Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Lezione 7
Allineamento di sequenze biologiche
Allineamento di sequenze
Determinare la similarità e dedurre l’omologia
Allineare
1 LA CASA È NUOVA
2 LA CASSA È VUOTA
Definire il numero di passi necessari per trasformare una sequenza nell’altra utilizzando passaggi mutazionali come-sostituzione -inserzione/delezione
Tra le due soluzioni mostrate (ce ne sono altre!), quale scegliamo? Esistono criteri e algoritmi che ci possono aiutare
1 LA CAS-A È –NUO-VA
2 LA CASSA È V-UOT-A
5 indels
gap1 LA CASA È NUOVA
2 LA CASSA È VUOTA
1 LA CAS-A È NUOVA
2 LA CASSA È VUOTA
1 indels + 2 sostituzionimatch
mismatch
Perchè allineare?
• Per fornire una misura di quanto sequenze nucleotidiche o aminoacidiche siano “imparentate”, abbiano in comune
• Questa parentela ci permette di fare inferenze biologiche in termini di
– relazioni strutturali
– relazioni funzionali
– relazioni evolutive
• Alignment-based database searching
Terminologia
• La misura QUANTITATIVA: Similarità
– Si esprime in genere come % di identità, quantifica i cambiamenti che sono avvenuti dal momento della divergenza tra due specie (sostituzioni, In-dels)
– Identifica i residui cruciali per mantenere la struttura o la funzione di una proteina
Alti livelli di similarità possono indicare una divergenza recente tra le sequenze, una storia evolutiva comune, simile funzione biologica
Terminologia
• Una valutazione di STATO: Omologia
– Implica l’esistenza di relazioni evolutive
– Geni omologhi: geni che si sono originati per divergenza da un antenato comune
– I geni SONO o NON SONO omologhi, non esiste una misura quantitativa dell’omologia
Eyeless ha un ruolo importante nel dirigere lo sviluppo dell’occhio in drosofila; Pax6 lo stesso nel topo
Eyeless e Pax6 sono decisamente simili in sequenza e funzione
probably > 500 MYAhttp://evolution.berkeley.edu/
TerminologiaOrtologhi: Geni che si sono separati in seguito ad un evento di speciazione
• Le sequenze discendono da un antenato comune
• Molto probabilmente codificano per proteine con domini simili e simili strutture tridimensionali
• Spesso mantengono funzioni simili
• Possono essere usati per predire funzioni geniche in genomi nuovi
Paraloghi: Geni che si sono evoluti per duplicazione in una specifica linea evolutiva
• E’ meno probabile che mantengano funzioni simili, più comunemente evolvono nuove funzioni
Homologous sequences. Orthologs and Paralogs are two types of homologous sequences. Orthology describes genes in different species that derive from a common ancestor. Orthologous genes may or may not have the same function. Paralogy describes homologous genes within a single species that diverged by gene duplication.
Allineamenti globali e locali
• Globale
– trova l’allineamento ottimale sul totale della lunghezza delle sequenze
– È la soluzione migliore per sequenze di lunghezza simile ed omologhe
– Al dimiuire del grado di similarità (es. aumento distanza evolutiva, alto tasso di ricombinazione) i metodi di allineamento globale tendono a peggiorare molto in efficienza
Cercare in GENE di NCBI
PAX6 and mouse > scaricare il cds in format FASTA > incollare
nell’allineatore di BLAST
PAX6 and chimpanzee > scaricare il cds in format FASTA >
incollare nell’allineatore di BLAST
Cosa otteniamo?
Allineamenti globali e locali• Locale
– Ha lo scopo di trovare regioni simili (es. domini) in due sequenze (“paired subsequences”)
– Le regioni fuori dalle aree di allineamento locale vengono escluse
– Può essere generato più di un allineamento locale per ogni coppia di sequenze confrontate
– Scelta indicata nel caso di due sequenze a similarità ridotta o di differenti lunghezze
Local vs. Global Alignment
• Global Alignment
• Local Alignment—migliore per trovare regioni conservate
--T—-CC-C-AGT—-TATGT-CAGGGGACACG—A-GCATGCAGA-GAC| || | || | | | ||| || | | | | |||| |
AATTGCCGCC-GTCGT-T-TTCAG----CA-GTTATG—T-CAGAT--C
tccCAGTTATGTCAGgggacacgagcatgcagagac
||||||||||||
aattgccgccgtcgttttcagCAGTTATGTCAGatc
Allineamenti locali: perchè?
• Due geni in specie diverse possono essere simili in corte regioni conservate e diversi nel resto della sequenza.
• Esempio:
– I geni Homeobox (chiaramente omologhi) hanno corte regioni chiamate omeodomini altamente conservate tra specie.
– Un allineamento globale non troverebbe gli omeodomini perchè cercherebbe di allineare l’INTERA sequenza
Allineamento: ipotesi circa l’omologia
posizionale (discendenza da antenato comune)
di due residui in due (o più) sequenze
GCGGCCCATCAGGTAGTTGGTGG GCGTTCCATCCTGGTTGGTGTG
Sequenza della specie 1 sequenza della specie 2
Sequenza ancestrale
(prima della speciazione: antenato comune delle due sequenze.
