LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN BAKTERI TAHAN ASAM

Senin, 12 Maret 2015

Kelompok III

Senin, Pukul 10.00 13.00 WIB

Nama NPM

Nunung nurjanah 260110130027

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Casuarina) (Sani)

PEWARNAAN TAHAN ASAM

I. Tujuan

Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan

bakteri tak tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam

pewarnaan (Ziehl-Neelsen). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia

yang terjadi dalam prosedur tersebut.

II. Prinsip

1. Penetrasi zat warna.

Penetrasi zat warna adalah suatu jalan untuk zat warna agar

dapat masuk kedalam suatu molekul maka harus bias diserap oleh

mikroorganisme tersebut.

2. Pewarnaan tahan asam

Pewarnaan tahan asam adalah tipe pewarnaan diferensial lebih

dari satu pewarnaan untuk membedakan suatu mikroorganisme dengan

kandungan dinding sel peptidoglikan serta disusun lebih dari 60%

lipid kompleks yang tahan terhadap dekolorasi dengan alcohol asam.

3. Pemanasan.

Pemanasan ini biasanya diperlukan untuk memperkuat

penetrasi pewarna dasar ke dalam sel bakter.sehingga semua tipe sel

akan terwarnai oleh pewarna dasar.

4. Impermeabilitas dinding sel bakteri tahan asam

Dinding sel hidrofobik dan impermeabel terhadap perwarnaan

dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika proses

pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam

sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam.

III. Teori Dasar

Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri

yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel

yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang

ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA

antara lain Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis,

Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae.

Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan

penyakit tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai

bakteri tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi

melalui jalan pernafasan (Syahrurachman, 1994).

Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai

dengan pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan

dengan pemanasan. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena

mengandung sejumlah besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya

dapat diwarnai dengan pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel

hidrofobik dan impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada

cairan atau larutan encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini

melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri

tahan asam (Ball, 1997).

Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau

berbentuk filamen. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non

motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif. Namun, ketika

Mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak

dapat dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria disebut

sebagai Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang

juga memiliki sifat tahan asam, yaitu spesies Nicardia, Rhodococcus,

Legionella micdadei, dan protozoa Isospora dan Cryptosporidium. Pada

dinding sel mycobacteria, lemak berhubungan dengan arabinogalaktan dan

peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini menurunkan permeabilitas dinding

sel, sehingga mengurangi efektivitas dari antibiotik. Lipoarabinomannan

adalah suatu molekul lain dalam dinding sel mycobacteria, berperan dalam

interaksi antara inang dan patogen, menjadikan M. tuberculosis dapat bertahan

hidup di dalam makrofaga. Mikobakteria dapat tumbuh lebih cepat pada pH 6

dan 8 dengan pH optimum sekitar 6.5 - 6.8 untuk tipe pathogen. Sel

mikobakteria terdiri dari tiga lapisan penting yaitu lipid, protein, dan

polisakarida (Thomas, 1999).

Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan

kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok

bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat

warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat

(alkohol asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada

bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan

melakukan reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri

tidak berwarna (Lay, 1994).

Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat

warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada

pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat

mempertahankannya. Carbol fuchsinmerupakan fuksin basa yang dilarutkan

dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan

dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat

warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan

untuk melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk

sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat

warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air

mengalir untuk menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan

terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan

melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna.

Setelah penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan

asam akan berwarna biru (Lay, 1994).

Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari

oksidasi beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2 meningkatkan

pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan

pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri. Waktu untuk

menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit cenderung

tumbuh lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23C, untuk

menghasilkan pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk cepat

asam daripada bentuk patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten

terhadap agen kimia daripada bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan

sel dan pertumbuhannya. Basil tuberkel reisten terhadap kekeringan dan

bertahan hidup selama periode waktu yang lama dalam sputum kering. Variasi

dapat terjadi dalam koloni, pigmentasi, virulensi, temperatur petumbuhan

yang optimal dan beberapa tanda pertumbuhan atau seluler lainnya (Fardiaz,

1992).

