Upload
day-kem-quy-nhon-official
View
218
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 1/93
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
NGUYỄN THỊ HỒNG THÚY
NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID BENZOIC,SORBIC, MUỐI CỦA CHÚNG VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU ĐƢỜNG HÓA
HỌC TRONG ĐỐI TƢỢNG THỰC PHẨM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – Năm 2014
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 2/93
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
NGUYỄN THỊ HỒNG THÚY
NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID
BENZOICSORBIC, MUỐI CỦA CHÚNG VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊUĐƢỜNG HÓA HỌC TRONG ĐỐI TƢỢNG THỰC PHẨM
Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Mã số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. TẠ THỊ THẢO
Hà Nội – Năm 2014
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 3/93
i
LƠ I CA M ƠN
Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này tôi đã nhận đƣợc sự
giúp đỡ tận tình của các thầy cô, các anh chị, bạn bè, đồng nghiệp, những ngƣời thân
trong gia đình và các cơ quan có liên quan.
Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới:
PGS.TS. Tạ Thị Thảo
cô đã luôn quan tâm, giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn
thành đề tài này.
Tôi vô cùng biết ơn Tập thể các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên Bộ môn
Hóa Phân tích- trươ ng Đa i ho c Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội đãtạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Labo Xét nghiệm An toa n vê sinh
Thư c phâ m, Khoa Y tế Công cộng / Y học Dự phòng, Khoa Xét nghiệm - Trường
Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương, cho tôi cơ hội đƣợc đi học chuyên sâu về xe t
nghiê m Hoa - Độc, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác để tôi hoàn thành
đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những ngƣời đã hết lòng
ủng hộ, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài.
Nguyễn Thị Hồng Thúy
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 4/93
ii
LƠ I CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan , luâ n văn na y la kêt qua nghiên cư u va la m viê c cu a tôi , các kt
quả , sô liê u cu a luâ n văn la trung thư c , thư c tê ta i nơi nghiên cư u.
Hải Dương , tháng 12 năm 2014
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Hồng Thúy Học viên cao học khoá học 2012-2014
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 5/93
iii
MỤC LỤC
LƠ I CA M ƠN............................................................................................................................. i
LƠ I CAM ĐOAN...................................................................................................................... ii
DANH MU C CA C KÝ HIỆU, CC CHỮ VIẾT TẮT........................................................ v
DANH MỤC CA C BA NG...................................................................................................... vi
DANH MU C CA C SƠ ĐÔ , HNH V................................................................................. vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .................................................................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về chất bảo quản và chất tạo ngọt ........................................ 3
1.1.1. Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam ............. 3
1.1.2. Tác dụng và tác hại của việc sử dụng acid sorbic, acid benzoic và
saccharin, aspartam. ............................................................................................ 4
1.2. Một số phƣơng pháp xác định acid benzoic, acid sorbic, saccharin, và
aspartam ................................................................................................................... 7
1.2.1. Phƣơng pháp trắc quang ........................................................................... 7
1.2.2 Phƣơng pháp chuẩn độ .............................................................................. 9
1.2.3. Phƣơng pháp điện di mao quản (CE) ....................................................... 9
1.2.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................ 11
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHP NGHIÊN CỨU ............................... 14
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................... 14
2.1.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................... 14
2.1.2. Đối tƣợng, thời gian và địa điểm lấy mẫu phân tích .............................. 14
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu ................................... 14
2.2.1. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................. 14
2.2.2. Hóa chất, thuốc thử ................................................................................ 15
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 16
2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ ........................................... 16
2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích ......................... 17
2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu : .................................................................... 22
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 6/93
iv
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 23
3.1. Nghiên cứu, xây dựng phƣơng pháp phân tích .............................................. 23
3.1.1. Khảo sát các điều kiện phân tích ............................................................ 23
3.1.2. Tối ƣu quá trình xử lý mẫu ..................................................................... 33
3.2. Xác định giá trị sử dụng của phƣơng pháp .................................................... 38
3.2.1. Kêt qua nghiên cƣ u tính phù hợp của hệ thống ...................................... 38
3.2.2. Tính đặc hiệu, chọn lọc .......................................................................... 38
3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của thiết bị đo ..................... 40
3.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp ................ 58
3.2.5. Khoảng tuyến tính .................................................................................. 413.2.6. Độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích .................................................... 43
3.2.8. Đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp bằng phân tích đối chứng ...... 58
CHƢƠNG IV: KÊ T LUÂ N VA KIÊ N NGHI .................................................................... 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 63
PHỤ LỤC................................................................................................................................. 66
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 7/93
v
DANH MU C CA C KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN Acetonitril
AOAC
Assosiation of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà hóa phân tích
chính thức) ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm
Asp Aspartam
BA Acid benzoic
BYT Bộ y tế
DAD Diode Array Detector (Detector mảng diod)
GC Gas chromatography (Sắc ký khí)
HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
R (%) Độ thu hồi (đơn vi %)
Sac Saccharin
SA Acid sorbic
KPH Không pha t hiê n (nhỏ hơn ngƣỡng phát hiện của phƣơng pháp )
MeOH Methanol
LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)
LOQ Limit of Quantification (Giới hạn định lƣợng)
S/N Signal to noise ratio (Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu)
SOP Standard Operation Procedure (Quy trình thao tác chuẩn) ppm Nông đô ppm (mg/kg)
QC Quality control (Kiểm soát chất lƣợng).
RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tƣơng đối)
UV-VIS Ultraviolet – Visible (Tử ngoại khả kiến)
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam.
INS International numbering system (hệ thống đánh số quốc tế).
ADI Acceptable daily intake (lƣợng ăn vào hằng ngày có thể chấp nhận đƣợc)
MLMaximum Level (lƣợng phụ gia tối đa của một chất phụ gia thực phẩm),
tính bằng mg/kg thực phẩm dạng rắn và mg/l đối với thực phẩm dạng lỏng
CTCT Công thức cấu tạo
CTPT Công thức phân tử
KLPT Khối lƣợng phân tử
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 8/93
vi
DANH MỤC CA C BA NG
Bảng 1.1. Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam .......................... 3
Bảng 1.2. Ảnh hƣởng của một số chất bảo quản trên vi sinh vật ........................................... 4
Bảng 3.1 : Ảnh hƣởng bản chất cột đến thời gian lƣu và diện tích pic ....Error! Bookmark
not defined.
Bảng3.2: Tính chất của1 số loa i dung môi du ng la m pha đô ng......................................... 26
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng thành phần pha động đến thời gian lƣu và diện tích pic................... 26
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của pH pha động đến thời gian lƣu của chất phân tích .................... 28
Bảng 3.5. Tỷ lệ dung môi của chế độ gradient 2 ................................................................... 30
Bảng 3.6. Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 3 .......................................... 31
Bảng 3.7. Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 4 .......................................... 31
Bảng 3.8. Diện tích pic theo các chƣơng trình gradient ........................................................ 32
Bảng 3.9. Chƣơ ng trình gradient pha động và tốc độ dòng tối ƣu ........................................ 33
Bảng 3.10. Sự phụ thuộc diện tích pic vào thời gian siêu âm ............................................... 35
Bảng 3.11. Sự phụ thuộc diện tích pic vào thể tích MeOH thêm vào mẫu .......................... 36
Bảng3.12: Kêt qua t nh toa n sự phù hợp của hệ thống ......................................................... 38
Bảng 3.13. Hệ số tách và độ phân giải của pic các chất phân tích ........................................ 40
Bảng 3.14 : Giới hạn phát hiện của thiết bị đối với các chất đang nghiên cứu .................... 40
Bảng 3.15. LOD và LOQ của từng nền mẫu ......................................................................... 58
Bảng 3.16: Phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ ............................................................. 42
Bảng 3.17: Phƣơng trình hồi quy và hệ số tƣơng quan của đƣờng chuẩn ........................... 44
Bảng 3.18: Kết quả phân tích lặp lại hàm lƣợng saccharin trong mẫu thực (n=6) .............. 44
Bảng 3.19: Kết quả phân tích lặp lại hàm lƣợng aspartam trong mẫu thực (n=6)............... 46
Bảng 3.20: Kết quả phân tích lặp lại hàm lƣợng acid benzoic trong mẫu thực (n=6) ......... 47
Bảng 3.21: Kết quả phân tích lặp lại hàm lƣợng acid sorbic trong mẫu thực (n=6) ............ 49
Bảng 3.22: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu xúc xích .................... 51
Bảng 3.23: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu bánh đậu xanh .......... 52
Bảng 3.24: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu thạch bách vị ............ 53
Bảng 3.25: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu dƣa chuột muối ........ 54
Bảng 3.26: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu ô mai .................... 55
Bảng 3.27: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu kẹo ........................ 56
Bảng 3.28: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu nƣớc ngọt ............ 57
Bảng 3.29. Kết quả mẫu kiểm nghiệm đối chứng ................................................................. 60
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 9/93
vii
DANH MU C CA C SƠ ĐÔ , HNH VE
S ơ đồ 2.1. Quy trình phân tích theo TCVN 8471:2010 ......................................................... 17
S ơ đồ 2.2: Qui trình phân tích mẫu dự kin ........................................................................... 34
Hình 3.1: Phổ của Saccharin và Aspartam ............................................................................ 23
Hình 3.2: Phổ của acid Benzoic .............................................................................................. 24
Hình 3.3: Phổ của acid Sorbic ................................................................................................ 24
Hình 3.4. Sắc đồ phân tích hỗn hợp chất bằng cột C8 (150mm× 4,6mm × 5μm) ...... Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.5. Sắc đồ phân tích hỗn hợp chất bằng cột C18 (150mm×4,6mm× 5μm) ...... Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.6. Sắc đồ phân tích hỗn hợp chấtc bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm) ............ 25
Hình 3.7: Sắc đồ hỗn hợp chất phân tích, thành phần pha động K 2 HPO4 : ACN = 80 : 20
(v/v) tại bước sóng 210nm, 226nm và 254nm. ....................................................................... 27
Hình 3.8. Sắc đồ các chất phân tích theo ch độ gradient 1 ................................................. 29
Hình 3.9. Sắc đồ các chất phân tích theo ch độ gradient 2 ................................................. 30
Hình 3.10. Sắc đồ các chất phân tích theo ch độ gradient 3 ............................................... 31
Hình 3.11. Sắc đồ các chất phân tích theo ch độ gradient 4 ............................................... 32
Hình 3.12: Sắc đồ của mẫu trắng (A) và mẫu trắng có thêm chuẩn (B) ............................. 39
Hình 3.13: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với saccharin .......................................................... 40
Hình 3.14: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với aspartam .......................................................... 41
Hình 3.15: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với acid benzoic..................................................... 41
Hình 3.16: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với acid sorbic ....................................................... 41
Hình 3.17: Đường chuẩn của saccharin trong khoảng nông độ0,02 ÷ 80 ppm ................. 42
Hình 3.18: Đường chuẩn của aspartam trong khoảng nông độ0,5 ÷ 90 ppm ................... 42
Hình3.19: Đường chuẩn của A. benzoic trong khoảng nông độ0,08÷90 ppm ................... 43
Hình 3.20: Đường chuẩn của A. sorbic trong khoảng nông độ0,01 ÷ 85 ppm ................... 43
Hình 3.21. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp chuẩn 1 ppm của các chất phân tích. ............................ 43
Hình 3.22. Sắc đồ của mẫu nước ngọt ................................................................................... 50
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 10/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 1 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chất lƣợng thực phẩm nói chung, chất lƣợng an toàn vệ sinh thực phẩm nói
riêng là vấn đề có tầm quan trọng đặc biệt, ảnh hƣởng trực tiếp đến sức khỏe con
ngƣời và nền kinh tế của xã hội.
