Metode u citogenetici

dr. sc. Vesna Boraska

Ljudski genom

Genom: skup svih molekula DNA koje čine nasljedni materijal određene vrste organizma

Gen: temeljna jedinica nasljeđivanja koja određuju neko svojstvo

  Kromosom: struktura u stanici koja

nosi DNA, sastoji se od proteina i DNA molekule

Kromosom svaki kromosom sadrži jednu linearnu dvolančanu DNA čija

veličina varira 50-250 milijuna baza kromosom se sastoji od > 1000 gena, koji su u rangu

veličine od nekoliko tisuća pa do 2 milijuna baza za vrijeme staničnog ciklusa, interfaze, kromosomi su

slabije kondenzirani i ne mogu se prepoznati kao zasebna tjelešca

za vrijeme stanične diobe, mitoze, kromosomi podliježu visokom stupnju kondenzacije i tek se tada raspoznaju kao zgusnuta tjelešca unutar st. jezgre

Kromosomsko bojenje kromosomi su maksimalno vidljivi i prepoznatljivi u metafazi st.

ciklusa veliki korak u humanoj citogenetici: tehnike bojenja karakteristične horizontalne linije na kromosomima

1) identifikaciju svih kromosoma2) prepoznavanje strukturnih promjena3) prepoznavanje lomova kromosoma

Kromosomska bojanja su omogućila prepoznavanje ogromnog broja kariotipskih aberacija (abnormalnosti) te stvaranje fizičke i genetičke mape kromosoma.

Ljudski kariotip skup svih kromosoma porijeklom iz jedne stanice naziva se

kariotip kariotip humane diploidne (2n) normalne stanice ima 46

kromosoma, a čine ga 22 para autosoma i 2 spolna kromosoma (2X kromosoma za žene ili X i Y kromosomi za muškarce)

poremećaj broja i strukture kromosoma nazivamo kromosomskom aberacijom

svaki poremećaj broja ili ustroja kromosoma uzrokuje teške poremećaje funkcije, koji izazivaju višestruka oštećenja fenotipa

Kariotip muškarca i žene

Y

X

X X

Kariogram

grafički prikaz kariotipa pri čemu su kromosomi poredani po veličini

Standardna citogenetika

za rutinsku analizu kromosoma metode pruganja omogućuju identifikaciju pojedinih

kromosoma na temelju rasporeda svjetlije i tamnije obojenih regija uzduž krakova kromosoma

aberacije koje zahvaćaju manje segmente DNA nije moguće sa sigurnošću otkriti metodama klasične citogenetike pa se koriste molekularne metode

Primjena citogenetičkih metoda

1. prenatalno zbog sumnje na postojanje kromosomskih aberacija zbog

obiteljske anamneze ili zbog starosti majke (> 35 godina)→ analiza stanica iz plodove vode→ analiza pobačenog ploda

2. postnatalno→ tumorska citogenetika→ citogenetika kod djece s multiplim malformacijama→ citogenetika bračnih parova sa sterilitetom

G-pruge najučestalije se koriste u standardnoj citogenetici ime po Giemsa boji (akridine orange i metilene blu) kromosomi se tretiraju sa slanom otopinom na 60 °C ili s

proteolitičkim enzimom (tripsin) koji uništava proteine, a potom boje Giemsa bojom

tamne pruge nas usmjeravaju na postojanje heterokromatina i AT bogati dio kromosoma

svjetlije pruge nas usmjeravaju da bi to mogao biti eukromatin i GC bogati dio kromosoma

pomoću pruganja G-metodom moguće je otkriti poremećaje segmenata kromosoma veličine 5Mb

Kariotip nakon G-bojenja

Q-pruge

1970. otkrivena DNA-vezujuća fluorokromatska boja quinacrine mustard

quinacrine je planarna molekula koja se interkalira između nukleotidnih baza u DNA

Q-pruge daju istu informaciju kao G-pruge samo što se svjetle Q-pruge prikazuju kao tamne G-pruge i obrnuto

kromosomi pokazuju fluorescentne linije različitog intenziteta, pregled fluorescentnim mikroskopom