IV. Alat dan Bahan

A. Alat :

1. Bak pewarna .

2. Botol semprot.

3. Kaca obyek.

4. Kapas

5. Kertas saring.

6. Korek api.

7. Mikroskop majemuk.

8. Ose

9. Pembakar spirtus.

B. Bahan :

1. Alkohol 70% dan air suling.

2. Asam alcohol (3% HCl dalam alcohol 95%).

3. Karbol fuchsin dan metilen biru.

4. Suspensi bakteri saprofit.

5. Gambar alat

C. Gambar Alat

Bak pewarna Botol Semprot Gelas Kimia

Kaca objek Kapas Kawat Ose

Kertas Saring Mikroskop majemuk

Pembakar spirtus

Spidol Tabung Reaksi

Zat Warna

V. Prosedur

Disediakan kaca obyek yang bersih kemudian dibuat olesan dari

suspensi bakteri, olesan bakteri digenangi dengan pewarna karbol fuchsin

diamkan selama 5 menit,sambil dipanaskan di atas penangas air. Jaga jangan

sampai, mendidih atau kering. Kemudian zat warna yang berlebih dibuang,

lalu dibilas dengan air suling, lalu bilas dengan zat pemucat alcohol asam

diamkan selama 15 detik atau sampai latar belakang olesan berwarna merah

muda pucat. Kemudian olesan bakteri digenangi dengan pewarna tandingan

biru metilen diamkan selama 2 menit, zat warna yang berlebih dibuang dan

dibilas denganair suling,lalu keringkan dengan kertas saring. Kemudian diatas

preparat diteteskan imersi oil untuk memperjelas identifikasi, lalu preparat

tersebut diperiksa atau diamati di bawah mikroskop. Mulailah dengan lensa

obyektif berkekuatan terendah 10X, lalu ganti dengan lensa obyektif

berkekuatan 100X. kemudian hasilnya diamati dan digambar. Jika identifikasi

yang dilakukan benar maka hasil yangakan terlihat yaitu bakteri tahan asam

(ZN +) akan berwarna merah dan bakteri tidak tahan asam (ZN-) akan

berwarna biru

VI. Data Pengamatan

VII. Pembahasan

Pada praktikum kali ini mengenai pewarnaan bakteri tahan asam

(BTA), dilakukan teknik pewarnaan tahan asam pada bakteri Mycobacterium

tuberculosis yang juga merupakan bakteri gram positif. pengecetan Bakteri

Tahan Asam (BTA) yang menggunakan tiga jenis cat Ziehl Neelson (ZN)

yaitu carbol fuchsin 0,3 %, asalm alcohol 3 % dan methylene blue 3 %.

Bakteri tahan asam memiliki sel berlilin karena mengandung sejumlah besar

materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan

pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan impermeabel

terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer.

Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan

asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam.

Sesuai dengan teori dan prosedur, hal yang pertam dilakukan adalah

menyiapkan alat dan bahan. Alat yang digunakan antara lain ose bulat, tabung

reaksi, pembakar spirtus, kaca obyek, mikroskop majemuk, bak pewarnaan,

botol semprot,kapas, korek api. Sedangkan untuk bahan yang digunakan

antara lain suspensi Mycobacterium tuberculosis , alcohol 70%, air suling,

ketiga zat warna yang telah disebutkan di atas, dan imersi oil. Langkah

selanjutnya adalah melakukan pengolesan bakteri dari suspensi

M.tuberculosis dengan cara membersihkan terlebih dahulu kaca obyek dengan

menggunakan alcohol 70% , keringkan dengan kapas sampai terdengar bunyi

berdecit dari kaca obyek yang menandakan bahwa kaca obyek telah bersih.

Sebelum dilakukan pengolesan terlebih dahulu beri tanda lingkaran di bagian

bawah kaca objek guna untuk menandai tempat olesan bakteri dan

mempermudah pengamatan saat menggunakan mikroskop. Selanjutnya ose

bulat difiksasi terlebih dahulu kemudian dimasukan (dicelupkan) kedalam

tabung reaksi yang berisi suspense bakteri Mycobacterium tuberculosis,

perlakuan tersebut dilakukan dekat api (pembakar spirtus) guna untuk

mencegah kontaminasi melalui udara,kemudian oleskan ose ke atas kaca

obyek,kemudian fiksasi kembali ose dan tabung reaksi beserta kapas penutup

tabung, begitupun dengan bagian bawah kaca objek difiksasi supaya olesan

bakteri tersebut menempel. Tujuan dari fiksasi itu sendiri adalah

menghentikan proses metabolisme secara cepat, mencegah kerusakan

jaringan, mengawetkan komponen-komponen sitologis dan histologis,

mengawetkan keadaan sebenarnya, mengeraskan materi-materi yang lembek

sehingga akan terjadi koagulasi protoplasma maupun elemen-elemen di dalam

protoplasma, jaringan dapat diwarnai sehingga bagian-bagian dari jaringan

dapat mudah dikenali. Secara ringkas fiksasi terdiri dari dua proses yang jelas,

yaitu mematikan dan menetapkan.