Gần đây, liên tiế p xảy ra các vụ ngộ độc tại nhiều địa phƣơng trên toàn quốc,
cũng nhƣ việc xuất hiện nhiều mặt hàng không rõ nguồn gốc xuất xứ hoặc sử dụng
những phụ gia ngoài danh mục cho phép hay sử dụng quá hàm lƣợng cho phép. Tác
hại do sử dụng phụ gia sai quy định có thể ảnh hƣởng đối vớ i sức khỏe con ngƣờ i.
Những tác động này thƣờng không xảy ra cấp tính, rầm r ộ và nguy kịch mà diễn
biến lâu dài do tích lũy trong cơ thể. Theo Tổ chức Y tế Thế giớ i, ở Việt Nam hàngnăm có khoảng hơn 3 triệu trƣờ ng hợ p nhiễm độc, gây thiệt hại hơn 200 triệu USD
(khoảng 4000 tỷ VND).
Acid sorbic, acid benzoic và một số muối của chúng là những phụ gia đƣợc phép
sử dụng với nồng độ đủ để bảo quản sản phẩm thì chúng không gây độc cho cơ thể
con ngƣời. Tuy nhiên, một số nhà sản xuất đã dùng quá hàm lƣợng cho phép ảnh
hƣởng tới sức khoẻ, gây ngộ độc cấp và mãn tính. Tổ chức Y tế thế giới, tổ chức
Nông Lƣơng thế giới đã thử nghiệm natri benzoat trên chuột sau nhiều ngày trọng
lƣợng chuột giảm, hại gan và thận dẫn tới chết, thử nghiệm trên chó thì dẫn tới thần
kinh, kết hợp với acid ascobic trong thực phẩm natri benzoat có thể gây ung thƣ do
tạo ra benzen.
Năm 2012, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Hƣơng trên địa bàn tỉnh
Quảng Bình cho thấy: Tổng số mẫu xét nghiệm acid benzoic là 291 có 69 mẫu thực
phẩm sử dụng chất bảo quản acid benzoic chiếm là 23,7%, trong các thực phẩm sử
dụng chất bảo quản acid benzoic tỷ lệ mẫu thực phẩm sử dụng vƣợt quá giới hạn
cho phép là 46,4%. Tổng số mẫu xét nghiệm acid sorbic là 286 có 50 mẫu thực
phẩm sử dụng chất bảo quản acid sorbic chiếm là 17,5%, trong các thực phẩm sử
dụng chất bảo quản acid sorbic tỷ lệ mẫu thực phẩm sử dụng vƣợt quá giới hạn cho
phép là 50% [3].
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 11/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 2 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Đƣờng hóa học (hay là chất ngọt tổng hợp) là chất không có trong tự nhiên,
có vị ngọt rất cao so với đƣờng kính saccharose và không hề có một giá trị dinh
dƣỡ ng. Thƣờng dùng trong việc điều trị cho những ngƣời bệnh thừa cân hay đái
tháo đƣờng. Các đƣờng hóa học nhƣ: saccharin, manitol, acesulfam K, aspartam,
isomalt, sorbitol, sucraloza đƣợc phép sử dụng trong chế biến thực phẩm với giới
hạn tối đa và có quy định của Bộ Y tế [12]. Tuy vậy, các chất này có thể gây ảnh
hƣởng tới sức khỏe ngƣời dùng ở các mức độ khác nhau tuỳ thuộc vào liều lƣợng
đƣa vào cơ thể. Điều nguy hiểm là loại đƣờng này hòa tan trong nƣớc, không
màu, không mùi nên khó phát hiện. Chỉ có thể chỉ tên "đích danh" qua phân
tích hoá học. Nếu nhà sản xuất chỉ cần cho 7 phần đƣờng mía và 3 phần đƣờng hóahọc thì ngay cả các chuyên gia cũng không thể phát hiện ra.
Cho đến nay có rất nhiều phƣơng pháp khác nhau để xác định chất bảo quản
và chất tạo ngọt. Tuy nhiên, để định lƣợng đƣợc đồng thờ i chất quản: acid benzoic,
acid sorbic và chất tạo ngọt trong thực phẩm, phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC) có nhiều ƣu điểm vƣợ t tr ội. Phƣơng pháp này có độ nhạy, độ chính xác
cao, thao tác đơn giản, có thể đồng thời xác định dƣợ c nhiều chất. Xuất phát từ vấn
đề trên, đề tài: “ Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoic, acid sorbic, muố i
của chúng và một số chỉ tiêu đường hóa học trong đối tượ ng thự c phẩ m” nhằm giải
quyết 2 mục tiêu:
1. Xây dƣ ng đƣơ c quy tr nh phân t ch acid benzoic, acid sorbic và chất tạo ngọt
saccharin, aspartam trong thực phẩm tại Labo Xét nghiệm ATVSTP.
2. Thâ m đi nh đƣơ c phƣơng pha p xa c đi nh acid benzoic, acid sorbic và chất tạo
ngọt saccharin, aspartam trong thực phẩm đa
xây dƣ ng tại Labo XN ATVSTP.
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 12/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 3 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về chất bảo quản và chất tạo ngọt
1.1.1. Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam
Tên hóa học, các tính chất, công thức cấu tạo của acid benzoic, acid sorbic,
saccharin và aspartam đƣợc cho trong bảng 1.1. [7], [8], [11]
Bảng 1.1. Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam
Acid benzoic Acid sorbic saccharine Aspartam
Tên
hóa
học
Acid benzoic,
acid benzen
carboxylic,
acid phenol
arboxylic
Acid sorbic,
acid 2.4 –
hexadienoic
1,2-Benzisothiazol-
3(2H)-on-1,1-
dioxid;
3-oxo-2,3-
dihydrobenzo[d]iso
thiazol-1,1-dioxid
Aspartyl
phenylamin
metyl ester,
3-Amino-N-(α
carbomethoxy-
phenyletyl)-acid
succinamic
CTPT C7H6O2
(C6H5COOH)
C6H8O2 C7H5 NO3S C14H18 N2O5
KLPT 122,12 g/mol 112,12 g/mol 183,18 g/mol 294,31 g/mol
pKa 4,21 4,76 3,86 4,5-6,0
CTCT
Tính
chất
vật lý
- Tinh thể rắn
màu trắng, có
dạng vảy hoặc
hình kim
- có mùi đặc
trƣng rất nhẹ
- tan ít trong
nƣớc, tan vô
hạn trong
etanol.
- Tinh thể hình
kim không màu
hoặc bột trơn
chảy màu trắng,
- có mùi nhẹ đặc
trƣng
- ít tan trong
nƣớc, tan nhiều
trong ethanol,
methanol.
- Tinh thể hoặc bột
tinh thể trắng,
- k hông mùi hoặc
có mùi thơm nhẹ.
- Ít tan trong nƣớc,
ethanol, tan trong
dung dịch kiềm.
- Giữ đƣợc độ ngọt
ở nhiệt độ cao.
- Tinh thể màu
trắng, không mùi
có vị ngọt mạnh.
- Ít tan trong
nƣớc và ethanol
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 13/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 4 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
1.1.2. Tác dụng và tác hại của việc sử dụng acid sorbic, acid benzoic và
sacchar in , aspartam.
Tác dụng của một số chấ t bảo quản trên vi sinh vật đượ c thể hiện ở bảng 1.2. [1]
Bảng 1.2. Ảnh hưở ng của một số chấ t bảo quản trên vi sinh vật
Chất chống vi sinh vật Vi khuẩn Nấm men Nấm mốc
Nitrit + + - -
Sulfit + + + + +
Acid formic + + + + +
Acid propionic + + + + +
Acid benzoic + + + + + + + +
Acid sorbic + + + + + + +
Acid este-p hydrobenzoic + + + + + + + +
Biphenyl - + + + +
Chú thích: - Không tác dụng + Tác dụng yếu
+ + Tác dụng trung bình + + + Tác dụng mạnh
1.1.2.1. Tác dụng, tác hại và giớ i hạn cho phép của việc sử d ụng acid benzoic
Acid benzoic và các benzoat là chất sát trùng mạnh đối với nấm men và các
nấm mốc, có tác dụng yếu đối với các vi khuẩn. Tác dụng bảo quản chỉ xảy ra ở môi
trƣờng acid pH = 2,5 – 3,5. Đảm bảo hiệu quả tác dụng bảo quản, nồng độ natri
benzoat có trong sản phẩm phải đạt tới 0,07 – 0,1%. Các nồng độ này của acid
benzoic và natri benzoat không có hại đối với cơ thể con ngƣời. [11]
Acid benzoic và các benzoat không gây độc khi dùng đúng liều quy định mà
chỉ ảnh hƣởng tới mùi và vị của sản phẩm khi cảm quan (natri benzoat cho dƣ vị ở
nồng độ 0,04%). Nƣớc quả và rau quả nghiền bảo quản bằng các benzoat thƣờng có
màu thâm đen so với sản phẩm sunfit hoá. Trong cơ thể acid benzoic và các benzoat
tác dụng với acid ascorbic hình thành benzen, một chất gây ung thƣ. Natri benzoat
có thể phá huỷ và khử hoạt tính của ADN trong ti thể tế bào. Ti thể tiêu thụ ôxi để
tổng hợp ATP, cung cấp năng lƣợng cho cơ thể, khi ADN bị phá huỷ sẽ gây ra các
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 14/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 5 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
triệu chứng về thần kinh bao gồm hội chứng Parkinson và các hội chứng thoái hoá
thần kinh khác, làm tăng quá trình lão hóa của cơ thể. [3]
Giới hạn cho phép (ML) của acid benzoic trong thịt và các sản phẩm từ thịt,
trong nƣớc chấm và các sản phẩm tƣơng tự 1000mg/kg; trong các loại thủy sản, sản
phẩm thủy sản ngâm dấm, kể cả nhuyễn thể, giáp xác, da gai 2000mg/kg. [12]
1.1.2.2. Tác dụng, tác hại và giới hạn cho phép của việc sử dụng acid sorbic
Acid sorbic và các sorbate có tác dụng sát trùng mạnh đối với nấm men và
nấm mốc, các vi sinh vật này là nguyên nhân chủ yếu gây hƣ hỏng sản phẩm rau quả,
tác dụng rất yếu đối với vi khuẩn. Sử dụng Acid sorbic đem lại kết quả tốt trong công
nghiệp chế biến rau quả, trong công nghiệp rƣợu nho, trong sản xuất đồ hộp sữa vàcác sản phẩm sữa, các sản phẩm cá, các sản phẩm thịt loại thịt dồi, xúc xích, các sản
phẩm bánh mỳ... [11]
Khi sử dụng acid sorbic với hàm lƣợng vƣợt mức cho phép sẽ ảnh hƣởng
không tốt đến sức khoẻ ngƣời sử dụng. Các chất này có thể gây dị ứng, gây hiện
tƣợng đầy bụng, đầy hơi, khó tiêu. Nếu tích tụ lâu ngày sẽ gây hại cho gan, thận,
thậm chí có thể gây ung thƣ. [3]
Giới hạn cho phép (ML) của acid sorbic trong các loại pho mát cao nhất là
3000mg/kg; trong các loại bánh nƣớng là 2000mg/kg; trong nƣớc chấm và các sản
phẩm tƣơng tự : 2000mg/kg; viên xúp và nƣớc thịt: 1000mg/kg. [12]
1.1.2.3. Tác dụng, tác hại và giới hạn cho phép của việc sử dụng saccharin
Là chất làm ngọt nhân tạo không có năng lƣợng, độ ngọt gấp khoảng 300 lần
đƣờng mía, nhƣng có dƣ vị kim loại hơi đắng, đặc biệt là ở nồng độ cao. Khi đi vào
cơ thể, saccharin không bị hấp thụ vào các bộ phận trong cơ thể mà đƣợc thải hồi
sau đó qua đƣờng tiểu tiện. Dùng để làm ngọt các sản phẩm nhƣ đồ uống, kem, chè,
bánh kẹo, bánh quy, các loại thuốc và kem đánh răng [7], [11].
