Liquid Chromatography Fundamentals - Theory...Un número de platos (N) alto aporta las siguientes ventajas: •Picos agudos y estrechos •Mejora de la detección •Capacidad de picos

Exclusivamente para fines educativos

April 6, 2016

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CONSTRUYENDOUNA CIENCIA MEJOR

ENTRE AGILENT Y USTED

Cromatografía de líquidosde alto rendimiento (HPLC):

fundamentos y teoría


April 6, 2016

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Agilent Technologies es una

empresa comprometida con la

comunidad educativa y no duda

en ofrecer acceso a materiales

de su propiedad.

Esta presentación ha sido creada por Agilent

Technologies. El uso de estas diapositivas queda

limitado a fines exclusivamente educativos.

Si desea utilizar las imágenes, los esquemas o los

dibujos para otros fines distintos, póngase en contacto

previamente con Agilent Technologies.

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Introducción

La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas

en inglés), anteriormente denominada cromatografía de líquidos de alta

presión, es una técnica en el campo de la química analítica utilizada para

separar, identificar y cuantificar los componentes de una mezcla.

En la HPLC se utilizan bombas para hacer pasar un disolvente líquido

presurizado mezclado con la muestra a través de una columna rellena de

un adsorbente sólido. Cada componente de la muestra interactúa de forma

ligeramente diferente con el adsorbente, lo que hace que los distintos

componentes presenten velocidades de flujo distintas y posibilita

la separación de los componentes a medida que salen de la columna.

Fuente: Wikipedia.

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Índice

Introducción

• ¿Qué sucede en el interior de la columna?

Parámetros clave

• Tiempo de retención y anchura de pico

• Resolución: separación en la línea de base

• Resolución: ecuación fundamental

• Eficiencia o número de platos teóricos

• Factor de retención

• Selectividad o factor de separación

¿Cómo se puede influir sobre la selectividad?

• Selectividad: ejemplo n.º 1



• Número de platos

Ecuación de Van Deemter

• Difusión turbulenta

• Difusión axial

• Resistencia a la transferencia de masa

• Más información sobre la ecuación de Van Deemter

Capacidad de picos

• Análisis en gradiente

• Definición

• Cálculo de la capacidad de picos

• Anchura de pico

• Ejemplo

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Introducción¿Qué sucede en el interior de la columna?

Tiempo (t)

Separación (tr2-tr1)

Anchura de pico (Wb1,2)

Índice

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tr2-tr1

Separación de mayor calidad Separación de menor calidad

Separación de mayor calidad Separación de menor calidad

Wb1 Wb2Wb1Wb2

frente a

frente a

tr2-tr1

Índice

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Etiqueta de confidencialidad

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Tiempo (t)

Separación (tr2-tr1)

Anchura de pico (Wb1,2)


La resolución indica la capacidad de

una columna para separar los picos

de interés.

Permite conocer si se ha conseguido la

separación en la línea de base o no.

)(2/1 12

12

bb

rrs

WW

ttR

Índice

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Parámetros claveTiempo de retención y anchura de pico

tr1

tr2

Wb1 Wb2

W1/2

h

t

tri Tiempo de retención del compuesto "i"

W1/2 Anchura de pico a la mitad de la altura

Wbi Anchura de pico en la línea de base

Índice

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Parámetros claveResolución: separación en la línea de base

La resolución indica la capacidad de una

columna para separar los picos de interés.

Sobre la resolución influyen la eficiencia (N),

la selectividad (a) y la retención (k).

• Debe tener como mínimo un valor igual a 1

para que se produzca una separación medible

y se pueda realizar una cuantificación

adecuada.

• Se necesita un valor igual a 0,6 para que se

pueda distinguir un valle entre dos picos de la

misma altura.

• Para los métodos más robustos normalmente

se requieren valores iguales o superiores a 1,7.