Setelah dilakukan pengolesan bakteri diatas kaca obyek, olesan bakteri

digenangi dengan pewarna karbol fuchsin diamkan selama 5 menit sambil

dipanaskan dipenangas air. Pewarnaan pertama ini, akan sulit menembus

dinding dari Bakteri tahan asam, sehingga dilakukan pemanasan untuk

memuaikan dinding sel bakteri tersebut sehingga warna carbol fuchsin ini

mampu diserap oleh sel-sel bakteri. Namun perlu diperhatikan, pemanasan

dilalukan jangan sampai mendidih cukup sampai menguap agar sel-sel bakteri

tersebut tidak rusak. Pada saat olesan didiamkan selama 5 menit setelah

pewarnaan dengan warna carbol fuchsin dan dilakukan pemanasan bertujuan

agar cat ini dapat diserap dan melekat sempurna pada dinding bakteri dan

dinding selnya kembali seperti semula setelah dilakukan pemanasan. Carbol

fuchsin merupakan fuksin basa yang dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Zat

fenol inilah yang membantu pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri

sewaktu proses pemanasan. kemudian tetesi olesan dengan zat pemucat

alcohol asam diamkan selama 15 detik atau sampai latar belakang olesan

berwarna merah muda pucat. Pada saat olesan ditetesi asam alcohol lalu

didiamkan selama 15 detik itu bertujuan agar zat warna dapat luntur secara

sempurna dan tidak ada yang tersisa.

Penambahan alcohol asam ini berfungsi untuk membilas atau

melunturkan zat warna (decolorization) pada sel bakteri (mikroorganisme).

Saat sel-sel bakteri sudah mampu menyerap warna carbol fuchsin maka

dinding sel tersebut akan kembali tertutup pada suhu semula. Sehingga

sebelum dilakukan penambahan asam alcohol ditunggu samapai 5 menit. Saat

penambahan asam alcohol ini, maka bakteri yang bukan BTA akan

dilunturkan kembali warna carbol fuchsin tersebut karena tidak mampu

mengikat kuat seperti halnya bakteri BTA.

Kemudian olesan bakteri digenangi dengan pewarna tandingan biru

metilen diamkan selama 2 menit, zat warna yang berlebih dibuang dan dibilas

dengan air suling,lalu keringkan dengan kertas saring.. Methylene Blue

merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk

mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah

perlakuan dengan asam alkohol. Zat warna methylene blue masuk ke dalam

sel bakteri non BTA yang permeabilitas dinding selnya membesar akibat

lapisan lipid pada bakteri non BTA terekstraksi oleh asam alkohol, sehingga

menyebabkan sel bakteri non BTA tersebut menjadi berwarna biru.

Sedangkan pada bakteri BTA dinding selnya sudah terdehidrasi dengan

perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan

membran menurun sehingga zat warna methylene blue tidak dapat masuk,

sehingga sel bakteri BTA berwarna merah. Olesan didiamkan selama 2 menit

bertujuan agar cat ini dapat diserap sempurna pada dinding bakteri non BTA

sehingga ada perbedaan warna antara bakteri BTA dan Non BTA. Setelah

ketiga zat tersebut diteteskan kemudian olesan bakteri ditetesi dengan imersi

oil guna untuk memperjelas penglihatan pada saat bakteri di identifikasi di

bawah mikroskop dan mengurangi indeks bias cahaya.

Setelah olesan di tetesi imersi oil, kaca objek siap damati dengan menggunakan

mikroskop majemuk. Pertama gunakan lensa obyektif berkekuatan rendah 10X kemudian

diganti dengan lensa obyektif berkekuatan 100X.

Karena pewarnaan bakteri tahan asam ini berpotensi menularkan

penyakit pada praktikan, maka prosedur pewarnaan tidak dilakukan oleh

praktikan dan praktikan hanya melakukan pengamatan melalui mikroskop.