Năm 1977, Canada và FDA Hoa Kỳ cấm sử dụng hóa chất này vì phát hiện
gây ung thƣ bàng quang ở chuột. Nhƣng trƣớc áp lực của dân chúng và nhà sản
xuất, Quốc hội Hoa K ỳ cho phép dùng với điều kiện phải có hàng chữ “có nguy cơ
độc hại cho sức khỏe” (potentially hazardous to health). Năm 2000, FDA Hoa Kỳ
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 15/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 6 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
lấy hàng chữ này ra vì có những nghiên cứu chứng minh sự an toàn của saccharin.
Tuy nhiên, hiện nay một số nghiên cứu hiện đại lại chỉ ra r ằng, saccharin có thể tạo
ra dị ứng cho cơ thể nhƣ nhức đầu, tiêu chảy, da bị tróc v.v… Đối với các phụ nữ
đang mang thai, saccharin có thể đi thẳng vào bào thai và nằm yên trong đó trong
suốt thờ i k ỳ mang thai, do đó thai nhi có thể bị ảnh hƣởng và tạo nên những chứng
r ối loạn chức năng của cơ bắp. Dùng nhiều lƣợng saccharin có thể sinh ra chứng
béo phì. Tuy nhiên tất cả những biến chứng do việc xử dụng saccharin vẫn còn là
một tranh cãi và chƣa có kết luận nào có tình cách thuyết phục. [30]
Một khả năng gây nguy hiểm khác của saccharin là khả năng gây dị ứng.
Phản ứng dị ứng này là do nhóm hợp chất sufonamides gây ra đối với những ngƣờikhông đáp ứng đƣợc thuốc chứa sulfa. Phản ứng này bao gồm đau đầu, khó thở,
phát ban và tiêu chảy. Một số sản phẩm dành cho trẻ em có chứa saccharin đƣợc
cho là có thể gây kích ứng và rối loạn cơ bắp. [30]
Giới hạn cho phép (ML) của saccharin trong kẹo cao su cao nhất là 2500
mg/kg, trong các loại gia vị là 1500 mg/kg, trong thực phẩm bổ xung là 1200
mg/kg, trong sản phẩm thịt, thịt gia cầm và thịt thú, thủy sản và cá đã qua xử lý
nhiệt, rau củ đông lạnh là 500 mg/kg,...[12]
1.1.2.4. Tác dụng, tác hại và giới hạn cho phép của việc sử dụng aspartam
Hiện nay, aspartam là chất ngọt rất đƣợc ƣa chuộng. Nó đƣợc sử dụng rộng
rãi trên thế giới với sự hiện diện trong hơn 6000 loại thực phẩm khác nhau nhƣ bánh
kẹo, yogurt, trong các thức uống ít nhiệt năng nhƣ Coke diete, Pepsi và cả trong
dƣợc phẩm. [29]
Một gram aspartam tạo ra bốn kcal năng lƣợng khi chuyển hóa nên lƣợng
calo là không đáng kể. Đa số ngƣời tiêu dùng có nhận xét là aspartam không để lại
dƣ vị khó chịu , tuy nhiên mô t số ngƣơ i nhạy cảm cho rằng đƣờng này đê la i trên
lƣơ i mô t hâ u vi không ngon . Điều này có thể khắc phục bằng cách trộn aspartam
với các loại đƣờng khác (nhƣ acesulfame - K hay saccharin). [7]
Khi va o cơ thê , aspartam không hấp thụ vào máu ma tan ra trong ruột thành
ba chất: acid aspartic (40%), phenylalanin (50%) và methanol (10%).
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 16/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 7 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
+ Methanol là một chất có độc tính thấp. Vào cơ thể, methanol đƣợc oxy hóa
tạo nên formaldehyd, chất này lại tiếp tục bị oxy hóa tạo nên acid formic (hoặc
formate, tùy theo pH). Acid formic có độc tính rất cao. Chính acid formic là nguyên
nhân gây nên tình trạng toan chuyển hóa (nhiễm acid) và mù lòa, những tổn thƣơng
đặc trƣng của nhiễm độc methanol.
+ Phenylalanine là một chất độc thần kinh. Quá nhiều phenylalanine gây động
kinh, chậm phát triển trí óc , mất ngủ… Ch nh phenylalanine ta o ra bệnh
phenylketonuria (PKU), làm chậm phát triê n tr tuê nghiêm tro ng và làm tổn hại đến
hê thần kinh.
+ Dƣ thừa acid aspartic có thể gây ra rối loạn nội tiết và các vấn đề về thị lực.acid Aspartic là một chất kích thích thần kinh, ảnh hƣởng đến hệ thống thần kinh
trung ƣơng, gây nên các chứng: nhức đầu, buồn nôn, đau bụng, mệt mỏi, rối loạn
giấc ngủ, vấn đề về thị lực, trầm cảm, và bệnh suyễn, động kinh… [11]
Giới hạn cho phép (ML) của aspartam trong sản phẩm tạo màu trắng cho đồ
uống là 6000 mg/kg, trong thực phẩm bổ sung là 5500 mg/kg, trong bánh mỳ và các
sản phẩm bánh nƣớng thông thƣờng và hỗn hợp là 4000 mg/kg, trong kẹo, kẹo
mềm, kẹo cứng, kẹo ca su, dấm là 3000 mg/kg, viên xúp và nƣớc thịt là 1200
mg/kg,....[12]
1.2. Một số phƣơng pháp xác định acid benzoic, acid sorbic, saccharin, và
aspartam
Hiện nay trên thế giới có nhiều phƣơng pháp phân tích đã đƣợc triển khai và
chuẩn hóa và chuẩn hóa tại phòng thí nghiệm, bao gồm các phƣơng pháp xác định
riêng chất bảo quản cũng nhƣ đƣờng hóa học và các phƣơng pháp xác định đồng
thời cả chất bảo quản và đƣờng hóa học: phƣơng pháp chuẩn độ, quang phổ hấp thụ
phân tử, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC và điện di mao quản.
1.2.1. Phương pháp trắc quang
* Xác định hàm lƣợng acid benzoic trong các mẫu thực phẩm :
Mẫu thử đƣợc đồng hóa, sau đó đƣợc pha loãng và acid hóa phần mẫu
thử . Acid benzoic đƣợc chiết bằng dietyl ete , rồi đƣợc chiết tiếp bằng kiềm
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 17/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 8 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
tinh chế bằng oxi hóa sử dụng kali dicromat trong môi tr ƣờng acid. Acid benzoic
tinh sạch hòa tan trong dietyl ete đƣợc xác định bằng cách đo quang ở bƣớc sóng
267,5 nm; 272 nm và 276,5 nm.
Độ hấp thụ tính theo acid benzoic trong công thức này đối với phƣơng pháp
so sánh ở bƣớc sóng 272 nm là: A2 – (A1 + A3)/2
A1 là độ hấp thụ ở 267,5 nm
A2 là độ hấp thụ ở 272 nm
A3 là độ hấp thụ ở 276,5 nm
Chuẩn bị dãy chuẩn acid benzoic với các nồng độ khác nhau, tiến hành đo
độ hấp thụ, dựng đƣờng chuẩn. Dựa vào đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng acid
benzoic trong mẫu phân tích.[14]
* Xác định hàm lƣợng acid sorbic trong các mẫu thực phẩm:
Cất acid sorbic từ mẫu bằng hơi nƣớc, oxy hóa bằng acid crom, dùng acid
bar bituric tạo phức màu hồng, đo cƣờng độ màu của phức bằng máy đo quang phổ
ở bƣớc sóng 532 nm.
Để tính kết quả hàm lƣợng acid sorbic cần chuẩn bị dãy chuẩn acid sorbic
với các nồng độ khác nhau, tiến hành đo độ hấp thụ, dựng đƣờng chuẩn. Dựa vào
đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng acid sorbic trong mẫu phân tích.[15]
Phƣơng pháp này tuy có độ chính xác cao nhƣng phức tạp và tốn nhiều dung
môi hóa chất. Đặc biệt là không phân tích đƣợc đồng thời 2 acid.