Non direttamente osservabile (a meno di avere il DNA antico),
ma ricostruibile
11111111112222
base nr 12345678901234567890123
GCGGTCCATCAGCTGGTTGGTGG
presente
passato
G > T pos 4
Del AG pos 11 e 12
Ins T pos 23
T > C pos 5
C > G pos 13
G > A pos 15
Un allineamento a coppie consiste di una serie di residui o basi accoppiati, una per sequenza. Ci sono tre tipi di coppie:
(a) match = stesso nucleotide (o AA) in entrambe le sequenze(b) mismatch = diverso nucleotide (o AA) in una delle sequenze(c) gap = una base (o AA) in una sequenza e niente nell’altra
1111111111222 2
1234567890123456789012 3
Specie1 GCGGCCCATCAGGTAGTTGGTG-G
Specie2 GCGTTCCATC--CTGGTTGGTGTG
aaabbaaaaaccbabaaaaaaaca
Come si può fare in modo non manuale??
Nelle prossime diapositive cercheremo di rispondere alla domanda: su che cosa si basa un allineatore (algoritmo di allineamento) per operare un allineamento?
Come si può fare in modo non manuale??
1. Matrici di punteggio e 2. Penalità per i gap
• Il vero allineamento tra due sequenze è quello che riflette in modo accurato le loro relazioni evolutive (vedi i numerini nell’esempio precedente: omologia posizionale).
• Poichè il vero allineamento non è conosciuto in pratica si cerca l’allineamento ottimale: minimizza i mismatches e i gaps secondo certi criteri….purtroppo ↓ mms ↑ gaps
↓ gaps ↑ mms
Sostituzioni o mismatch
In/del o gap
( (
(
Matches
Mismatches
Gaps
(1 terminal)
Matches
Mismatches
Gaps
Matches
Mismatches
Gaps (both
terminal)
Lo schema di punteggio include una penalizzazione per le in-del (gap penalty) e una matrice di punteggio (scoring matrix) M(a,b), che specifica ogni tipo di match (a = b) o di mismatch (a b).
Le unità nella matrice di punteggio possono essere nucleotidi nelle sequenze di DNA o RNA, i codoni nelle regioni codificanti, o gli aminoacidi nelle sequenze proteiche.
Matrici di punteggio e penalità per i gap
Cos’è una matrice di punteggio?
• Matrice che associa un punteggio ad ogni coppia di entità che troviamo in un allineamento
• Ogni linea e ogni colonna rappresentano un residuo (4 nucleotidi o 20 aminoacidi)
• La diagonale è l’identità• Il triangolo inferiore corrisponde alle sostituzioni e
il superiore è simmetrico (non necessario)
• I valori negativi indicano penalità per certe sostituzioni, l’algoritmo di allineamento cercherà di evitarle
• I valori positivi indicano sostituzioni ‘accettate’ in termini evoolutivi, strutturali o funzionali
Sostituzioni : mismatches
Perché è importante capire le matrici di punteggio?
• Compaiono in ogni analisi che implichi un confronto tra sequenze
• Implicano un determinato percorso evolutivo
• Possono influenzare fortemente il risultato delle analisi
Sostituzioni : mismatches
Di solito sono semplici. La più semplice:
M(a,b) assegna valori positivi se a = b (match), altrimenti negativi (mismatch)
M(a,b) 0 if a b
0 if a b
DNA scoring matricesSostituzioni : mismatches
Matrici più complesse possono distinguere ad esempio tra transizioni e trasversioni (le prime avvengono più facilmente trattandosi di molecole più simili, però ci sono 4 possibili trasversioni e solo 2 transizioni)
DNA scoring matricesSostituzioni : mismatches
Margareth Dayhoff 1965: “Atlas of potein sequences” contenente le sequenze aminoacidiche di 65 proteine
Inizio delle collezioni di dati da cui avranno origine le banche dati elettroniche
Dayhoff et al. nel decennio 1970-1980 hanno proposto una procedura per il calcolo di matrici di punteggio per quantificare la propensione di AA a mutare l’uno nell’altro durante l’evoluzione (matrici 20 x 20).