Hasil yang di dapat menunjukan adanya bakteri tahan asam, namun tidak ada

bakteri non tahan asam karena tidak adanya bakteri pembanding. Hal ini

terjadi karena suspensi bakteri yang digunakan merupakan suspense bakteri

tunggal yaitu suspensi Mycobacterium tuberculosis. pada saat dilakukan

pengamatan juga terlihat warna dari bakteri tersebut tidak berwarna merah

melainkan hijau kecoklatan. Hal ini terjadi mungkin karena zat warna yang

digunakan bukan pewarna karbol fuchsin.

VIII. Kesimpulan

Dua kelompok bakteri yaitu bakteri tahan asam dan bakteri tidak tahan

asam dapat diamati dengan menggunakan pewarnaan tahan asam (Ziel-

Neelse) beserta setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam

prosedur tersebut dapat teramati. Bajteri yang teramati sebagai bakteri tahan

asam adalah Mycobacterium tuberculosis.

DAFTAR PUSTAKA

Ball, A.S. 1997. Bacterial Cell Culture : Essential Data. John Wiley & Sons,

New York.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. PT. Gramedia Pustaka Utama,

Jakarta.

Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga

Grafindo Persada.

Syahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi.

Jakarta: UI Press.

Thomas Dormandy (1999). The White Death: A History of Tuberculosis.

Tersedia online di http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1044719.

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN SPORA

Senin, 12 Maret 2015

Kelompok III

Senin, Pukul 10.00 13.00 WIB

Nama NPM

Nunung nurjanah 260110130027

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Casuarina) (Sani)

PEWARNAAN SPORA

I. Tujuan

Mengamati endospore bakteri dengan menggunakan prosedur

pewarnaan spora (pewarnaan Klien). Memahami setiap langkah dan reaksi-

reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.

II. Prinsip

1. Teknik aseptis

Teknik aseptis merupakan suatu teknis yang dilakukan dalam

pemindahbiakan bakteri agar bakteri yang dibiakan tidak mengalami

kontaminasi, dengan teknis aseptis diharapkan bakteri yang

dipindahbiakan mempertahankan kemurniannya.

2. Impermeabilitas spora

Adalah sifat dari dinding endospore yang sulit untuk ditembus

oleh zat warna dan tidak permeable oleh karena itu dibutuhkan proses

pemanasan agar dinding spora dapat mengembang dan zat warna dapat

masuk.

3. Penetrasi zat warna.

Penetrasi zat warna adalah suatu jalan untuk zat warna agar

dapat masuk kedalam suatu molekul maka harus bias diserap oleh

mikroorganisme tersebut.

4. Pewarnaan spora

Pewarnaan spora bertujuan untuk mewarnai spora pada bakteri

yang dapat membentuk spora

III. Teori Dasar

Spora bakteri adalah bentuk bekteri yang sedang dalam usaha

mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri

mempunyai fungsi yang sama seperti kista amoeba, sebab bakteri dalam

bentuk spora dan amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase dimana

kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap

faktor luar yang tidak menguntungkan.Sepanjang pengetahuan yang kita

miliki sekarang, hanya golongan basillah yang dapat membentuk spora, akan

tetapi tidak semua basil mampu berbuat demikian. Beberapa spesies Bacillus

yang aerob dan beberapa spesies Clostridium yang anaerob dapat membentuk

spora. Spora ini lazim disebut endospora, dikarenakan spora itu dibentuk di

dalam sel (Dwidjoseputro,2001).

beberapa bakteri mampu membentuk spora meskipun tidak dalam

keadaan ekstrem ataupun medium yang kurang nutrisi. Hal ini dimungkinkan

karena bakteri tersebut secara genetis, dalam tahapan pertumbuhan dan

perkembangannya memang memiliki satu fase sporulasi

(Dwidjoseputro,2001).

Ada dua genus bakteri yang dapat membentuk endospora, yaitu genus

Bacillus dan genus Clostridium.Strukturspora yang terbentuk di dalamtubuh

vegetative bakteri disebut sebagai endospora (endo=dalam, spora=spora)

yaitu spora yang terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana, dapat dikatakan

bahwa endospora merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan dinding

yang mengalami penebalan serta memiliki beberapa lapisan tambahan

(Waluyo, 2010).