* Xác định đƣờng hóa học:
- Nếu mẫu là chất rắn: hòa tan lƣợng mẫu thích hợp và định mức 25 ml với
nƣớc khử ion. Nếu là mẫu lỏng, pha loãng thể tích mẫu thích hợp thành 25 ml. Lấy500 µl dung dịch trên pha loãng thành 10 ml với dung dịch đệm Clark and Lubs
(dung dịch gồm KCl 0,2 M và HCl 0,2 M) pH = 1,3. Để xác định Saccharin
acesulfam-K trong các chất làm ngọt và bột nƣớc trái cây, sử dụng bƣớc sóng phát
hiện saccharin là 206 nm, acesulfam - K là 226 nm. Độ thu hồi đối với cả hai chất
phân tích trên nền mẫu thực trong khoảng 93,5 105,1%, sai số tƣơng đối < 5%. [26]
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 18/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 9 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
- Để xác định đồng thời 3 chất ngọt nhân tạo (Saccharin, Aspartam,
Acesulfame-K) và vitamin C trong đồ uống bằng phƣơng pháp PLS - UV: cân chính
xác 0,05 g mẫu, hòa tan và chuyển vào bình định mức 100 ml bằng dung dịch
H3PO4 0,1N. Chất phân tích đƣợc đo ở bƣớc sóng từ 190 – 300 nm. Nếu mẫu có
chứa màu thực phẩm, các chất phân tích đƣợc chiết bằng dung dịch n - butanol và
đƣợc đo ở bƣớc sóng từ 190 – 300 nm. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng cho đồ uống
thƣơng mại, đồ uống có màu (dạng bột và chất lỏng). [28]
Phƣơng pháp này tƣơng đối chính xác nhƣng tốn dung môi, hóa chất độc hại,
không xác định đƣợc đồng thời các chất cần phân tích.
1.2.2 Phương pháp chuẩn độ * Xác định acid benzoic và acid sorbic: Cân 50g mẫu chính xác đến 0,001g
chuyển toàn bộ vào bình định mức 250ml, dùng NaOH 10% trung hòa đến trung tính thử
bằng giấy đo pH. Thêm 10ml kali feroxyanua 15% lắc đều, để lắng sau đó lọc.
Hút 50ml dịch lọc chuyển vào phễu chiết chia độ, trung hòa bằng HCl 10%,
thử bằng giấy đo pH sau đó thêm 5ml HCl 10%. Thêm 30ml clorofooc vào phễu
chiết lắc trong 5 phút để phân lớp, chiết phần dung dịch nƣớc sang phễu chiết khác,
cho thêm 15 ml clorofooc và chiết lại hai lần nữa. Gộp toàn bộ cloroform, có thể
cho vào bộ cất thu hồi bớt cloroform ở 650 đến còn lại ¼ thể tích. Chuyển phần cặn
còn lại trong cốc sứ và làm bốc hơi trên bếp ở 500 để nguội, dùng 50ml etanol hòa
tan cặn trong cốc, thêm 2 giọt phenolphthalein rồi chuẩn độ bằng NaOH 0,05 M.
Phƣơng pháp này tốn dung môi hóa chất, độc hại , đặc biệt là phƣơng pháp này phân
tích đối với mẫu có hàm lƣợng lớn. [8], [14], [21]
* Xác định saccharin: Cân khoảng 0,5g (chính xác đến mg) mẫu thử đã đƣợc làm
khô, hòa tan trong 75 ml nƣớc nóng. Làm nguội nhanh và thêm dung dịch
phenolphtalein (TS), chuẩn độ với dung dịch natri hydroxyd 0,1 M. Mỗi ml natri
hydroxyd 0,1N tƣơng đƣơng với 18,32 mg C7H5 NO3S. [7]
Phƣơng pháp này cần hóa chất độc hại, chỉ phân tích đƣợc nếu hàm lƣợng
chất lớn.
1.2 .3. Phương pháp điện di mao quản (CE)
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 19/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 10 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Đây là phƣơng pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất không
ion nhƣng có mối quan hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa
đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trƣờng. Do độ linh động điện di của các ion khác
nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách khỏi nhau.
Ứng dụng phƣơng pháp này, tác giả Ana Beatriz Bergamo, José Alberto
Fracassi da Silva, Dosil Pereira de Jesus đã xác định đồng thời aspartam, cyclamate,
saccharin và acesulfam - K trong đồ uống và các chất làm ngọt bằng điện di mao
quản với detector độ dẫn. Phƣơng pháp sử dụng hỗn hợp đệm tris (hydroxymetyl)
aminometan (TRIS) 100 mmol/L và 1 histidin (HIS) 10 mmol/L với thời gian phân
tích là 6 phút, hiệu suất thu hồi các chất trong khoảng từ 94% đến 108%, độ lệchchuẩn tƣơng đối (RSD) trong khoảng 1,5 6,5%.[22]
Tác giả Richard A. Frazier và các cộng sự đã xác định đồng thời các chất ngọt
nhân tạo acesulfam-K, aspartam, saccharin, chất bảo quản acid benzoic, acid sorbic và 7
phẩm màu quinolin yellow, sunset yellow FCF, carmoisin, ponceau 4R, brilliant lue
FCF, green S và black PN trong mẫu nƣớc giải khát bằng phƣơng pháp điện di mao
quản. Phƣơng pháp sử dụng chế độ sắc ký điện động học mixen, dung dịch đệm
cacbonat 20 mM ở pH 9,5 với dun dịch natri dodecyl sulfat 62 mM trong vòng 15 phút.
Kết quả cho thấy giới hạn định lƣợng đối với tất cả các chất là 0,01 mg/ml. [25]
Tác giả Trần Phúc Nghĩa đã xây dựng phƣơng pháp định lƣợng Acesulfame - K,
Saccharin, Aspartam trong đồ uống, nƣớc giải khát với các điều kiện điện di: bƣớc sóng
phát hiện các chất là 215,5 nm, sử dụng dung dịch đệm borat 20 mM ở pH = 9,5, điện
thế đặt vào hai đầu mao quản là 25kV, nhiệt độ 25oC, với áp suất bơm mẫu 50 mbar
trong thời gian 5s, dòng điện 100µA. Xác định đƣợc giới hạn phát hiện LOD với Asp,
Sac, Ace-K lần lƣợt là 3,79 ppm; 6,46 ppm; 4,43 ppm. Giá trị LOQ tìm đƣợc là 4,8 ppm;
1,5 ppm và 3,0 ppm. Sai số tƣơng đối từ 0,75 – 1,85%, giá trị biến thiên CV < 3%. Độ
lặp lại tƣơng đối tốt với độ lệch chuẩn (SD) từ 0,2 – 1,5%, hiệu suất thu hồi trên mẫu
giả là 96,6 - 101,8%. Đồng thời cũng đánh giá phƣơng pháp trực tiếp trên mẫu thực
với hiệu suất thu hồi là 95,2 – 107,0%.[6]
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 20/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 11 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Phƣơng pháp này có độ nhạy cao, xác định đƣợc đồng thời các chất cần phân tích
nhƣng thiết bị đắt tiền, quy trình phân tích phức tạp.
1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tác giả Ion Trandafir , Violeta Nour, Mira Elena Ionică đa pha t triê n phƣơng
pháp HPLC pha đảo để định l ƣợng đồng thời acesulfame - K, saccharin, aspartam,
caffeine và acid benzoic trong nƣớc giải khát cola không đƣờng. Việc tách sắc ký
đƣợc thực hiện bởi sử dụng pha đô ng la đệm kali dihydrogen orthophosphate (pH =
4,3) và acetonitrile (88:12, v/v). Cô t DS hypersil C18 (250 mm x 4,6mm) và
detector DAD vơ i bƣơ c so ng λ = 227 nm cho acesulfame - K , λ = 265 nm cho
saccharin và λ = 217 nm cho aspartam, caffeine và acid benzoic. Thời gian ca c phântích khoảng 40 phút, các đƣờng chuẩn tuyến tính tốt trên phạm vi nồng độ 0-100
mg/L. Viê c xa c nhâ n gia tri sƣ du ng cu a phƣơng pháp phân tích đã thƣ c hiê n về đô
nhạy, khoảng tuyến tính, độ tái lặp, đô lặp lại, đô thu hồi. [27]
Mô t phƣơng pha p săc ky ion mơ i đƣơ c Qing - Chuan Chen, Jing Wang đề
xuât đê xa c đi nh đồng thơ i các chất làm ngọt nhân tạo (natri saccharin, aspartam,
acesulfame - K ), chất bảo quản (acid benzoic, acid sorbic ), caffeine, theobromine
và theophylline. Mẫu đƣợc rung siêu âm, pha loãng, loại tạp bằng K 4[Fe(CN)6 và
ZnSO4 (mẫu sữa lên men) rồi cho qua cột chiết pha rắn C18. Việc tách đƣợc thực
hiện trên một cột trao đổi anion của máy HPLC, phân t ch đƣơ c tiến ha nh ở 40°C
trong vòng 45 phút va giải hấp theo chê đô isocratic với dung môi la dung dịch
NaH2PO4 5mM (pH 8,20) và acetonitrile theo t lê 4% (v/v), và detector UV. Các
giới hạn phát hiện (signal/noise = 3:1) cho tất cả các chất phân tích ơ mức dƣơ i
µg/ml. Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng cho các chế phẩm thực phẩm và dƣợc
phẩm, và sự thu hồi trung bình cho mẫu thật trong khoảng 85 -104%. [23]
Tác giả N. Dossi và các cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp RP – LC để xác
định các chất phụ gia trong nƣớc giải khát. Các chất ngọt nhân tạo (acesulfam,
aspartam, saccharin), chất bảo quản (acid benzoic, acid sorbic) và phẩm màu
(Ponceau 4R, sunset yellow, tatrazin) đƣợc tách trên cột LiChrosorb RP 18. Pha
động là dung dịch đệm phosphat 0,1 M (pH = 4,0) với tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thời
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 21/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 12 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
gian phân tích trong khoảng 20 phút. Pha động đƣợc chạy theo chế độ gradient nhƣ
sau: trong 5 phút đầu tỷ lệ dung môi là dung dịch đệm : MeOH = 95 % : 5% (v/v),
sau đó MeOH tăng lên là 40% trong vòng 5 phút và đƣợc giữ ở tỷ lệ đó trong 10
phút rồi dung môi đƣợc đƣa về tỷ lệ ban đầu trong 5 phút. Bằng kỹ thuật chuyển đổi
bƣớc sóng, giới hạn phát hiện của các chất phân tích trong khoảng 0,1 - 0,3 mg/l.
Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng để xác định một số mẫu nƣớc ngọt, mẫu đƣợc siêu
âm loại khí và lọc bằng 0,45 – 0,2 µm trƣớc khi bơm mẫu vào cột. [24]
Tại Việt Nam, chúng tôi đã khảo sát và nhận thấy có một số phƣơng pháp xử
lý mẫu nhƣ sau:
Phƣơng pháp 1: Mẫu phân tích đƣợc hòa tan vào trong nƣớc hoặc đƣợc chiết bằng dung dịch đệm amoni acetat/acid acetic, và đƣợc khử tạp bằng hỗn hợp Carrez I
(K 4[Fe(CN)6].3H2O) và Carrez II (ZnSO4.7H2O). Sau đó lọc, thu dịch lọc đem phân
tích trên máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) bằng cột sắc ký pha đảo RP-18, 250 mm x
4,6 mm, cỡ hạt 5µm, tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thể tích bơm 10 µl với đầu dò UV-
VIS, bƣớc sóng phát hiện chất là 235 nm. [17]
Phƣơng pháp 2: Mẫu đƣợc pha loãng hoặc đƣợc chiết bằng siêu âm với
nƣớc. Dung dịch mẫu có nồng độ chất tạo ngọt cao đƣợc tinh sạch trên cột chiết pha
rắn hoặc bằng thuốc thử Carrez, nếu cần. Mẫu đƣợc chuyển vào ống ly tâm và ly
tâm ở tốc độ 1400 vòng/phút, trong 10 phút. Lấy dịch nổi, định mức, lọc qua giấy
lọc, màng lọc whatman 0,45µm rồi bơm vào máy HPLC. Các chất phân tích đƣợc
tách trên cột sắc kí pha đảo của HPLC với pha động là dung dịch đệm phosphat và
acetonitril (80%:20%, v/v) và pha tĩnh là cột C18 chiều dài từ 100 mm đến 300 mm,
đƣờng kính trong từ 3 mm đến 4 mm. Bƣớc sóng để xác định chất tạo ngọt bằng
phép đo phổ là 220 nm với detector UV hoặc DAD. Nền mẫu của phƣơng pháp này
là các sản phẩm lỏng trong (nƣớc chanh, cola, các loại đồ uống), các sản phẩm đục
(nƣớc quả, đồ uống từ sữa có hƣơng vị), mứt, mứt quả, mứt cam, sản phẩm rắn và
nửa rắn... [18]
Phƣơng pháp 3: Mẫu đƣợc đồng nhất toàn bộ rồi tiến hành chiết acid benzoic
và sorbic khỏi nền mẫu bằng NaOH, sau đó loại tạp bằng K 3Fe(CN)6,
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 22/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 13 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
(CH3COO)2Zn, lọc qua giấy lọc, màng lọc whatman 0,45µm và định lƣợng bằng
phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao vơ i detector DAD hoă c UV -VIS. [19]
Phƣơng pháp 4: Mẫu đƣợc đồng nhất và đƣợc acid hóa bằng acid tartaric rồi
tiến hành chƣng cất lôi cuốn theo hơi nƣớc nhằm tách lƣợng acid benzoic và acid
sorbic có trong mẫu thử . Sau đó lọc dịch cất thu đƣợc qua màng lọc whatman 0.45
µm va định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao v ới detector DAD
hoă c UV-VIS. [4], [16], [20]
Phƣơng pháp 5: Mẫu sau khi đồng nhất đƣợc cân vào ống ly tâm 50 ml, thêm
nƣớc, lắc đều rồi thủy phân ở 500C trong 30 phút, để nguội, loại tạp bằng hỗn hợp
carrez, ly tâm 6000 vòng/phút và định mức 100 ml, lọc qua giấy lọc rồi bơm vàoHPLC với cột anion, detector PDA, bƣớc sóng phát hiện chất đối với aspartam,
saccharin là 210 nm, acid benzoic, acesulfam K là 225 nm và acid sorbic là 254 nm.
Pha động là dung dịch NaH2PO4 5 mM (pH = 8,2) và acetonitril, chƣơng trình rửa
giải theo gradient với tốc độ 1 ml/phút. [13]
Trong quá trình nghiên cứu, tìm hiểu phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng
saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic, chúng tôi nhận thấy: do aspartam
không bền trong môi trƣờng nhiệt độ và pH cao [29] nên không nên chiết chất này
ra khỏi nền mẫu bằng NaOH [19] hay chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc [4], [16], [20].
Mặt khác, TCVN 8471:2010 tuy chỉ để xác định một số chất tạo ngọt nhƣng lại cho
thấy có khả năng ứng dụng để đồng thời xác định hàm lƣợng saccharin, aspartam,
acid benzoic và acid sorbic trong đa dạng nền mẫu. Do vậy, trong nghiên cứu này
chúng tôi cũng chọn phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột
sắc ký pha đảo C18 và detector DAD (có thể đo đƣợc ở nhiều bƣớc sóng khác nhau)
để xác định đồng thời các chất bảo quản và chất tạo ngọt, tối ƣu hóa các điều kiện
cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm hiện có với quy trình phân tích mẫu
phù hợp sao cho vừa tiết kiệm đƣợc thời gian lại vừa giảm đƣợc giá thành phân tích.
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 23/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 14 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
CHƢƠNG II
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu2.1.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Trong luận văn này, hƣớng nghiên cứu tập trung vào phân tích acid benzoic,
acid sorbic, saccharin, aspartam có trong thực phẩm.
Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phƣơng pháp xác định đồng thời acid
benzoic, acid sorbic, saccharin, aspartam trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao, từ đó áp dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng acid benzoic, acid
sorbic, saccharin, aspartam có trong thực phẩm đang lƣu thông trên thị trƣờng.
2.1.2. Đối tượng, thời gian và địa điểm lấy mẫu phân tích
Mẫu thực phẩm là mẫu đƣợc lấy ngẫu nhiên tại một số cửa hàng bánh kẹo
cạnh trƣờng học, chợ, siêu thị trên địa bàn Hải Dƣơng và mẫu đƣợc gửi tới labo
kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm trƣờng Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dƣơng.
Thời gian: 05/2014 đến 11/2014
Thực phẩm các loại bao gồm;- Bánh đậu xach, ô mai, nƣớc giải khát
- Rau củ đóng hộp: dƣa chuột muối
- Sản phẩm từ thịt: xúc xích
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu
2.2.1. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị chính:
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): AGILENT TECHNOLOGIES
Model: 1200HPL/6310MSD
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 24/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 15 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Hình 2.1: Hệ thống HPLC 1200 hãng Agilent
- Cột sắc ký C18 (250 mm x 4,6 mm x 5µm
- Van của máy sắc ký: G1311A
- Bơm gradient bốn kênh dung môi: G1311A (số: DE 62968696)
- Detector: PAD
Các thiết bị và dụng cụ khác
- Bộ lọc hút chân không thủy tinh, kích thƣớc lỗ giấy loc 0,45 µm
- Bể rung siêu âm (wise clean): Daihan, WUC-A10H
- Máy ly tâm: Hermle, Z300
- Cân phân tích (độ chính xác 0,0001g): Shimadzu, AW220
- Cân kĩ thuật (độ chính xác 0,01g): Citizen, CG 3102
- Máy đồng nhất mẫu: IKA, T25 BASIC ULTRA-TURRAX
- Máy đo pH: Elmetron, CP 501
- Bình định mức thủy tinh loại A: 1000 ml, 500 ml và 100 ml, 25ml, 20ml, 10ml
- Pipet thủy tinh loại A: 100 ml, 25 ml, 20 ml, 10 ml, 5 ml và 1 ml. - Micropipet: 100 - 1000µl, 10 - 100 µl.
- Ống đong thủy tinh chia độ loại A, dung tích 1000 ml.
- Ống ly tâm nhựa
2.2.2. Hóa chất, thuốc thử
Các loại hóa chất dùng trong phƣơng pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích (P.A.)
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 25/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 16 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
- Chất chuẩn gốc riêng rẽ thuộc hãng Sigma: acid benzoic 99%, acid sorbic
99%, saccharin 100%, aspartam 99,85%.
- Các hóa chất khác: K 4[Fe(CN)6].3H2O (merk), ZnSO4.7H2O (merk), KH2PO4
(merk), H3PO4 (merk), MeOH Trung Quốc, Acetonitril (merk)
Cách pha hóa chất cần thiết
- Dung dịch chuẩn gốc 1000ppm của mỗi chất : Cân chính xác 0,1g acid
benzoic chuẩn vào cốc có mỏ 50 ml hòa trong 1 - 2ml methanol cho tan hoàn toàn.
Chuyển vào bình định mức 100 ml, tráng rửa cốc và định mức vừa đủ 100ml bằng
nƣớc cất.
-
Pha acid acid sorbic, saccharin, aspartam chuẩn gốc tƣơng tự nhƣ trên vào các bình định mức 100ml. Các dung dịch trên đƣợc bảo quản ở 2 - 4
0C trong 3 tháng.
Dung dịch chuẩn trƣớc khi sử dụng phải lắc đều, rung siêu âm 10 phút.
- Dung dịch chuẩn trung gian: Hút chính xác 10 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc
(acid benzoic, acid sorbic, saccharin, aspartam) bằng pipet vào các bình định mức
100ml và định mức tới vạch bằng nƣớc cất để đƣợc hỗn hợp dung dịch chuẩn trung
gian 100ppm mỗi loại đƣờng.
-
Dung dịch Carrez 1: cân chính xác 15g K 4[Fe(CN)6].3H2O bằng cân kĩ thuật
vào bình định mức 100ml và định mức tới vạch bằng nƣớc cất.
- Dung dịch Carrez 2: cân chính xác 30g ZnSO4.7H2O bằng cân kĩ thuật vào
bình định mức 100ml và định mức tới vạch bằng nƣớc cất.
- Dung dịch phosphoric 5%: hút 3ml acid phosphoric vào bình định mức 50ml
và định mức đến vạch bằng nƣớc cất.
- Dung dịch KH2PO4 0,02M (pH = 4,3): cân chính xác 2,72g KH2PO4 vào
bình định mức 1 lít và định mức đến vạch bằng nƣớc cất. Dung dịch đƣợc đem lọc
qua bộ lọc màng thích hợp và siêu âm trƣớc khi sử dụng.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ
- Lấy mẫu ở các cửa hàng cạnh trƣờng học , ở chợ , đa i ly , cƣ a ha ng, siêu thị ta i khu
vƣ c Tp. Hải Dƣơng.
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 26/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 17 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
- Mỗi mẫu lấy khoảng 200 – 500 gam đối với mẫu rắn vào túi polyethylen khô,
sạch, đóng kín, và khoảng 500 ml đối với mẫu lỏng cho vào chai nhựa điền đầy đủ
thông tin chuyển về phòng thí nghiệm phân tích.