Q-pruge

obe tehnike (G i Q pruganje) stvaraju otprilike 300 pruga u haploidnom metafaznom genomu te 850-1250 pruga u prometafaznom i profaznom (jer su duži)

najintezivnije se vide satelitne DNA regije izrazito bogate AT pb te duža ruka Y-kromosoma

nema predtretmana – morfologija ostaje očuvana intezitet boje se može mjeriti

Kariotip nakon Q-bojenja

C-pruge

kromosomi se najčešće kratko tretiraju s kiselinom, potom s lužinom (barij hidroksid), a na kraju se boje Giemsa bojom

C-pruge boje mjesta oko centromere jake C-pruge se vide na krom 1, 9, 16 i distalno na Y-

kromosomu različite boje uzrokuju različita, ali i slična obojenja

pojedinih kromosoma: Q-bojenjem Y-krom izgleda jednako C-bojenju, ali npr. dijelovi 1, 9, 16 krom nisu svjetli nego tamni

Kariotip nakon C-bojenja

R-pruge

R-pruge (“reverse”) su otprilike pruge obrnute od G-pruga tamnije regije su eukromatin, a svijetla područja

heterokromatin kromosomi se tretiraju s vrućom lužinom i potom boje

Giemsa ili acridine orange bojom acridine orange može interkalirati među nukleotidne baze i

tada svjetli žuto dobro za uočavanje strukturalnih promjena na krajevima

kromosoma

Kariotip nakon R-bojenja

Heteromorfizmi veličina Q i C-pruga varira između ljudi: heteromorfizmi heteromorfizmi najčešće nastaju prilikom inverzija velikih

heterokromatinskih dijelova DNA konstitutivni heterokromatin ne sadrži gene i ne transkribira se,

stoga heteromorfizmi, odnosno varijacije C-pruga, ne utječu na fenotip

heteromorfizmi se koriste kod testiranja očinstva, razlikovanja jednojajčanih od dvojajčanih blizanaca, kod otkrivanja trisomija ili triploidija prilikom određivanja roditelja koji je prenio višak kromosoma

nove preciznije tehnike su više u upotrebi

Bojenje u visokoj rezoluciji

profazni i prometafazni kromosomi su puno duži od metafaznih kromosoma

na njima se vidi puno više pruga i zbog toga se najčešće koriste za prepoznavanje malenih strukturalnih promjena

za visoku rezoluciju se stanice dovode u istu fazu: zaustavljanje u S-fazi staničnog ciklusa ametopterinom (metrotreksatom), otpuštanje velikog broja stanica iz S-faze u mediju bogatom timidinom = sinhroniziranje stanica i bojenjem kromosoma u željenoj fazi (npr. prometafazi)

Ostale vrste bojenja

postoji još puno fluorokromatskih boja koje se koriste u citološkim bojenjima

→ neke se vežu specifično za AT pb (DAPI)→ neke se vežu specifično GC pb (kromomicin) postoje i nefluorescentne boje koje se specifično vežu

za pojedine baze→ metil-zeleno se veže za AT pb→ aktinomicin se veže za GC pb

kariotip psa lijevo su DAPI

obojeni metafazni kromosomi

desno su inverzni DAPI kromosomi

Priprema kariotipa direktne ili indirektne metode obrade koštane srži, periferne krvi, limfnog

čvora i tjelesnih izljeva potrebno je uzgojiti stanice u kratkotrajnoj kulturi 24-satnoj ili nešto dužoj 48-

72 satnoj staničnoj kulturi s primjenom faktora rasta ili mitogena ili bez njih standardna tehnika pruganja uključuje slijedeće postupke:

1. zaustavljanje dijeljenja stanica u metafazi primjenom kolhicina ili kolcemida 2. razbijanje stanica u hipotoničnoj otopini3. fiksaciju stanica u metanolu i octenoj kiselini

Priprema preparata za vizualizaciju

4. smještanje kromosoma u jednu ravninu “squash” tehnikom (gnječenjem)

5. bojenje kromosoma6. pregled kromosoma pod

svjetlosnim ili fluorescentnim mikroskopom

7. slikanje, izrezivanje kromosoma i izrada kariograma

Bojenje antitijelima

imunocitokemijske studije su korištenjem antitijela na adenin i citozin prve pokazale da kromosomske pruge odražavaju razlike u sastavu baza (anti-A i anti-C antitijela)

antitijela se vezuju za baze u jednolančanoj (denaturiranoj) DNA, ali ne u dvolančanoj DNA

razvijen je veliki broj antitijela koji se vezuju za specifična mjesta na DNA molekuli: antitijela na acetilirane histone ili na metilirane baze npr. antitijela na 5-metilcitozin proizvode C-pruge

Korištenje restrikcijskih endonukleaza

restrikcijske endonukleaze (RE) cijepaju DNA na točno određenim slijedovima

ako je slijed DNA promijenjen RE ne cijepaju DNA RE se koriste za cijepanje C-pruga na svojim slijedovima i za

analizu heteromorfizama

Nazivlje (nomenklatura) strukturnih dijelova na obojenim kromosomima

predložena na konferenciji u Parizu 1971. godine telomere, centromere i brojne jake pruge se koriste kao

mjesta prepoznavanja (oznake) dijelovi kromosoma između dviju oznaka se nazivaju

područjima (regijama) i numerirana su brojevima 1, 2, 3 i 4 na p ("p" za "petit") i q ("q" za "queue") kraku počevši od centromere

pruge su numerirane na isti način ideogram

Nazivlje

bojenje u visokoj rezoluciji je dovelo do dodatnih podjela u ideogramskom prikazu tj. do pojave subpruga

subpruge se označavaju točkom i brojem iza nje kada su subpruge dodatno podijeljene u još pruga tada se

pri imenovanju dodaje još jedan broj najnovije nazivlje je standardizirano ISCN (International

System for Human Cytogenetic Nomenclature) dogovorom 2005. godine

Ideogram kromosoma

ISCN nomenklatura

t – translokacija: prijenos genetskog materijala s jednog kromosoma na drugi

ins – insercija: jedan dio kromosoma premjestio se na novu poziciju u istom ili nekom drugom kromosomu

inv – inverzija: označava rotaciju dijela kromosoma za 180° del – delecija: označava gubitak dijela kromosoma dup – duplikacija: prisutnost dodatne kopije dijela

kromosoma

ISCN nomenklatura i – izokromosom: sastoji se od dvaju krakova od kojih je jedan

krak zrcalna slika drugog kraka r – ring kromosom: označava kromosom koji ima izgled

prstena mar – marker kromosom označava bilo koju strukturnu

promjenu kromosoma koja se ne može objasniti standardnim terminima

der – derivirani kromosom: strukturna promjena koja uključuje dva ili više kromosoma

(+) plus ili (-) minus označava višak ili manjak pojedinog kromosoma

In situ hibridizacija metoda koja se koristi za identifikaciju specifičnih manjih dijelova

kromosoma npr. ako nam je poznata sekvenca nekog gena (najčešće preko

Human Genome projekta), ali ne znamo na kojem je kromosomu lokalizirana, upotrijebit ćemo ovu metodu radi pronalaženja točne lokacije gena

sjedinjuje citogenetičke i molekularne metoda ispitivanja, a temelji se na hibridizaciji komplementarnih sekvenci nukleinskih kiselina

procesom denaturacije ili disocijacije razbijaju se nekovalentne vodikove veze između komplementarnih baza i dolazi do razdvajanja lanaca DNA

In situ hibridizacija

denaturacija se može postići povišenjem temperature, dok se njenim snižavanjem obnavljaju vodikove veze, a lanci DNA se ponovo sparuju – renaturacija

korištenjem fluorescentnih DNA ili RNA probi mogu se detektirati određeni DNA slijedovi (npr. geni) na nitroceluloznom filteru (molekularna hibridizacija) ili na citološkim preparatima (in situ hibridizacija)

prisutnost ili odsutnost fluorescentnog signala upotrijebljene DNA probe ukazuje na prisutnost ili odsutnost specifičnih DNA sekvenci u genomu pojedinih stanica