Alla base c’è l’osservazione delle proteine note: MATRICI DI SOSTITUZIONI EMPIRICHE
Amino acid/protein scoring matrices
Sostituzioni : mismatches
Empirical substitution matrices
PAM matrix (Percent/Point Accepted Mutation Matrix)
BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrix)
Amino acid/protein scoring matrices
Sostituzioni : mismatches
P > 0 lo scambio AAx ↔ AAy si osserva più frequentemente di quanto atteso per caso P = 0 la frequenza della sostituzione è indistinguibile da quella casualeP < 0 lo scambio AAx ↔ AAy è più raro di quanto atteso per caso
ogni valore indica la probabilità che l’AAx sia sostituito con l’AAy attraverso una o più mutazioni accettate in uno specifico intervallo evolutivo, rispetto alla probabilità che i due aminoacidi siano stati allineati per caso
Sostituzioni : mismatches
BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrix)
• Henikoff and Henikoff (1992): matrice basata su molte più osservazioni della PAM: scambi aminoacidici calcolati su circa 2000 «blocchi»
• Blocco: regione conservata di una famiglia di proteine senza indels
• Direttamente calcolate sulla base di allineamenti locali– Probabilità di sostituzione (conservazione)
– Frequenza degli aminoacidi
Sostituzioni : mismatches
E: Asp D: Glu
Default in BLASTSostituzioni : mismatches
Maggiore il punteggio (score) maggiormente imparentate sono le sequenze
Maggiore è il valore, più simili sono le proteine utilizzate nel calcolo della matrice
Sostituzioni : mismatches
Gap penaltiesCosto delle indels (GAP)Quanto è probabile una
certa sostituzione (matrici)
• Costo dell’introduzione di un gap (Gap opening penalty: G)• Costo dell’estensione di un gap (Gap extension penalty: L*n)
• Costo complessivo: G+Ln
Questi sono valori usati spesso, ma si possono cambiare!
In/Dels : gaps
Algoritmi di allineamento
• Obiettivo: trovare il miglior allineamento, cioè il massimo numero di simboli identici e il minor numero di gap (=minor numero di mutazioni = più breve percorso evolutivo)
• Per due sequenze di DNA di 200 basi ci sono 10153 possibili allineamenti….meglio non farli a mano!
Dynamic programming = tecnica computazionale.
Si usa per effettuare ricerche complesse dividendole in una successione di piccoli passaggi, inizialmente semplici e poi più complessi. L’ultimo passaggio contiene la soluzione complessiva
42
Algoritmi di allineamento
• Esausitivi o esatti: esplorano tutte le possibili soluzioni e scelgono la migliore (lenti, computazionalmente intensi, precisi)
• Euristici: prendono ‘scorciatoie’ e cercano di arrivare ad una soluzione ottimale basandosi su ipotesi plausibili
Algoritmi di allineamento comuni
Algoritmo Esaustivo? Loc/Glo Mul align Db searches
Needleman-Wunsch
Si Global Si No
Smith-Waterman
Si Local Si Si
FASTA No Local Si Si
BLAST No Local No Si
• Exact global alignment method
– Non adatto in molti casi (es. db searches, ricerca di piccole regioni di similarità, allinemanti tra sequenze con grosse differenze di lunghezza)
– Il più rigoroso e completo se lo scopo è di allineare sequenze che non si sono evolute per exon shuffling, inserzione/delezione di domini, etc.
– Il metodo migliore se le sequenze sono di lunghezze simili e si sono evolute da un antenato comune attraverso mutazioni di punto, piccole ind/dels
Needleman-Wunsch
• Exact local alignment method
– Modifica del N-W che permette di allineare in locale (non serve allineare tutta la seq)
– Allineamento molto buono per db searching, allineamento multiplo e a coppie
– Esaustivo, quindi può essere molto lento. A differenza del N-W considera qualunque allineamento che parta da qualunque posizione della sequenza, non solo quelli che cominciano all’inizio e terminano alla fine
Smith-Waterman
FP: falsi positivi
VP: veri positivi
FN: falsi negativi
VN: veri negativi
VN
Regione di sovrapposizione
VP
FN
Caso 2: c’è una zona in cui non è possibile discriminare omologhe e non
Ricerche in database
Query (sequenza sonda)
Sequenze nelle banche dati
ricerca
Sequenze non omologheCaso 1: buon lavoro
dell’algoritmo
Punteggio soglia
Sequenze omologhe
FP
L’algoritmo deve identificare le sequenze omologhe e non omologhe separate da un valore soglia
• Euristico locale
– Prima identifica regioni di identità tra la sequenza sonda (‘query’) e le sequenze in db. (KTUP)
– I geni o proteine con la densità maggiore di segnale vengono riesaminati
– L’allineamento viene esteso ad entrambi i lati delle regioni di match aggiungendo gaps e mismatches sulla base di matrici di punteggio
– L’allineamento ottiene un punteggio
FASTA: http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/Pearson WR (1996) Effective protein sequence comparison. Academic Press Inc 227-258Pearson WR and Lipman DJ (1998) Improved tools for biological sequence comparison. PNAS 85:2444
NB: leggere l’HELP del programma
Non si interpretano come p values dove
p < 0.05
sono generalmente considerati significativi
E value: significatività statistica
Regola generale
E values < 10-6 sono molto probabilmente significativi.
10-6 < E values < 10-3 meritano una seconda occhiata.
E values < 10-3 andrebbero scartati (ci aspettiamo di trovare 0.001 sequenze non correlate alla nostra-falsi positivi- che ottengono un punteggio superiore a quell’S).