- Đối với mẫu rắn, mẫu đƣợc nghiền nhỏ bằng máy đồng nhất mẫu đến khi nhỏ
mịn, đồng đều. Đồng nhất xong cho vào túi kín, tránh ẩm. Đối với mẫu lỏng, mẫu
đƣợc lắc kỹ trƣớc khi đem phân tích.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích
2.3.2.1. Phương pháp xử lý mẫu
Nguyên tắc: Các nghiên cứu đƣợc xây dựng dựa trên TCVN 8471 : 2010
nhƣng có sự điều chỉnh trong quá trình xử lý mẫu và điều kiện chạy máy HPLC. Xử lý mẫu theo TCVN 8471 : 2010: Mẫu đƣợc chiết hoặc đƣợc pha loãng với nƣớc.
Dung dịch mẫu có nồng độ chất tạo ngọt cao đƣợc tinh sạch trên cột chiết pha rắn
hoặc bằng thuốc thử Carrez, nếu cần. Các chất tạo ngọt với nồng độ cao có trong
dung dịch mẫu thử đƣợc tách trên cột sắc kí pha đảo của HPLC và đƣợc xác định
bằng phép đo phổ tại bƣớc sóng 220 nm.[18]
Sơ đồ 2.1. Quy trình phân tích theo TCVN 8471:2010
2ml Dun d ch Carrez 1 Lắc vortex
2ml Dun dịch Carrez 2 Lắc vortex
Mẫu cân khoảng (2-10g) hoặc (5-20ml)
HPLC
+ 30ml H2O
Bình định mức 100 ml
Định mức bằng nƣớ c
Lọc qua giấy lọc
Đồng nhất mẫu
Rung siêu âm
lọc qua màng lọc 0,45 µm
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 27/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 18 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu các điều kiện phân tích
Nghiên cứu các điều kiện tối ƣu để xác định đồng thời hàm lƣợng acid
benzoic, acid sorbic, saccharin, aspartam đƣợc thực hiện theo các trình tự sau:
Tối ƣu hóa điều kiện chạy sắc ký trên máy HPLC
- Chọn detector: Detector là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của
phƣơng pháp. Acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam có khả năng hấp thụ
ánh sáng trong vùng tử ngoại rất tốt do trong cấu tạo phân tử của các chất phân tích
này đều có liên kết . Vì vậy, detector DAD (diode array detector) và detector UV
đều có thể đƣợc sử dụng cho việc định tính và định lƣợng các chất trên. Nhƣng
detector DAD cho phép đo đồng thời tại nhiều bƣớc sóng (đo phổ UV) trong quátrình sắc ký. Để thuận lợi cho công việc chung của phòng nên chúng tôi lựa chọn
detector DAD để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
- Chọn bƣớc sóng: Dựa vào tính chất của chất cần phân tích và điều kiện
trang thiết bị của phòng thí nghiệm để lựa chọn detector phù hợp, dùng detector vừa
lựa chọn để quét phổ và tìm bƣớc sóng tối ƣu cho mỗi chất cần phân tích.
- Chọn pha động: Có hai loại: pha động có độ phân cực cao và pha động có
độ phân cực thấp.
Loại thứ nhất có thành phần chủ yếu là nƣớc, tuy nhiên để phân tích các chất
hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực. Pha động loại này đƣợc
dùng trong sắc ký pha liên kết ngƣợc. Loại pha động này phù hợp với chất phân tích
là chất phân cực yếu.
- Chƣơng trình gradient: Sự thay đổi thành phần pha động diễn ra theo thời gian
- Ảnh hƣởng của pH của pha động: Các chất phân tích đều là những acid hoặc
muối của dạng acid nên pH của pha động sẽ quyết định chất phân tích trong cột tồn
tại ở dạng acid hay dạng muối. Khi thay đổi pH sẽ thay đổi thời gian lƣu của chất
phân tích trên cột.
Tối ƣu hóa quy trình xử lý mẫu
- Khảo sát thời gian rung siêu âm: Quá trình chiết chất phân tích ra khỏi nền
mẫu thực hiện chủ yếu thông qua quá trình rung siêu âm. Vì vậy quá trình chiết có
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 28/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 19 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
triệt để hay không phụ thuộc rất lớn vào thời gian rung siêu âm. Chúng tôi khảo sát
thời gian rung siêu âm từ 0 phút đến 60 phút.
- Khảo sát lƣợng MeOH thêm vào: Tùy từng loại thực phẩm, nhà sản suất có
thể thêm chất phụ gia ở dạng acid hay dạng muối. Nếu chất phụ gia đƣợc thêm vào
ở dạng muối, chỉ cần sử dụng nƣớc để chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu. Nếu
chất phụ gia thêm vào ở dạng acid, khó tan trong nƣớc. Cho MeOH vào mẫu để
chiết dạng acid trƣớc rồi thêm nƣớc để chiết nốt dạng muối của chất phân tích (nếu
còn). Lƣợng MeOH cho vào xử lý mẫu đƣợc khảo sát từ 2 ml đến 10 ml.
Xác định giá trị sử dụng của phƣơng pháp phân tích
- Đánh giá sự phù hợp của hệ thống sắc ký: Chuẩn bị một dung dịch chuẩn cónồng độ xác định, tiến hành phân tích trên HPLC lặp lại 6 lần. Xác định độ lệch
chuẩn tƣơng đối của các thông số: thời gian lƣu, diện tích pic.
- Độ chọn lọc/ đặc hiệu
Tính đặc hiệu nói lên khả năng xác định đúng chất phân tích khi có mặt các
tạp chất khác. Tính đặc hiệu liên quan đến việc chỉ xác định một chất phân tích.
Tính chọn lọc là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc xác
định một số hay nhiều chất phân tích chung một quy trình. Nếu chất cần phân tích
phân biết rõ với các chất khác thì phƣơng pháp phân tích có tính chọn lọc.
Xác định tính chọn lọc bằng cách phân tích các mẫu trắng, mẫu trắng có thêm
chất chuẩn.
+ Hệ số chọn lọc α (selectivity factor), còn gọi là hệ số tách: α ='
'
RA
RB
t
t
Theo qui ƣớc, B là chất bị lƣu giữ mạnh hơn A vì vậy α luôn luôn lớn hơn 1.
α còn đƣợc gọi là độ lƣu giữ tỷ đối (relative retention).
Để tách riêng hai chất, cần có α > 1, thƣờng chọn α trong khoảng 1,05 đến 2,0. α
càng lớn hai chất càng tách ra khỏi nhau, với α quá lớn thời gian phân tích sẽ kéo dài.
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 29/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 20 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
+ Độ phân giải: Độ phân giải (R S) là đại lƣợng đo mức độ tách hai chất trên
một cột sắc ký. R S =)(2/1
A B
RA RB
W W
t t
WA, WB là chiều rộng đáy pic của các chất 1 và 2
tRA, tRB là thời gian lƣu thực của các chất 1 và 2
R s = 0,75 hai pic không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều.
R s = 1,0 hai pic tách khá tốt,còn xen phủ nhau 4%
R s =1,5 hai pic tách gần hoàn toàn (chỉ xen phủ 0,3%)
- Khoảng tuyến tính
Khảo sát khoảng nồng độ của chất phân tích trong đó có sự phụ thuộc tuyến tính
giữa tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic nội chuẩn với nồng độ của chất đó.
Phƣơng trình hồi quy tuyến tính bxay
Trong đó : y là tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic nội chuẩn
x là nồng độ chất khảo sát
Sau khi xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đƣờng chuẩn và xác định hệ
số hồi quy tƣơng quan(R): hệ số tƣơng quan hồi quy, R phải đạt theo yêu cầu sau:
0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R 2 ≤ 1
- Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ)
Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác
định đƣợc nhƣng không nhất thiết phải định lƣợng đƣợc trong điều kiện thí nghiệm
cụ thể. Trong sắc ký LOD có thể đƣợc xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại
đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 3 (S/N =3).
Giới hạn định lƣợng LOQ là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có trong
mẫu thử có thể phát hiện đƣợc về mặt định lƣợng với độ đúng và độ chụm nhận
đƣợc. Trong sắc ký LOQ có thể đƣợc xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 30/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 21 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 10 (S/N =10). Có thế
tính LOQ theo LOD theo công thức: LOQ = 10/3 * LOD.
- Độ chụm (độ lặp lại)
Độ lặp lại thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo, là mức độ thống nhất của
các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích đƣợc áp dụng lặp lại trên cùng một
mẫu. Độ lặp lại đƣợc thể hiện bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD. Tiến hành thí
nghiệm lặp lại 6 lần. Tính độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD% của hàm lƣợng chất phân
tích. Các công thức tính toán nhƣ sau:
Tiến hành thí nghiệm n lần lặp lại.
+ Giá trị trung bình :
n
1i
ixn
1x
Trong đó x là giá trị trung bình số học của tập hợp các giá trị xi còn xi là giá
trị kết quả của mỗi lần thí nghiệm.
+ Độ lệch chuẩn :
1n
)xx(
SD
2n
1i
i
+ Độ lệch chuẩn tƣơng đối :
100
X
SDRSD
So sa nh RSD(%) tính đƣợc so với RSD(%) cho phe p ơ nồng đô chất tƣơng ƣ ng
theo AOAC. RSD(%) tính đƣợc không đƣợc lớn hơn trị giá trong bảng ở hàm lƣợng
chất tƣơng ứng, độ chụm thay đổi theo nồng độ chất phân tích. Nồng độ chất càng thấp
thì kết quả càng dao động nhiều (không chụm) nghĩa là RSD càng lớn. Mối liên quan
giữa nồng độ chất phân tích và RSD (%) đƣợc thể hiện trong phụ lục 1. [9]
- Độ đúng (độ thu hồi)
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 31/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 22 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Độ đúng đánh giá sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị thực
(true value) hoặc đƣợc chấp nhận thực (accepted value).
-
Độ thu hồi : Độ thu hồi đƣợc xác định dựa trên kĩ thuật thêm chuẩn. Lƣợngchất chuẩn thêm vào mẫu phân tích phải đảm bảo sao cho nồng độ của chất cần
nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong khoảng đã khảo sát. Độ thu hồi (R%)
đƣợc tính nhƣ sau:
100
C
CC%R
c
mcm
Trong đó: Cm+c: Nồng độ trong mẫu thêm chuẩn
Cm: Nồng độ trong mẫu
Cc: Nồng độ chuẩn thêm
Sau khi t nh độ thu hồi , so sánh kết quả t nh đƣơ c với các giá trị cho bởi trong
phụ lục 2. Độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau có kỳ vọng khác nhau . Thông
thƣơ ng đô thu hồi t nh đƣơ c pha i năm trong khoa ng cho phe p cu a AOAC ơ nồng đô
chất tƣơng ƣ ng . Mối liên quan giữa nồng độ chất phân tích và độ thu hồi (%) đƣợcthể hiện trong phụ lục 2.