• Se considera que un valor igual a 1,6 se

corresponde con una separación en línea de

base y garantiza unos resultados cuantitativos

de precisión máxima.

h

t

Rs = 1,5

Índice

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Rs 14

N

a 1

a

k

1k

Parámetros claveResolución: ecuación fundamental de la (U)HPLC

SelectividadEficiencia Retención

La resolución se puede aumentar mejorando cualquiera de esos parámetros:

• La selectividad es el parámetro con mayor influencia sobre la resolución. Con pequeñas variaciones de selectividad se pueden conseguir grandes cambios en las resoluciones.

• La retención únicamente influye de manera significativa cuando el valor del parámetro k es bajo.

• La eficiencia indica el poder de separación de la columna.

Índice

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Parámetros claveResolución: ecuación fundamental de la (U)HPLC

En la figura se muestra la resolución en función de la selectividad, la eficiencia de la columna y la retención.

Índice

La selectividad tiene una influencia máxima sobre la resolución:

• Cambio de la fase estacionaria.

• Cambio de la fase móvil.

Es la forma más sencilla de aumentar

el número de platos.

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Parámetros claveEficiencia o número de platos teóricos (N)

La eficiencia de la columna se utiliza para comparar el rendimiento de diferentes columnas. Se expresa por medio del número de platos teóricos (N).

Las columnas con un número alto de platos son más eficientes. Una columna con un valor N alto generará picos más estrechos para un determinado tiempo de retención que una columna con un valor N más bajo.

Parámetros que influyen sobre la eficiencia de la columna:

• Longitud de la columna (a mayor longitud, mayor eficiencia).

• Tamaño de partícula (a menor tamaño de partícula, mayor eficiencia).

2

2/1

54,5

W

tN r

2

16

b

r

W

tN

Índice

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Parámetros claveFactor de retención (k)

0

0

t

ttk r

El factor de retención mide el tiempo que un componente de la muestra permanece en la fase estacionaria en comparación con el tiempo que permanece en la fase móvil. Se calcula dividiendo el tiempo de retención entre el tiempo de un pico no retenido (t0).

Parámetros que influyen sobre el factor de retención:

• Fase estacionaria

• Fase móvil

• Pendiente del gradiente*

• Volumen muerto del sistema** Únicamente para la elución en gradiente.

Índice

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Esta ecuación indica la influencia sobre el factor de retención de la velocidad de flujo (F), el tiempo del gradiente (tG), el rango del gradiente (ΔΦ) y el volumen de la columna (Vm).

Recuerde: Para mantener constante el factor de retención, los cambios en el denominador se deben compensar con cambios proporcionales en el numerador y viceversa.

Parámetros claveFactor de retención (k): eluciones en gradiente

m

G

VS

Ftk

`

Índice

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Parámetros claveSelectividad o factor de separación (α)

La selectividad es una medida del tiempo o la distancia entre los máximos de dos picos. Si α = 1, ambos picos tendrán el mismo tiempo de retención y se coeluirán. Se define como la relación de los factores de capacidad.

Parámetros que influyen sobre el factor de retención:

• Fase estacionaria

• Fase móvil

• Temperatura

a Selectividad

k1 Factor de retención del primer pico

k2 Factor de retención del segundo pico1

2

k

ka

Índice

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Parámetros claveInfluencia de N, α y k sobre la resolución

Índice

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¿Cómo se puede influir sobre la separación?

Muestra idéntica analizada con diferentes fases estacionarias,

pero con la misma temperatura, fase móvil y gradiente.

Índice

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Muestra idéntica analizada con la misma fase estacionaria y temperatura, pero con diferentes fases móviles (mismo gradiente).

Índice

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19

Muestra idéntica analizada con la misma fase estacionaria y fase móvil, pero con diferentes temperaturas (mismo gradiente).


Índice

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¿Cómo se puede influir sobre la separación?¿Qué es un “plato” en HPLC?

Un plato teórico es la etapa hipotética en la cual dos fases de una sustancia (fase líquida y fase vapor) se encuentran en equilibrio.

LC Longitud de la columna

dp Tamaño de partícula

h Altura reducida de un plato teórico

N4

1~Rs

p

c

dh

L4

1~H

L4

1~R cs

Índice

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Un número de platos (N) alto aporta las siguientes ventajas:

• Picos agudos y estrechos

• Mejora de la detección

• Capacidad de picos que permite analizar muestras complejas

No obstante, la resolución únicamente aumenta de forma proporcional a la raíz cuadrada del número de platos.