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan

sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah

pewarna sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya

digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990).

Endospora hanya terdapat pada bakteri. Merupakan tubuh berdinding

tebal, sangat refraktif, dan sangat resisten, dihasilkan oleh semua spesies

Bacillus, Clostridium dan Sporosarcina. Bakteri yang mampu membentuk

endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi sebagai sel

vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhannya, terjadi

sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang dimaksudkan

untuk menjadi spora. (Pelczar,1986).

Dalam pengamatan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu yang

dapat menembus dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan yang

dimaksudkan oleh Volk & Wheeler tersebut adalah dengan penggunaan

larutan hijau malakit 5%, dan untuk memperjelas pengamatan, sel vegetative

juga diwarnai dengan larutan safranin 0,5% sehingga sel vegetative ini

berwarna merah. Dengan demikian ada atau tidaknya spora dapat teramati,

bahkan posisi spora di dalam tubuh sel vegetative juga dapat

diidentifikasi.Namun ada juga zat warna khusus untuk mewarnai spora dan di

dalam proses pewarnaannya melibatkan treatment pemanasan, yaitu; spora

dipanaskan bersamaan dengan zat warna tersebu tsehingga memudahkan zat

warna tersebut untuk meresap ke dalam dinding pelindung spora

bakteri.(Volk, 1998).

IV. Alat dan Bahan

A. Alat :

1. Bak pewarna .

2. Botol semprot.

3. Kaca obyek.

4. Kapas

5. Kertas saring.

6. Korek api.

7. Mikroskop majemuk.

8. Ose

9. Pembakar spirtus

B. Bahan:

1. Alkohol 70% dan air suling.

2. Biakan padat bakteri Bacillus subtilis berumur 72 jam.

3. H2SO4 1%.

4. Karbol fuchdin dan biru metilen.

5. Minyak celup.

6. NaCl fisiologis.

7. Xylene.

C. Gambar alat

Bak pewarna Botol Semprot Gelas Kimia

Kaca objek Kapas Kawat Ose

Kertas Saring Mikroskop majemuk

Pembakar spirtus

Spidol Tabung Reaksi

Zat Warna

V. Prosedur

Dibuat suspensi bakteri yang terdiri dari biakan bakteri dan NaCl

fisiologis ditabung reaksi.karbol fuchsin ditambahkan sebanyak 1:1

dimasukan ke dalam suspensi tersebut. Kemudian campuran tersebut

dipanaskan dalam penangas air bersuhu 800C selama 10 menit jaga jangn

sampai mendidih atau kering. Kaca objek dibersihkan dengan menggunakan

alcohol 70% keringkan dengan menggunakan kapas sampai kaca obyek

berdecit. Kemudian dibuat olesan bakteri dari suspense bakteri tersebut diatas

kaca obyek yang telah dibersihkan, dengan cara menggunakan ose bulat yang

difiksasi terlebih dahulu, kemudian ose digunakan untuk mengambil suspense

bakteri yang berada di dalam beaker glass dan di tutup dengan kapas,

pengambilan suspensi bakteri dari beaker glass tersebut dengan cara dilakukan

di dekat api pertama buka kapas penutup kemudian fiksasi beserta beaker

glassnya lalu celupkan ose ke dalam suspense bakteri dan oleskan di atas kaca

obyek kemudian di bawah kaca obyek diberi tanda lingkaran.setelah itu

fiksasi kembali kapas penutup dan beaker glass, fiksasi ose dan juga fiksasi

kaca obyek yang telah berisi olesan bakteri. Simpan preparat diatas kawat bak

pewarna kemudian tetesi dengan H2SO4 bilas dengan air suling yang berada di

dalam botol semprot. Kaca obyek atau preparat tersebut ditetesi dengan

metilen biru dan didiamkan selama 5 menit, setelah itu bilas dengan air suling

sampai zat warna hilang, preparat dikeringkan dengan menggunakan kertas

saring dengan cara ditepuk-tepuk sampai air bekas bilasan hilang. Tetesi

preparat dengan imersi oil, kemudian lakukan pengamatan dibawah

mikroskop majemuk, sebelumnya bersihkan terlebih dahulu lensa obyektif

dengan menggunakan kapas yang telah ditetesi xylene. Preparat diamati

dimulai dengan menggunakan lensa obyektif berkekuatan terendah 10X. lalu

ganti dengan lensa obyektif berkekuatan 100X. kemudian hasil yang di dapat

dan diamati. Jika pengamatan yang dilakukan benar maka akan terlihat bakteri

dengan endospore berwarna merah dan badan vegetative berwarna biru.

VI. DataPengamatan

VII. Pembahasan

Pada praktikum kali ini mengenai pewarnaan spora yang dilakukan

pada bakteri Bacillus subtilis Bacillus memiliki bentuk batang Gram positif

pada kultur muda, motil (reaksi nonmotil kadang terjadi), membentuk spora

yang biasanya tahan panas, aerob (beberapa spesies anaerob fakultatif),

katalase positif dan oksidasi bervariasi (Cowan, 1974). Bacillus dapat menjadi

gram negatif .ketika memasuki fase pertumbuhan stasioner. Sebagian besar

Bacillus merupakan bakteri mesofil yang tumbuh dengan suhu optimal antara

30-400 C, meskipun ada beberapa yang termasuk golongan termofil dengan

suhu optimal pada suhu 65 0

C. Tujuan dari praktikum ini mengamati

endospore bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan spora

(pewarnaan Klien). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang

terjadi dalam prosedur tersebut. Zat warna yang digunakan pada pewarnaan

spora antara lain karbol fuksin, H2SO4, dan metilen biru.

Sesuai dengan teori dan prosedur, hal yang pertam dilakukan adalah

menyiapkan alat dan bahan. Alat yang digunakan antara lain ose bulat, tabung

reaksi, pembakar spirtus, kaca obyek, mikroskop majemuk, bak pewarnaan,

botol semprot,kapas, korek api. Sedangkan untuk bahan yang digunakan

antara lain suspensi Bacillus subtilis , alcohol 70%, air suling, ketiga zat

warna yang telah disebutkan di atas,imersi oil. Suspensi bakteri Bacillus

subtilis dibuat dengan cara, suspens bakteri yang terdiri dari biakan bakteri

dan NaCl fisiologis ditabung reaksi.karbol fuchsin ditambahkan sebanyak 1:1

dimasukan ke dalam suspensi tersebut. Kemudian campuran tersebut

dipanaskan dalam penangas air bersuhu 800C selama 10 menit jaga jangan

sampai mendidih atau kering. Masuknya zat warna karbol fuksin dalam spora

diakibatkan oleh pemanasan yang berlangsung karena dengan pemanasan

akan mengembangkan lapisan luar spora, dengan melonggarnya pori-pori

maka zat warna dapat masuk. Adanya molekul RNA dalam spora juga

mengakibatkan zat warna tidak keluar karena adanya ikatan kompleks zat

warna RNA, ditambah lagi dengan adanya penambahan asam yang menutup

kembali pori-pori.Namuan karena keterbatasan waktu maka prosedur di atas

tidak dilakukan oleh prakikan,melainkan di bantu oleh para asistan

laboratorium Langkah selanjutnya adalah melakukan pengolesan bakteri

suspense bakteri dengan cara membersihkan terlebih dahulu kaca obyek

dengan menggunakan alcohol 70% , keringkan dengan kapas sampai

terdengar bunyi berdecit dari kaca obyek yang menandakan bahwa kaca

obyek telah bersih. Sebelum dilakukan pengolesan terlebih dahulu beri tanda

lingkaran di bagian bawah kaca objek guna untuk menandai tempat olesan

bakteri dan mempermudah pengamatan saat menggunakan mikroskop.

Selanjutnya ose bulat difiksasi terlebih dahulu kemudian dimasukan

(dicelupkan) kedalam tabung reaksi yang berisi suspensi bakteri Bacillus

subtilis, perlakuan tersebut dilakukan dekat api (pembakar spirtus) guna untuk

mencegah kontaminasi melalui udara,kemudian oleskan ose ke atas kaca

obyek,kemudian fiksasi kembali ose dan tabung reaksi beserta kapas penutup

tabung, begitupun dengan bagian bawah kaca objek difiksasi supaya olesan

bakteri tersebut menempel. Tujuan dari fiksasi itu sendiri adalah

menghentikan proses metabolisme secara cepat, mencegah kerusakan

jaringan, mengawetkan komponen-komponen sitologis dan histologis,

mengawetkan keadaan sebenarnya, mengeraskan materi-materi yang lembek

sehingga akan terjadi koagulasi protoplasma maupun elemen-elemen di dalam

protoplasma, jaringan dapat diwarnai sehingga bagian-bagian dari jaringan

dapat mudah dikenali. Secara ringkas fiksasi terdiri dari dua proses yang jelas,

yaitu mematikan dan menetapkan.