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu :
- Tính toán kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel
- Tính toán thời gian lƣu, diện tích peak, chiều cao peak và tỷ lệ tín hiệu trên
nhiễu bằng phần mềm của thiết bị.
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 32/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 23 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu, xây dựng phƣơng pháp phân tích
3.1.1. Khảo sát các điều kiện phân tích
3.1.1.1. Lựa chọn detector
Xác định bƣớc sóng hấp thụ cực đại của các chất đang nghiên cứu: sử dụng
detector DAD để quét tìm, với khoảng quét phổ là 190 ÷ 400 nm. Các chất đều
đƣợc pha với nồng độ 10 ppm. Xác định đƣợc bƣớc sóng hấp thụ cực đại của
sacchari và aspartam là 210 nm, acid benzoic là 198 nm và 226 nm, acid sorbic
254nm. Hình ảnh quét phổ của saccharin và aspartam thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1: P hổ của Saccharin và Aspartam
Hình ảnh quét phổ của acid benzoic thể hiện ở hình 3.2.
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 33/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 24 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Hình 3.2: P hổ của acid Benzoic
Hình ảnh quét phổ của acid sorbic thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3: Phổ của acid Sorbic
Dựa vào kết quả quét phổ chúng tôi lựa chọn bƣớc sóng 210 nm để xác định
đồng thời saccharin và aspartam, bƣớc sóng 226 nm để xác định acid benzoic và
bƣớc sóng 254 nm để xác đinh acid sorbic.
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 34/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 25 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
3.1.1.2 Lựa chọn cột tách
Cột tách là trái tim của hệ thống HPLC, nó quyết định quá trình tách có độ
phân giải tốt hay không. Căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân
tích để lựa chọn cột tách phù hợp.
Do cấu trúc phân tử saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic là chất phân cực
yếu. Vì vậy, để tách đƣợc các chất này nên chọn pha tĩnh là pha ngƣợc. Mặt khác, sử dụng
chất nhồi pha ngƣợc thì hệ dung môi là những chất phân cực nên kinh tê hơn, ổn đi nh va
không phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ, độ ẩm nhƣ chất nhồi cu a pha thƣờng. [6], [7]
Sắc đồ hỗn hợp các chất đƣợc phân tích bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm)
đƣợc thể hiện ở hình 3.4
Hình 3.4. Sắc đồ phân tích hỗn hợp chấtc bằng cột C 18 (250mm×4,6mm× 5μm)
Cột C18 (250mm× 4,6mm × 5μm) có hình ảnh pic tách tốt, ít doãng, nhọn và cân
đối. Thích hợp cho phân tích đƣợc nhiều chất, để thuận tiện cho công việc chung
của phòng phân tích, chúng tôi chọn sử dụng cột Agilent C18 (250mm× 4,6mm ×
5μm) cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.1.3. Lựa chọn pha động
Sau pha tĩnh thì pha động là yếu tố thứ hai quyết định đến hiệu quả tách sắc
ký. Thành phần pha động ảnh hƣởng rất nhiều đến hiệu quả tách sắc ký.
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 35/93
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 36/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 27 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Thời Gian
Lƣu
(phút)
Saccharin 9,40 5,04 3,31 2,77 2,68 2,90 9,06 4,60 3,16
Aspartam 77,1 21,7 8,36 4,41 3,02 3,86 97,6 31,5 13,4
A. Benzoic 30,7 15,9 9,38 6,40 4,83 5,04 32,4 16,9 9,65
A. Sorbic 54,5 25,7 14,2 8,98 6,30 6,28 60,7 28,3 14,6
Kết quả thực nghiệm cho thấy: Chế độ chạy sắc ký pha động thành phần
không đổi (isocratic) với các tỷ lệ khác nhau của thành phần pha động thì khi giảm
tỷ lệ thể tích dung dịch đệm KH2PO4, thời gian lƣu giữ của một số chất phân tích
trên cột giảm, chúng ra sớm nên rất dễ lẫn với tạp chất khi phân tích mẫu thực tế.
Khi tăng tỷ lệ thể tích dung dịch đệm KH2PO4, các chất phân tích ra muộn, đặc biệt
là aspartam bị doãng pic. Nhƣ vậy sẽ làm giảm độ nhạy của phƣơng pháp phân tích.
Sắc đồ hỗn hợp các chất phân tích với thành phần pha động KH2PO4 : ACN = 80 :
20 (v/v) tại bƣớc sóng 210nm, 226nm và 254nm đƣợc thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5: Sắc đồ hỗn hợp chất phân tích , thành phần pha động KH 2 PO4 : ACN =
80 : 20 (v/v) tại bước sóng 210nm, 226nm và 254nm. Qua kết quả nghiên cứu trên chúng tôi nhận thấy: việc tách và định lƣợng các
chất theo chế độ đẳng dòng là không phù hợp với thực tế yêu cầu phân tích (trong
cùng một tỷ lệ dung môi, có chất thời gian lƣu quá ngắn, có chất thời gian lƣu quá
dài). Do đó chúng tôi chuyển sang chế độ gradient pha động. Bên cạnh đó, chúng
tôi chọn hệ dung môi là KH2PO4 : ACN vì khoảng cách thời gian lƣu của các chất
khi chạy với hệ dung môi này khá đều, thuận tiện cho chế độ chạy gradient.
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 37/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 28 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
3.1.1.4. Khảo sát pH của pha động
Nếu pH của pha động cao, aspartam sẽ bị phân hủy. pH của pha động chỉ nên
trong khoảng 2-7, vì lớn hơn 7 hay nhỏ hơn 2 sẽ làm tăng độ tan của các hạt silic
trên pha tĩnh. pH tốt nhất để tách các chất phân tích này là vùng acid vì ở vùng pH
này, các chất phân tích tồn tại ở dạng acid nên hấp phụ trên pha tĩnh tốt hơn. Sau khi
tham khảo tài liệu [18], chúng tôi sử dụng pha động là dung dịch đệm KH2PO4 0,02M
(pH = 4,3) và ACN. Điều chỉnh để đƣợc dung dịch KH2PO4 pH = 3 và pH = 5 bởi dung
dịch acid H3PO4 đặc và dụng dịch KOH trên máy đo pH. Tiến hành khảo sát các điểm
pH khác nhau của dung dịch KH2PO4 (pH = 3, pH = 4,3, pH = 5), tỷ lệ dung môi pha
động là KH2PO4 : ACN = 80 : 20 (v/v). Tốc dộ dòng là 1 ml/phút, thể tích bơm mẫu 20
µl, chất chuẩn hỗn hợp có nồng độ 5 ppm. Kết quả khảo sát sự ảnh hƣởng của pH pha
động đến thời gian lƣu của các chất phân tích đƣợc thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH pha động đn thời gian lưu của chất phân tích
pHThời gian lƣu (phút) Diện tích pic (mAU)
Sac Asp BA SA Sac Asp BA SA
3 3,120 4,843 14,617 14,092 615,68 165,79 441,25 845,84
4,3 2,759 4,464 6,174 8,822 661,46 167,06 416,38 891,96
5 2,786 4,276 3 3,297 970,9 171,2 - 925,53Saccharin và aspartam là hai chất có độ phân cực cao nhất trong các chất đang
nghiên cứu, nên 2 chất này thƣờng có thời gian lƣu ngắn nhất (đặc biệt là saccharin),
còn 2 chất bảo quản có thời gian lƣu dài hơn vì có độ phân cực thấp hơn. Dung dịch
đệm có pH = 3, pH này nhỏ hơn so với pKa của các chất nghiên cứu (bảng 1.1) nên
tất cả các chất nghiên cứu đều tồn tại dạng phân tử aid, vì vậy các chất bị lƣu giữ lâu
nhất. Với điều kiện pH = 4,3, saccharin và acid benzoic đã bắt đầu chuyển sang dạng
ion nên thời gian lƣu ngắn đi hẳn. Hai chất còn lại vẫn tồn tại dạng acid nên thời gian
lƣu có giảm nhƣng ít hơn. Với pH = 5, thời gian lƣu của cả 4 chất đều giảm rất lớn.
Tuy vậy, trong điều kiện pH = 4,3 thời gian lƣu của các chất cách đều nhau hơn,
thuận tiện cho việc khảo sát phƣơng pháp bằng chế độ gradient. Mặt khác, đa số diện
tích pic của các chất ở pH này cao hơn, pic nhọn và cân đối hơn so với pic ở pH = 3.
Nên chúng tôi chọn pH của dung dịch đệm là 4,3 để thực hiện nghiên cứu.
3.1.1.5. Khảo sát chương trình gradient pha động
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 38/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 29 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Để giảm thiểu đƣợc chi phí phân tích các chất trên trong thực phẩm, thời
gian lƣu của 1 chất không đƣợc quá dài, nếu thời gian lƣu dài, ngoài việc tăng chi
phí, các pic sẽ kém nhọn và kém cân đối, làm giảm sự chính xác của phép đo.
Nhƣng nếu pic ra sớm quá sẽ lẫn tạp chất có trong nền mẫu hoặc pic dung môi. Nói
chung, phù hợp nhất là thời gian lƣu từ 6 – 10 phút.
Vì chƣơng trình chạy đẳng dòng không đáp ứng đƣợc yêu cầu trên nên chúng
tôi tiến hành khảo sát chƣơng trình rửa giải gradient. Cố định các điều kiện sắc ký:
- Agilent C18 (250mm× 4,6mm × 5μm)
-
Pha động: Kênh A (ACN), kênh D (KH2PO4 0,02M, pH=4,3)
-
Detector DAD với bƣớc sóng 210 nm, 226 nm, 254 nm
- Mẫu phân tích là hỗn hợp chất chuẩn có nồng độ khoảng 10 ppm
- Tốc độ dòng vẫn giữ 1 ml/phút
Các kết quả nhƣ sau:
Ch độ g radient 1: Tỷ lệ dung môi là 95% dung dịch đệm pH= 4,3: 5% ACN (theo
thể tích) đƣợc duy trì từ lúc chạy nền đến khi bơm mẫu đƣợc 1 phút, sau đó tỷ lệ đó
đƣợc thay đổi dần đến phút thứ 3 thì đạt 80% đệm : 20% ACN. Duy trì tỷ lệ này
đến khi kết thúc phân tích 1 mẫu. Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ grad ient 1
đƣợc biểu diễn ở hình 3.6.