• RS ~ N

Asimismo, el aumento del número de platos viene limitado por las condiciones experimentales.

• Por ejemplo, el tiempo de análisis y la presión.

Índice

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¿Cómo se puede influir sobre la separación?Interrelación: anchura de pico y altura reducida de un plato teórico

h: altura reducida de un plato teórico

)WW(2/1

ttR

1b2b

2r1rs

p

cs

dh

L4

1~R

)w(fh

)www(fh Caxeddy

Índice

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Ecuación de Van DeemterDifusión turbulenta

wturb ~ λ dp λ: Calidad del relleno de la columna

Diferencias en las vías de difusión causadas por:

Trayectorias diferentes Relleno deficiente

de la columna

Distribución amplia de

tamaños de partícula

Índice

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Ecuación de Van DeemterDifusión axial o longitudinal

Aumento de la anchura de pico debido a la autodifusión del analito.

Si existe un flujo reducido, el analito permanece en la fase móvil durante un tiempo prolongado.

• Notable aumento de la anchura de pico.

• Mayor altura de plato teórico.

Flujo

Índice

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Ecuación de Van DeemterResistencia a la transferencia de masa

wC ~ dp2

Diferentes trayectorias de difusión

Partícula porosa

Capa estacionaria de fase móvil

Índice

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Ecuación de Van Deemter

La ecuación de Van Deemter expresa las variaciones por unidad de longitud de una columna de separación en función de la fase móvil lineal, de forma que tiene en cuenta las propiedades físicas, cinéticas y termodinámicas de una separación (fuente: Wikipedia).

h = f (wturb + wax + wC)

h = A + B/u + C u

• Difusión turbulenta

• Coeficiente de difusión

• Resistencia a la transferencia de masa

Índice

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Ecuación de Van DeemterA

ltu

ra r

ed

ucid

a d

e u

n p

lato

te

órico

(h)

Flujo

Curva total (Van Deemter)

Difusión axial

Difusión turbulenta

Resistencia a la transferencia

de masa

h = A + B/u + C u

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Ecuación de Van DeemterMedidas con diferentes tamaños de partícula

5,0 m

3,5 m

1,8 m

• Las partículas pequeñas reducen la altura de los platos teóricos y, por tanto, aumentan la eficiencia de la separación.

• En el caso de las partículas de menor tamaño, la eficiencia de la separación se ve menos afectada al aumentar el flujo.

Índice

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29

Ecuación de Van DeemterCurvas reales para diferentes analitos

P. Petersson et al. (AZ), J. Sep. Sci., 31, 2346-2357, 2008.

• Ecuación de Van Deemtersolo para análisis isocráticos.

• Específica para compuestos e instrumentos concretos.

• No horizontal incluso para partículas de tamaño inferior a 2 μm.

• La velocidad de flujo óptima depende del compuesto

Índice

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Análisis isocrático:La anchura de pico depende exclusivamente de los procesos de difusión.

Análisis en gradiente:La anchura de pico depende de los procesos de difusión y del gradiente, sobre todo en la cabeza de la columna.

Capacidad de picosAnálisis en gradiente

Altura reducida del plato teórico

en función de la anchura de pico)w(fh 2

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31

La capacidad de picos es el número de picos (n) que se pueden separar en un determinado tiempo con una determinada resolución.

La capacidad de picos depende de diferentes factores, como la longitud de la columna y el tamaño de partícula.

Capacidad de picosDefinición

Capacidad de picos: 32 picos en 2,5 min

Índice

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Capacidad de picosSignificado

“… aplicando la teoría estadística de la superposición de picos…”

“… la resolución de los picos se ve notablemente perjudicada cuando el número de componentes presentes en una muestra supera la tercera parte de la capacidad de picos.”

J.M. DAVIS, J.C. GIDDINGS, ANAL. CHEM., 55 (1983), 418

“… para poder analizar el 98 % de los componentes, la capacidad de picos debe ser mayor que el número de componentes en un factor igual a 100.”

