.
Motilite, Morfoloji, Fertilizasyon kapasitesi azalır.
Sperm DNA integritesi tartışmalı
Blastosist Vitrifikasyonu
Current data on the
vitrification tablo 2
Canlılık oranı (%) Gebelik oranı (%)
Oosit 54 14,2
Embriyo 67 28,2
Human Oocyte Vitrification (Kuwayama et al. Highly Efficient Vitrification of Human Oocytes. RBM
Online 11:300-308, 2005)
Parameter Result (% of # vitrified)
# oocytes vitrified 107
# Surviving (normal morphology) 86 (80%)
Fertilized (by ICSI) 77 (72%)
Blastocyst development 40 (37%)
# embryo Transfers 29 (18 D2, 11 D5)
Total # embryos transferred 64 (53 D2, 11 D5)
Avg # embryos/ transfer 2.2 (3 D2, 1 D5)
% Pregnancy (# sacs by ultrasound) 12 (41.3%)
# deliveries 7 babies (3 ongoing pregnancies)
Vit Kit™ - Freeze Solutions Basal medium is M199-H + 20% DSS
7.5% ethylene
glycol
7.5% DMSO
15% ethylene glycol
15% DMSO
0.5 M sucrose
Equilibration
Solution (ES)
Vitrification
Solution (VS)
Irvine Scientific’s Vitrification System: