หลักการตรวจวัดดวยเครื่องวัดความเขมแสงPrinciple of photometric assay

���ก����ก����� ��ก����

Nephelometry Tubidimetry Tubidimetry Tubidimetry Tubidimetry ก��������������

��������ก���� ���� ��ก����������ก���

��� ก ก���!������"�#��

$���������%���������" �

� ��ก����AbsorptionAbsorptionAbsorptionAbsorptionphotometryphotometryphotometryphotometry

Reflectance photometry

$���������%���������" �

ความเขมของพลังงานแสง แปรผันตามจาํนวนโมเลกุลสาร

Fluorescent photometryFlame emission photometryFlame emission photometryFlame emission photometryFlame emission photometry ก���ก��'����"��ก( exited atom exited atom exited atom exited atom ��� flameflameflameflameChemiluminescent photometryChemiluminescent photometryChemiluminescent photometryChemiluminescent photometry ก���ก��'������$)(ก(�(��� �

1

Absorption spectrophotometry

Atomic absorption spectrophotometry

การวัดคาดูดกลืนแสงของสารละลาย

การวัดคาดูดกลืนแสงของอะตอมอิสระ

Emission photometry

Fluorometry

การวัดคาความเขมแสงที่ปลอยจากอะตอมอิสระ

การวัดคาการเรืองแสงของสารละลาย

การวัดความขุนของสารแขวนลอยTurbidimetry and nepleometry

Reflectometry

การวัดความขุนของสารแขวนลอย

การคาความเขมแสงสะทอนจากวัตถุ

2

วัตถุประสงคการเรียน1. อธิบายวิธกีารคํานวณหาความเขมขนของสาร โดยใช

Beer and Lambert’s law2. บอกองคประกอบสําคัญและอธิบายหลักการทํางานของ

เครื่อง VIS/UV absorption spectrophotometerเครื่อง VIS/UV absorption spectrophotometer3. บอกปจจัยที่มีผลตอความถูกตองของการนํา Beer and

Lambert’s law มาประยุกตหาความเขมขนของสาร4. บอกวิธีการตรวจสอบเครื่อง VIS/UV absorption

spectrophotometer5. บอกวิธีการนํา test tube มาทําเปน cuvette6. บอกองคประกอบสําคัญและอธิบายหลักการทํางานของ6. บอกองคประกอบสําคัญและอธิบายหลักการทํางานของ

เครื่องวัดความเขมแสงแบบตางๆ7. บอกปจจัยที่มีผลตอความถูกตองของการวัดความเขมแสง

แบบตางๆ

3

แสง(light)เปนพลังงานรูปแบบหนึ่ง มีคุณสมบัติคลายคลื่น

เปนรังสีแมเหล็กไฟฟา(electromagnetic radiant)

ความยาวคลื่น ; l จํานวนรอบการเคลื่อนที่/วินาที

ความถี่ ; n

4

อัตราความเรว็การเคลื่อนที่ของแสง (c)

ในสูญกาศ ประมาณ 3.0x1010 ซม./วนิาที

คุณสมบัติของแสงคุณสมบัติของแสง

• อัตราความเร็วการเคลื่อนที่; c• ความยาวคลื่นแสง; λλλλ• ความถี่; νννν

C = νλ

5

%�������� ����ก�� �*'�� ; E

E = hννννE = hννννh ��� Planck�s constant

6.62x10-27 erg.sec

cE = h

c

λλλλ6

������ ���"+����'�!�����'

300 nmnmnmnm 400 500 600 700 800

������ ���"+�(Visible light)

���'�!�����'UV light

CosmicCosmicCosmicCosmicraysraysraysrays

GammaGammaGammaGammaraysraysraysrays

XXXX----raysraysraysrays FarFarFarFarUVUVUVUV U

VU

VU

VU

V InfraredInfraredInfraredInfrared MicrowavesMicrowavesMicrowavesMicrowaves Radio wavesRadio wavesRadio wavesRadio waves

������ ��"�+ก!**,(electromagnetic radiant)

10 - 6

10 - 4

10 - 2

10 2

10 10 4

10 6

10 8

10 10

10 12nmnmnmnm

EnergyEnergyEnergyEnergy WavelengthWavelengthWavelengthWavelength

raysraysraysrays raysraysraysraysXXXX----raysraysraysrays

UVUVUVUV UV

UV

UV

UV InfraredInfraredInfraredInfrared MicrowavesMicrowavesMicrowavesMicrowaves Radio wavesRadio wavesRadio wavesRadio waves

7

ความยาวคลื่น ( nm )

��-�������� ���"+�

��-��������

สีของแสงที่มองเห็น และ สีคูสมมาตร(สีของสารละลาย)

������ ���"+� ������

Violet

Blue

Green

Yellow

Yellow blue

Yellow

Red

Blue

400-435

435-500500-570

570-600

Yellow

Orange

Red

Blue

Green-blue

Green

570-600600-630630-700

8

เครื่องวัดคาดูดกลืนแสงของสารละลายนํามาใชสําหรับนํามาใชสําหรับ

วัดความเขมขนของสารละลาย

9

Absorption spectrophotometryการวัดคาดูดกลืนแสงของสารละลาย

Spectrophotometry

เครื่องวัดคาดูดกลืนแสงของสารละลายเครื่องวัดคาดูดกลืนแสงของสารละลายSpectrophotometer หรือ Photometer

วัดความเขมแสงกอนและหลังใหแสงผานสารละลาย

10

.�������-� Cuvette ������ cuvette

��$ก��/�����

"��%��������� .��������ก (exit slit)

��$ก��/�����%���������

������ก���������ก���

.��������ก (exit slit)

GratingPrism

Filters 11

Band pass ��� .����� ����������������.��������ก(exit slit) -��������ก���������ก��������

100% peak height

Nominal band pass(width) and half-band pass(width)

100% peak height

50% peak height

half-band pass

Rad

iant Ene

rgy Intens

ity

λλλλ0λλλλ1 λλλλ2

Band pass

half-band pass

Rad

iant Ene

rgy Intens

ity

Wavelength, nm12

แสงกอนผานตัวกลางความเขมแสง = IO

แสงผานตัวกลางความเขมแสง = IS

แสงกอนผานตัวกลางความเขมแสง = IO

แสงผานตัวกลางความเขมแสง = IR

Transmittance (T) =IS =

IS

% Transmittance (%T) = 100T

Transmittance (T) =IS =

IS

IO IR

13

แสงกอนผานตัวกลางความเขมแสง = IR

แสงผานตัวกลางความเขมแสง = IS

I ITransmittance (T) =

IS =IS

IO IR

% Transmittance (%T) = 100T

Absorbance (A) = - log T = log1TT

หรือ Optical Density (O.D.) = logIR

IS

14

ความสัมพันธระหวาง A และ %T

Absorbance (A) = log1TT

Absorbance (A) = log100

100T

Absorbance (A) = log 100 – log 100T

A = 2 – log %T

15

Beer’s LawBeer’s Law

A = a b CA = a b C

16

b = ความกวาง หรือ ระยะทางที่แสงผาน( cm )

Incident Light [ Io ] Transmitted Light [ It ]

C = ความเขมขนของสารละลาย หรอื ความเขมขนของตัวถูกละลาย

b

*ตัวทําละลายไมดดูกลืนคลื่นแสง( g/L)

b

b b

ααααA C

C ก-#0�, b �����

b ก-#0�, C �����

Beer�s law

Lambert�s law

A = a b C

A bααααb ก-#0�, C �����Lambert�s law

17

A = a b CBeer and Lambert’s Law

ถา C มีหนวยเปน g/La : absorptivity coefficient (สัมประสิทธิ์การดดูกลืนแสง)

ถา C มีหนวยเปน mole/L

L . g-1.cm-1

ถา C มีหนวยเปน g/L

L . mol-1.cm-1

ε ε ε ε : molar absorptivity coefficientถา C มีหนวยเปน mole/L

18

วัดคาการดูดกลืนแสงของสารละลาย NADH ที่ความยาว คลื่น 340 nm โดยใช cuvette กวาง 1 ซม. ไดคาเทากับ 0.350 เมื่อคํานวณความเขมขนของ NADH จะไดดังนี้

C = 5.6x10-5 mol/L

0.350 = 6.22x103 L.mol -1.cm -1 x 1 cm x C

A = ε ε ε ε bC

( molar absorptivity of NADH ที่ 340 nm = 6.22x103 L.mol-1.cm-1 )

C = 5.6x10-5 mol/L

= 5.6x10-5 x 106 µµµµmol/L

= 56 µµµµmol/L

19

0.8

Absorbency[A] A = ab C

กราฟมาตรฐานสําหรับเทียบคา

0.2

0.4

0.6

0.8

Sample absorbance

Sample

concentration

0.0

0.2

0 100 200 300 400

Concentration[C]

concentration

20

100.00

%T (plot on linear scale)%T = 10(2-abC)

A = a b C 2-log%T = abC Log%T = 2-abC

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00 %T = 10(2-abC)

Sample

concentration0.00

20.00

0 100 200 300 400

Concentration[C]

concentration

21

100.00

%T (log scale) Log %T = -a bC + 2

A = a b C 2-log%T = abC Log%T = 2-abC

10.00

100.00

Sample

1.00

0 100 200 300 400

Concentration[C]

Sample

concentration

22

Astd = ab Cstd

A = ab C

หลอด standard

หลอด sample

คํานวณเทียบกับหลอดมาตรฐาน

Aunk = ab Cunk หลอด sample

Calculation FactorAstd =Cstd

Aunk Cunk

หรือCunk =Aunk x CstdAstd

Cunk =Cstd x AunkAstd

23

Absorption of standard solution = 0.500

Absorption of sample solution = 0.350

Standard concentration = 200 mg/dl

(Astandard)

(Asample)

Cal. factor

Cunk =Aunk x CstdAstd

Cunk =0.350

X 2000.500

= 140 mg/dl

Cal. factor0.500

24

ขอควรระวัง! การคํานวณ & การเทียบจากกราฟผลคํานวณที่ได ตองไมเกิน linearity

Absorbace[A]

A = abC เปน Linear equation

linearity

Slope = ab = ∆∆∆∆Astd

∆∆∆∆Cstd

Absorbace[A]

Calculation Factor

AStd

AUnk1

AUnk2

linearity

1=

Cstd

slope Astd

∆∆∆∆AstdCalculation Factor

CUnk1 CUnk2CStd

AUnk1

Concentration [C] Cunk = Aunk xCstd

Astd

∆∆∆∆Astd

∆∆∆∆Cstd

00

25

I4 I3

I4 I4 &'()*)ก,-./01

)*)ก,-./01&)2 1 0(4.

ก567085,9,8:'7;48'<=2'=2.'8ก>

I4

I3

I3 I2

I3 I2 I1I4

)*)ก,-./01&)2 2 0(4.

)*)ก,-./01&)2 3 0(4.

I1I2I3 I?

I?

I4

I4

)*)ก,-./01&)2 ?

)*)ก,-./01&)2 ????26

1. สารละลายมีความเขมขนมากเกินไป

ปจจัยที่ทําใหคา A และ C ไมเปนตาม Beer’s Law

2. คลื่นแสงที่ใชวัดไมใชแสงความยาวคลื่นเดียว

3. มีแสงนอกระบบการวัด(stray light)มาก

4. ตัวทําละลายรบกวนระบบการวัดความเขมแสง เชน

ดูดกลืนแสงที่ใชวัดดวย ปลอยคลื่นแสงอื่นออกมา ดูดกลืนแสงที่ใชวัดดวย ปลอยคลื่นแสงอื่นออกมา

5. ผิวของภาชนะที่ใชวัด(cuvette)ไมเรียบเสมอกัน

27

∆∆∆∆A

Substrate depletionA

∆∆∆∆T

∆∆∆∆A

Lag pahse

Time

Lag time Interval reading Continuous-monitoring assay(Kinetic assay or Rate assay)

Fixed-time for Reading

1st Read 2nd Read

(Kinetic assay or Rate assay)

Two-point kinetic assayor Two-point rate assay

End-point assay

28

Glucose + o-toluidine ----> glucosamine complex

$)(ก(�(�'����� glucose ����01� o-toluidine

max 630 nmλλλλWater / Standards / Samples + ReagentWater / Standards / Samples + Reagent

Incubation

�� Abs / %T Calculation

Blank Standards Samples

�����ก�� Standard curve

29

กราฟมาตรฐานสําหรับการตรวจวัดกูลโคสดวยวิธีo-toluidine reaction ( 10 ม.ค. 2555 )

1.200

1.4001.600

63

0 n

m

0.200

0.4000.600

0.800

1.0001.200

Ab

sorb

ance

at

63

0

Linearity ของการตรวจวัด

0.0000.200

0 200 400 600 800 1,000 1,200กูลโคส (mg/dL)

Ab

sorb

ance

at

30

L-lactate + NAD+ Pyruvate + NADHLDH

LDH(Lactate dehydrogenase) Activity Measurement

A = abCA = abC

C = A

=A

εεεεbεεεε (

L) x b (cm)

moles x cm

NADH = A

moles/L of total solution volumeεεεεb

31

1 U/L = µµµµmoles/minute/L of sample volume

1 U = µµµµmol/minute

นิยามของ Enzyme activity :

NADH = A

moles/L NADH = A

moles/L of total solution volumeεεεεb

NADH = ∆∆∆∆A/min

moles/minute/L of total solution volumeεεεεb

NADH = ∆∆∆∆A/min x 106

µµµµmoles/minute/L of total solution volumeεεεεb

NADH = µµµµmoles/minute/L of total solution volumeεεεεb

NADH = ∆∆∆∆A/min x 106

xTotal Reaction solution volume

εεεεb Sample volume

µµµµmoles/minute/L of Sample volume32

สูตรคํานวณคา Enzyme activity(ตรวจวัดโดยวิธี Kinetic assay)

Enzyme (IU/L) = ∆∆∆∆A/min x 106

xTotal Reaction solution volume

εεεεb Sample volume

Calculation FactorCalculation Factor

33

ตัวอยาง: Sample volume (0.1 ml)+ Reagent volume (3.0 ml)

0.010 A/min

( εεεε of NADH ที่ 340 nm = 6.22x103 L⋅⋅⋅⋅mol-1⋅⋅⋅⋅cm-1 )

Enzyme (IU/L) = ∆∆∆∆A/min x 106

xTotal Reaction solution volume

εεεεb Sample volume

0000....010010010010 x 106 3.1

= 49.8 ~ 50 U/L

Enzyme (IU/L) = 0000....010010010010 x 106

x3.1

6.22 x 103 x 1.0 0.1

34

ก�'���������2%ก�'���������2%����������� ก������-��

������������

35

ก�$����� � ก'���-���� ����������Wavelength calibration

Amplifier &

GratingEntrance Slit

0.852Energy Lamp

Amplifier &

Display device

Mirror

Monochromator Cuvette

Photodetector

Mirror

630 nm

36

Holmium oxide

241.5 + 0.2

279.4 + 0.3

287.5 + 0.35

333.7 + 0.55

Peak(nm)

Potassium dichromate solution

0.04 g/L in 0.5 N KOH

Peak=> 374+4 nm

Cobalt chloride solution333.7 + 0.55

360.9 + 0.75

418.4 + 1.1

453.2 + 1.4

536.2 + 2.3

637.2 + 3.8

Cobalt chloride solution

44 g/L in 1% HCl

Peak=> 512+5 nm

Peak=> 540+4 nm

Oxyhemoglobin solution

Red cell in 0.05% NH4OH

Didymium filter :

Peak => 585 nm

Peak=> 540+4 nm

576+4 nm

37

Absorbance accuracy

Potassium dichromate solution

120 mg/L in 0.01 N H2SO4 257 nm => 1.738+0.03 Abs.

ก�'�������� � ก'���-��ก� ก������

Copper sulfate solution

Cobalt sulfate solution

4 g% in 1%H2SO4

4 g% CoSO .(HN ) SO .6H O in 1%H SO

357 nm => 1.288+0.02 Abs.

650 nm => 0.448 Abs.

510 nm => 0.48 Abs.

4 g% CoSO4.(HN4)2SO4

.6H2O in 1%H2SO4

Neutral density filters

38

Absorbance linearity

ก�'�������� �$3�����'��-����ก� ก������

Copper sulfate solution in 1%H2SO4

0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 g%

Potassium dichromate solution in 0.5 N KOH

0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 g%

Stray light checking

ก�'�����������ก��Stray light checking

ก�'�����������ก��Stray light filter ����� ��'( ก�����������!�" => 0 %T "��� '����- Abs. ก��%�(�

39

Cuvette calibration

A + 0.002 Abs.

%T + 0.5%T

Incident light

0.01 g%(w/v) Potassium ferricyanide420 nm

40

41

Function KeyF1, F2, F3, F4

Specific Function Keys

Display Screen

Specific Function KeysGo to λAuto ZeroEnterReturnStart/Stop

������(����

Numeric KeysSample HolderMulti-cell holderSipping cell holder

42

43

Initialization

ROM Check :

RAM Check :

λλλλ Org.(coarse) :

: Pass

λλλλ Org.(coarse) :

Multi-Cell Org. :

W Lamp Energy :

λλλλ Org.(fine) :

D2 Lamp Energy :D2 Lamp Energy :

λλλλ Check :

44

Menu

1. Photometric measurement

2. Option prog pack

500.00 nm 0.000A

2. Option prog pack

3. Utilities

Select item No.

Params

F1 F2 F3 F4 45

Photometric

λλλλ :

500.0 nm500.0 nmData:

0.000 ABSSelect item No.

%T / ABS SmplCntl DataDisp SavParam

F1 F2 F3 F4 46

Photometric 500.00 nm 0.236A

Smpl No. ABS. K*ABS1 0.237 0.23661 0.237 0.2366

2

Smpl No. SmplCntl Factor K 1.000

F1 F2 F3 F4

=

47

Sample control

1. Sample module: Sipper

2. Pump speed: Fast

500.00 nm 0.000A

3. Sipping time: 4.0 sec.

4. Dwell time: 1.0 sec.

5. Purge time: 4.0 sec.

6. No. of rinses: 0

Select item No.

Manu.Sip

F1 F2 F3 F4

Off

48

49

-�0�'��$)(��'(��ก��.�������� Shimadzu

1. ����ก mode �� ABS/%T & '�0��� λλλλ ���'���ก��.���2. ��� cuvette ������������ blank ����.������ cuvette

$45���� sample holder$45���� sample holder

3. ก Auto Zero �%���$����� �"�!� 0.000ABS/100%T

4. �1 cuvette ������������ blank ��ก5. ����������'������ ����� cuvette ������5. ����������'������ ����� cuvette ������

������ '������ ����.������ cuvette $45������������

50

-�0�'��$)(��'(��ก��.�������� Shimadzu(�.� sipper unit)

1. ����ก mode �� ABS/%T & '�0��� λλλλ ���'���ก��.���2. '�0��$��ก� ก��1��-�� sipper unit

3. '�0� sipper �"��1����� Manual On3. '�0� sipper �"��1����� Manual On

4. �01ก������� flow-cell

5. ������ blank �"������ ��� flow-cell

6. ก Auto Zero �%���$����� �"�!� 0.000ABS/100%T6. ก Auto Zero �%���$����� �"�!� 0.000ABS/100%T

7. ������ blank ��ก & ก Return

8. ��������'������51

'�0�ก��� photometric mode !�

ก����$)(��'(ก���ก���0� ��$��� (�ก��.��������spectrophotometer ��������'��!$��0

'�0�ก��� photometric mode !�'�0� mode ก���!� ( ABS / %T )

'�0� λλλλ ����.���!�'�0� λλλλ ����.���!�set blank !�

52

Sample control

1. Sample module: Sipper

2. Pump speed: Fast

500.00 nm 0.000A

3. Sipping time: 4.0 sec.

4. Dwell time: 1.0 sec.

5. Purge time: 4.0 sec.

6. No. of rinses: 0

Select item No.

Manu.Sip

F1 F2 F3 F4

On

53

�1���56ก"� "�� 23-27

54

������'��ก��

Reflectometry

ก����� �-� ����������ก��'��

Optical Density "��� A

A = log (I /I )���ก������'��ก�� ������'��ก��

�� �-� ��� ISA = log (IO/IS)

���ก������'��ก���� �-� ��� IO

���ก���ก�����(���'���� �-� ��� R

Reflection Density; DR�� �-� ��� RO

����������ก�(���'���� �-� ��� Rtest

Reflection Density; DR

DR = log (RO/Rtest)

55

Filters "��� Wavelength

Reflectance spectrophotometer���� �-� ����������ก�(�-����

Light

Source Slit

Wavelength Selector

Collimating len "��� Slit

Test surface

DetectorReadout device

Collimating len "��� Slit

56

o

Compounds ( A+Cl

- )

heat� �� ก��� hvGround state

Combustion process

Atomic absorption spectrophotometry

A+ vapor + e

- -----> A

o vapor

� �� ก��� hv

A* vapor

Ground state

Excited state ( unstable )

hv heat

OxygenOxide

High temperature

Vaporized atoms in the group state (Ao ) absorb light at very narrowly

defined wavelengths. [ 0.001 - 0.01 nm ]

Excited state ( unstable )Oxygen

Oxide

57

Hollow-cathode

Monochromator

Photomultiplier tube

Readout device

Line spectrum light

cathode lamp Chopper Burner

tube

Sample solution

���/$��ก��%�0�7�-������������� ก������-����'� ���/$��ก��%�0�7�-������������� ก������-����'�

Atomization = convert chemicals to atomic vapor

Nebulization= convert solution to a fine spray or aerosol

Burner

58

Burner head

Flow spoiler

Type of burner Total consumption burner

Premix burner ( laminar-flow burner )

Fuel gas

Oxidant

Flow spoiler retaining screw

Nebulizer

Burner head locking ring

Pressure relief vents

Sample capillary

Nebulizer

Nebulizer oxidant

Flow spoiler

Nebulizer adjusting knob

To waste59

Chemical interference �.�� phosphate ions

$8����������1�"��ก(�� �(%���ก���

Calcium phosphates ----------------> Ca2+

��� metal ������ก�� phosphate ions

!��ก����!$�� diluent

��� metal ������ก�� phosphate ions

!��ก����!$�� diluent

�.�� lanthanum ions

60

Ionization interference

A0

--------------------------------> A+

+ e-Higher temperature

o + -M

o --------------------------------> M

++ e

-(excess)

�������� ionized ���ก���-�!$�"� ก%� �%�����!� � free electron!$�1�"� ionized atom ก��� �$3� vapor atom

Ao

<------------------------------- A+

+ e-(excess)

M --------------------------------> M + e (excess)

!� � free electron!$�1�"� ionized atom ก��� �$3� vapor atom

"��� ������������"����"2 ('�1 �.��air-acetylene combustion

61

Matrix interference

�ก(�ก�� �'ก'����"��� sample solution

ก�� standard solution �1�"�ก��ก(��'� �(����ก(�ก�� �'ก'����"��� sample solution

ก�� standard solution �1�"�ก��ก(��'� �(����ก(�����������'��ก��

�.�� protein matrix ���'��ก�� ���1�"���'�ก�!"��-� nebulizer !�'��ก���.�� protein matrix ���'��ก�� ���1�"���'�ก�!"��-� nebulizer !�'��ก��

62

Burner problems� '1�"���-�� burner ! ��" �� � ����ก$�ก �1�"���ก9�� flame ! ������� ����ก$�ก �1�"���ก9�� flame ! ������

�$3�$8:"���%�!����� ก��ก�'�����63

Emission interference

Ao

+ heat ---------------------> A*

hv

80% 20%

Hollow-cathode

Monochromator

Photomultiplier tube

Readout device

Line spectrum light

cathode lamp

Chopper

Burner

Sample solution

64

Flame photometry or Flame emission photometry

���� �-� ������$�����ก��'� �(����.�� �.��� Na / K / Ca

Burner

Wavelength selector( filters)

Photomultiplier

tube

Readout device

Emission light

Burnertube

Sample

solution65

Error in flame photometry

Altered flame temperature => alteration of emission light

Inadequate selectivity of wavelengthInadequate selectivity of wavelength

Differences in viscosities of the standards and samples

=> difference in aspiration rate --> alteration of emission light

Molecular emission bands

Cyanide �"� emit spectral bands ���;01;���ก�� spectral lines Cyanide �"� emit spectral bands ���;01;���ก�� spectral lines -��metal ions '��<

66

Fluorometry

���� �-� -���������$����ก��"����กก��'��������������

TransmittedLight

Scattered

Absorbed

TransmittedLight

No loss of energy

No change of energy

same wavelength beforeand after it interacts withthe matterthe matterEnergy loss

Some energy loss and Reemitted light

Fluorescence and Phosphorescence

67

First monochromator Excitation slit

Sample in cuvette

Basic components of fluorometer

Second monochromator

Light source

Emission slit

Detector

Readout device

• Solvent• Solvent

• pH of solution

• Temperature

• Absorbance of solution

• Interfering or specifically quenching compounds

Fluorescence signal

-#0�ก��$8����'��<! �����ก(� 0.1 A

68

Interaction of light with particles

Reflected

TransmittedLight

ScatteredAbsorbed

Detection of scattered light

Turbidity Detects the reduction in the light transmission caused by particle formation,

Nephelometry Detects a portion of light that is scattered at a variety of angles.

transmission caused by particle formation, and its quantifies the residual light transmitted.

69

Interaction of light with particles

Small particles: d < 0.1 λλλλ( Rayleigh theory )

Light scattered symmetrically, but minimally at 90o

Very large particles: d >0.1 λλλλLight mostly scattered forward

( Rayleigh-Debye theory )

( Mie theory )

but minimally at 90o

Large particles: d < λλλλ

90 45

Light scattered preferentially forward

( Rayleigh-Debye theory )

70

= 15-90

Light source

Collimating

Slit Sample Cuvette

θ

Basic components of nephelometer

Particle diameters of Antigen-antibodies complex :

250 - 1,500 nm

= 15-90Collimating

len

Filter

Stray light traps

DetectorSignal

θ

250 - 1,500 nm

�� �����������.��� => 320 - 650 nm

71

Absorption photometryAbsorption photometryAbsorption photometryAbsorption photometry---- solutionsolutionsolutionsolution---- vaporized atomvaporized atomvaporized atomvaporized atom

Beer’s LawBeer’s LawBeer’s LawBeer’s Law�1����ก�� εεεε "���

ก��1���"$�( �������(�ก��(����"/

---- vaporized atomvaporized atomvaporized atomvaporized atom---- vaporized moleculesvaporized moleculesvaporized moleculesvaporized molecules

Reflectance photometryReflectance photometryReflectance photometryReflectance photometry

Turbidity photometryTurbidity photometryTurbidity photometryTurbidity photometryNephelometryNephelometryNephelometryNephelometry

�1����ก�� εεεε "��������ก�� standardsstandardsstandardsstandards

Beer’s LawBeer’s LawBeer’s LawBeer’s Law�����ก�� standardsstandardsstandardsstandards

Emission photometryEmission photometryEmission photometryEmission photometryFluorescent photometryFluorescent photometryFluorescent photometryFluorescent photometryChemiluminescent photometryChemiluminescent photometryChemiluminescent photometryChemiluminescent photometry

�1��� ���� �-� ��������ก�� StandardsStandardsStandardsStandards

72