In situ hibridizacija ponavljajućih i jedinstvenih DNA slijedova

DNA ili RNA probe mogu biti obilježene radioaktivnim izotopima ili fluorescentnim bojama (FISH)

probe hibridiziraju na denaturirane metafazne kromosome koji su fiksirani na podlogu

pod strogo određenim uvjetima temperature i koncentracije soli događa se sparivanje probe i isključivo njenih komplementarnih slijedova

samo vodikove veze formirane između komplementarnih baza ostaju stabilne

mjesta hibridizacije se određuju autoradiografski (kod radioaktivnih probi) ili prema fluorescenciji

Hibridizacija probe

Postupak izrade

uzorak suspenzije metafaznih kromosoma se suši na mikroskopskom staklu i tretira s formamidom da kromosomi postanu denaturirani, ali se čuva karakteristična metafazna morfologija

dodavanje i lokalizacija probe koja je hibridizirala sa kromosomalnom DNA

Fluorescentna in situ hibridizacija - FISH

DNA probe se u FISH tehnici mogu detektirati na 2 načina:

1. DNA probe se mogu označiti s nekoliko kemijskih skupina (bromodeoksiuracil, digoksigenin, dinitrofenol) koje se potom detektiraju sa specifičnim fluorescirajućim antitijelima

2. fluorescentne skupine mogu biti kovalentno vezane za DNA probu pa nema potrebe za dodavanjem neke druge fluorescentne molekule koja se vezuje za probu

postoje kromosomski specifične fluorescentne boje koje različite kromosome “boje” različitim bojama

FISH – rezolucija i primjena FISH je moguće izvoditi u interfaznim stanicama stoga je moguće

obuhvatiti veći broj stanica te se metoda koristi za ispitivanje i procjenu mozaicizma

fluorescentno obilježene probe pokazuju jaku rezoluciju i dobre su za mapiranje gena

vrlo osjetljivim digitalnim kamerama i računalnom obradom može se detektirati gotovo svaki signal

FISH detektira hibridizaciju na slijedove kratke čak 1 kb može se detektirati jedinstven RNA transkript te odrediti broj RNA

transkripata pojedinog gena u stanici u ispitivanju i otkrivanju submikroskopskih poremećaja genoma

Interfazne stanice s translokacijom t(9;22)

Kromosomske i lokus specifične probe

mogu se stvarati biblioteke probi – kolekcija probi dobivena kloniranjem fragmenata DNA, ubačena u odgovarajući vektor (plazmid, lambda fag, kozmid) i umnožena u odgovarajućem domaćinu (npr. bakterijama)

1988. godine su prvi put upotrijebljene biblioteke probi specifičnih za pojedine kromosome

koriste se za otkrivanje strukturalnih i brojčanih kromosomskih promjena

PCR-om (engl. polymerase chain reaction – lančana reakcija polimerazom) se mogu napraviti lokus-specifične probe tj. probe specifične za neki gen, odnosno dio genoma

FISH – detekcija kromosoma 18

Raznobojni FISH i spektralni kariotip

raznobojni FISH (engl. multicolor FISH) ili M-FISH i spektralni kariotip ili SKY omogućavaju rutinske detekcije svakog kromosoma u metafaznoj ploči

ove dvije metode koriste 24 kromosomske probe i 5 florokromatskih boja

zbog specifičnih kombinacija hibridiziranja probi i njihovog obilježavanja dolazi do različitog obojenja svakog kromosoma

ove metode ne mogu detektirati intrakromosomske promjene (npr. delecije, duplikacije, inverzije), ali su jako dobre za uočavanje promjena u broju kromosoma te za detekciju strukturalnih promjena kao što su translokacije

M-FISH

Interfazni FISH

razvijene su tehnike kojima se može obojati kromatin u interfaznoj, hipotonično-nabubrenoj jezgri

razdaljine između probi na kromatinskim nitima direktno odgovaraju stvarnim molekularnim razdaljinama – mogu se mjeriti veličine raznih struktura

mnogobrojne probe i raznobojne fluorofore za obilježavanje omogućavaju točniju analizu i precizniju detekciju finih promjena u strukturi kromosoma

a i b) histološki prikaz koštane srži – velike atipične limfoidne stanice

c i d) kariotipovi dobiveni G-bojenjem

e i f) M-FISH kariotipovi

g i h) FISH sa specifičnim probama za gene IGH (14q32) i BCL2 (18q23)

Hvala na pozornosti!