J.C. GIDDINGS, J. CHROMATOGR., A 703 (1995), 3

Índice

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Capacidad de picosCálculo de la capacidad de picos

Simplificación:

wav Anchura media de los picos

n Número de picos

tG Tiempo del gradiente

w Anchura del pico seleccionado

w

t1P G

av

G

n

1

G

w

t1

wn

1

t1P

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Capacidad de picosAnchura de pico

Anchura de pico según el método de la tangente

Anchura de pico a la mitad de la altura

Anchura de pico al 5 % de la altura

Anchura de pico al 4,4 % de la altura (5σ)

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Capacidad de picosEjemplo

min20 40 60 80 100

mAU

0

10

20

30

40

50

min10 20 30 40 50

mAU

0

20

40

60

Columna: 2,1 x 150 mm, 1,8 µm

Retropresión: 402 bar

Capacidad de picos: 313

Columna: 2,1 x 300 mm*, 1,8 µm

Retropresión: 598 bar

Capacidad de picos: 406

* Columna de 300 mm obtenida mediante la unión de dos columnas de 150 mm.Índice

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Más información

Para obtener más información sobre los productos de Agilent, visite los sitios web

www.agilent.com y www.agilent.com/chem/academia.

¿Tiene alguna consulta o sugerencia en relación con esta presentación?Escriba a [email protected].

Publicación Título N.º pub.

Manual técnico The LC Handbook 5990-7595EN

Nota de aplicación The influence of silica pore size on efficiency, resolution and loading in Reversed-Phase

HPLC5990-8298EN

Nota de aplicación Increasing resolution using longer columns while maintaining analysis time 5991-0513EN

Reimpresión de

artículo

A simple approach to performance optimization in HPLC and its application in ultrafast

separation development

PósterStudy of physical properties of superficially porous silica on its superior chromatographic

performance

Nota de aplicación Maximizing chromatographic peak capacity with the Agilent 1290 Infinity LC system using

gradient parameters5990-6933EN

Nota de aplicación Maximizing chromatographic peak capacity with the Agilent 1290 Infinity LC 5990-6932EN

Nota de aplicación Increased peak capacity for peptide analysis with the Agilent 1290 Infinity LC system 5990-6313EN

Sitio webCHROMacademy (acceso gratuito a los cursos online para estudiantes y personal

universitario)

Índice

http://www.agilent.com/

http://www.agilent.com/chem/academia

http://www.chem.agilent.com/Library/primers/Public/LC-Handbook-Complete-2.pdf

http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5990-8298EN.pdf


http://www.chem.agilent.com/Library/articlereprints/Public/Wang X. et al LCGC North America 2010 28 11 932-942 Ultrafast LC.pdf

http://www.chem.agilent.com/Library/posters/Public/Study_Particle_Size_Distribution_Superficially_Porous_Silica_Particles_Pittcon2010_Poster.pdf

http://www.chem.agilent.com/library/applications/5990-6933en.pdf



http://www.chromacademy.com/Agilent-uni.html


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37

GRACIAS

POR SU

ATENCIÓN

Índice 5991-5411ES

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38

Abreviaturas

Abreviatura Definición

α Selectividad

dp Tamaño de partícula

ΔΦ Rango del gradiente

F Velocidad de flujo

h Altura reducida de un plato teórico

(medida del poder de resolución de

una columna)

k Factor de retención, anteriormente

conocido como factor de capacidad (k')

Lc Longitud de la columna

λ Calidad del relleno de la columna

N Eficiencia o número de platos de la

columna

P Capacidad de picos

R Resolución

Abreviatura Definición

t Tiempo

tr Tiempo de retención

t0 Tiempo muerto de la columna

tG Tiempo del gradiente

Vm Volumen de la columna

w Anchura de pico

W1/2 Anchura de pico a la mitad de la altura

Wbi Anchura de pico en la línea de base

wturb Difusión turbulenta

wax Difusión axial o longitudinal

wC Resistencia a la transferencia de masa

wav Anchura media de los picos

Índice

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