Setelah dilakukan pengolesan suspensi bakteri di atas kaca objek,

kemudin olesan tersebut ditetesi dengan H2SO4 .dengan adanya penambahan

asam maka pori-pori kembali menutup. Sehingga karbol fuksin dapat

meresap atau masuk ke dalam spora dan mewarnainya, hingga spora dari

bakteri tersebut berwarna merah. Kemudian bilas dengan air suling untuk

menghilangkan larutan H2SO4 yang merupakan larutan asam, juga supaya

bakteri tersebut tidak mati karena bakteri tersebut bukan merupakan BTA.

Kemudian setelah ditetesi H2SO4, kaca objyek yang berisi olesan

bakteri tersebut ditetesi dengan metilen biru yang disebut sebagai pewarna

tandingan. Dengan adanya Penambahan pewarna tandingan metilen blue

mengakibatkan terperangkapnya zat warna dalam sel bakteri sehingga

perbedaan kontras antara warna badan sel bakteri dengan sporanya dapat

diamati. Bilas zat warna berlebih dengan air suling, lalu keringkan dengan

menggunakan kertas saring dengan cara ditepuk tepuk di atas olesan .

Kemudian kaca obyek (preparat) ditetesi dengan imersi oil guna untuk

memperjelas identifikasi bakteri dan mengurangi indeks bias cahaya. Setelah

kaca obyek (preparat) di tetesi imersi oil, kaca objek siap damati dengan menggunakan

mikroskop majemuk. Pertama gunakan lensa obyektif berkekuatan rendah 10X kemudian

diganti dengan lensa obyektif berkekuatan 100X.

Hasil pengamatan menunjukan adanya bakteri Bacillus subtilis

ditandai dengan adanya badan sel berbentuk basil berwarna biru yang disebut

sebagai sel vegetative dan adanya spora berwarna merah di dalam sel.

Spora tersebut dapat diamati karena adanya bakteri yang mengalami

sporulasi. Sporulasi adalah suatu respon terhadap penurunan kadar nutrisi

dalam medium khususnya sumber karbon dan nitrogen. Pengaturan

pembentukan spora bersifat negatif karena sel membuat repressor dari

senyawa yang terkandung dalam medium untuk mencegah mulainya

sporulasi. proses pembentukan endospora pada B. subtilis membutuhkan

beberapa jam. Pada tahap I, terjadi perkembangan sel vegetatif yang ditandai

dengan perubahan struktur morfologi sel. Sel terbagi secara asimetris (tahap

II) dan menghasilkan dua bagian yaitu sel induk dan pre-spore. Kedua bagian

ini memiliki perkembangan yang berbeda. Tahap III dari sporulasi,

peptidoglikan pada septum terdegradasi dan pre-sporeditelan oleh sel induk,

sehingga membentuk sel dalam sel. Aktivitas sel induk dapat mempermudah

sintesis endospora dan membentuk korteks yang merupakan endapan dari

suatu lapisan (tahap VI+V). Hal ini diikuti oleh berakhirnya dehidrasi dan

pematangan endospora (tahap VI+VII). Akhirnya sel induk hancur pada saat

program sel mati, dan endospora terbebas ke lingkungan. Endospora akan

tetap dorman sampai berkecambah kembali pada kondisi yang sesuai.

VIII. Kesimpulan

Endospora bakteri dapat diamati dengan menggunakan prosedur

pewarnaan spora (pewarnaan Klien). Beserta setiap langkah dan reaksi-reaksi

kimia yang terjadi pada prosedur tersebut dpat diamati. Hasil pengamatan

menunjukan adanya bakteri Bacillus subtilis ditandai dengan adanya badan sel

berbentuk basil berwarna biru yang disebut sebagai sel vegetative dan adanya

spora berwarna merah di dalam sel.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta

Gupte. 1990. Mikrobiologi Dasar.Jakarta : Penerbit Bina Rupa Aksara.

Pelezar,chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta

Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta :

Erlangga

Waluyo,lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM.

Malang