Hình 3.6. Sắc đồ các chất phân tích theo ch độ gradient 1
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 39/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 30 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Bảng 3.3 cho thấy: với tỷ lệ 95% dung dịch đệm:5% ACN (theo thể tích) thì
các chất phân tích ra rất muộn, trong khi đó, ở tỷ lệ 80% dung dịch đệm:20% ACN
(theo thể tích) các chất lại ra rất sớm. Kết hợp 2 tỷ lệ trên trong một chƣơng trình
gradient, thời gian lƣu của các chất ra sớm đã đƣợc lùi lại, sau đó lại nhanh chóng
kéo các chất còn lại ra nhanh hơn. Mặc dù thời gian lƣu của chất ra đầu tiên đã là
hơn 6 phút nhƣng thời gian lƣu của chất ra cuối cùng vẫn dài hơn 10 phút. Vì vậy
chúng tôi tiếp tục tăng tỷ lệ dung môi lên từ sau phút thứ 6. Tốc độ dòng vẫn giữ 1
ml/phút trong chế độ gradient 2.
Ch độ gradient 2
Tỷ lệ dung môi của chế độ gradient 2 đƣợc thể hiện ở bảng 3.5 Bảng 3.5. Tỷ lệ dung môi của ch độ gradient 2
t (phút) 0 1 3 6
% đệm 95 95 80 55
Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 2 đƣợc biểu diễn ở hình 3. 7.
Hình 3.7. Sắc đồ các chất phân tích theo ch độ gradient 2
Mặc dù pic ra cuối cùng vào khoảng 8,70 phút nhƣng các pic quá gần nhau,
có thể khó khăn khi tách chất ở nền mẫu thự tế. Để cải thiện vấn đề trên, chúng tôi
đã giảm tốc độ dòng tại thời điểm tỷ lệ dung môi cao nhất so với dung dịch đệm.
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 40/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 31 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Ch độ gr adient 3
Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 3 đƣợc thể hiện ở bảng 3.6
Bảng 3.6. Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của ch độ gradient 3
t (phút) 0 1 3 6 7,5
% đệm 95 95 80 55 55
Tốc độ dòng (ml/phút) 1 1 1 0,8 1
Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 3 đƣợc biểu diễn ở hình 3.8.
Hình 3.8. Sắc đồ các chất phân tích theo ch độ gradient 3
Các pic đã giãn ra đôi chút so với chƣơng trình gradient 2 nhƣng vẫn cần điều chỉnh
giảm tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng để pic giãn phù hợp hơn, đồng thời giúp cho pic
của aspartam cân đối.
Gradient 4
Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 4 đƣợc thể hiện ở bảng 3.7
Bảng 3.7. Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của ch độ gradient 4
t (phút) 0 1 3 6 7,5 9 9,5 10
% đệm 95 95 80 55 55 55 95 95
Tốc độ dòng (ml/phút) 1,0 1,0 1,0 0,8 0,6 0,8 1,0 1,0
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 41/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 32 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 4 đƣợc biểu diễn ở hình 3.9.
Hình 3.9. Sắc đồ các chất phân tích theo ch độ gradient 4
Chất phân tích trong sắc đồ thu đƣợc có thời gian lƣu hợp lý hơn (bảng 3.8):
saccharin: 6,519; aspartam: 8,231; acid benzoic: 9,393; acid sorbic: 9,866 (phút).
Diện tích pic và thời gian lƣu của các chất trong 4 chƣơng trình gradient vừa
khảo sát đƣợc so sánh trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Thời gian lưu và diện tích pic theo các chương trình gradient Ch độ
gradient 1
Ch độ
gradient 2
Ch độ
gradient 3
Ch độ
gradient 4
Thời
gian
lưu
(phút)
Sac 6,149 6,147 6,526 6,519
Asp 7,906 7,268 7,719 8,231
BA 9,615 8,203 8,626 9,393
SA 12,096 8,700 9,080 9,866
Diện
tích píc
(mAU)
Sac 1273,85 1267,09 1481 1726,06
Asp 429,191 451,404 405,442 626,816
BA 850,642 893,268 896,601 977,314
SA 793,79 829,201 977,314 826,708
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 42/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 33 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Từ kết quả thực nghiệm cho thấy, diện tích pic đƣợc chạy bằng chƣơng trình
gradient 4 là lớn nhất, pic cũng cân đối hơn. Vì vậy chúng tôi chọn chƣơng trình
gradient 4 cho việc rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột và giữ cố định điều kiện
này cho các bƣớc tiếp theo.
Nhƣ vâ y, nghiên cƣ u co ca c thông số đê cha y HPLC nhƣ sau:
- Cột tách: RP18 - C18 (250mm × 4,6mm × 5μm) - Hãng Agilent.
- Nhiệt độ cột: 30OC
-
Thể t ch bơm mẫu: 20l
- Detecter: DAD ơ bƣớc so ng 210 nm, 226 nm, 254 nm
Thành phần pha động: Kênh A: ACN; kênh D: KH2PO4 (pH = 4,3)
- Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng: tuân theo chƣơng trình gradient ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Chương trình gradient pha động và tốc độ dòng tối ưu
Thời gian(phút)
% ACN% KH2PO4
pH = 4,3
Tốc độ dòng
ml/phút
0 5 95 1,0
1 5 95 1,0
3 80 20 1,0
6 45 55 0,8
7,5 45 55 0,6
9 45 55 0,8
9,5 5 95 1,0
10 5 95 1,0
3.1.2. Tối ưu quá trình xử lý mẫu
Trong quá trình chế biến thực phẩm, khi các chất phụ gia thêm vào sẽ liên
kết, hòa trộn trong thực phẩm. Để xác định đƣợc các chất đó, chúng ta phải tách
đƣợc các chất phụ gia ra khỏi nền mẫu. Chúng tôi chọn mẫu phân tích là mẫu thạch
bách vị để khảo sát xử lý mẫu phân tích hàm lƣợng saccharin, aspartam, acid
benzoic và acid sorbic vì trong mẫu này chứa cả 4 chất cần phân tích trên.
Dự kiến quy trình phân tích tham khảo TCVN 8471:2010 nhƣ sơ đồ 3.1:
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 43/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 34 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Sơ đồ 3.1: Qui trình phân tích mẫu dự kin
Các chất bảo quản hoặc chất tạo ngọt, khi thêm vào mẫu hầu nhƣ ở dạng
muối của chúng, vì vậy ta có thể chiết chúng ra khỏi nền mẫu bằng nƣớc. Tuy
nhiên, cung có thực phẩm có mặt cả dạng acid và dạng muối của phụ gia đó. Dạng
acid ít tan trong nƣớc nhƣng tan nhiều trong MeOH. Vì vậy, khi xử lý chúng tôi
thêm MeOH vào mẫu trƣớc khi chiết với nƣớc.
Trong quy trình xử lý mẫu này, thời gian rung siêu âm và lƣợng MeOH thêm
vào là yếu tố có khả năng ảnh hƣởng nhiều nhất đến kết quả. Vì vậy chúng tôi tiến
hành khảo sát hai yếu tố này.
2ml Dun d ch Carrez 1 Lắc vortex
Mẫu cân khoảng (2-10g) hoặc (5-20ml)
2ml Dun d ch Carrez 2 Lắc vortex
HPLC
30ml H2O
Định mức bằng nƣớc
Lọc qua giấy lọc
Đồng nhất mẫu
Rung siêu âm
Ly tâm
MeOH Lắc vortex
Rung siêu âm
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 44/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 35 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
3.1.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm
Cân 4 mẫu thạch bách vị với khối lƣợng tƣơng đồng nhau, thực hiện quytrình xử lý mẫu tƣơng tự nhau trừ thời gian siêu âm. Mẫu 1: chỉ lắc với nước, mẫu
2: lắc đều rồi siêu âm 15 phút, mẫu 3: lắc đều rồi siêu âm 30 phút, mẫu 4: lắc đều
và rung siêu âm 60 phút . Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Sự phụ thuộc diện tích pic vào thời gian siêu âm
Mẫu 1: khôngsiêu âm
Mẫu 2: Siêuâm 15 phút
Mẫu 3: Siêuâm 30 phút
Mẫu 4: Siêuâm 60 phút
Khối lƣợng mẫu (g) 3,2453 3,2438 3,3016 3,0123
Diện tích pic Sac (SSac) 879,121 905,184 950,522 864,89
SSac/ Khối lƣợng mẫu 270,9 279,1 287,9 287,1
Diện tích pic Asp 75,618 139,844 152,367 149,223
SAap/ Khối lƣợng mẫu 23,30 43,11 46,15 49,54
Diện tích pic BA 7041,83 7177,93 7574,34 6943,76
SBA/ Khối lƣợng mẫu 2169,9 2212,8 2294,1 2305,1
Diện tích pic SA 2025,86 1976,67 2090,4 1923,26
SSA/ Khối lƣợng mẫu 624,2 609,4 633,1 638,5
Từ kết quả thực nghiệm cho thấy, diện tích pic/khối lƣợng mẫu tăng dần khi
tăng thời gian siêu âm. Nhƣng khi rung siêu âm 60 phút thì hầu nhƣ diện tích
pic/khối lƣợng mẫu của các chất không tăng. Vì vậy chúng tôi chọn thời gian rung
siêu âm 30 phút cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 45/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 36 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
3.1.2.2. Khảo sát ảnh hưởng lượng MeOH thêm vào mẫu
Mẫu sau khi đƣợc cân vào ống ly tâm 50 ml thì thêm nƣớc và MeOH nhƣ
sau: mẫu 1: chỉ cho 35ml nƣớc; mẫu 2: cho 2 ml MeOH và 32 ml nƣớc, mẫu 3: cho
5 ml MeOH và 30 ml nƣớc; mẫu 4: cho 10 ml MeOH và 25 ml nƣớc. Phân tích theo
quy trình và điều kiện đã xác định. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Sự phụ thuộc diện tích pic vào thể tích MeOH thêm vào mẫu
Từ kết quả thực nghiệm cho thấy, tăng lƣợng MeOH thêm vào dể xử lý mẫu
thì diện tích pic/khối lƣợng mẫu của chất phân tích tăng, nhƣng khi thêm 10 ml
MeOH vào để xử lý thì diện tích pic/khối lƣợng mẫu của chất phân tích hầu nhƣkhông tăng. Tức là, nếu thêm MeOH nhiều quá, không những không chiết đƣợc
chất ra nhiều hơn mà lại tốn kém. Vậy mỗi một mẫu, sau khi cân xong, thêm 5 ml
MeOH, lắc kỹ rồi thêm nƣớc, siêu âm 30 phút là phù hợp.
* Tóm lại: Qua qua tr nh thƣ c hiê n , nghiên cƣ u đa đƣa ra quy tr nh phân t ch nhƣ
sơ đồ 3.2:
Mẫu 1: thêm
0 ml MeOH
Mẫu 2:
thêm 2 ml
MeOH
Mẫu 3:
thêm 5 ml
MeOH
Mẫu 4:
thêm 10 ml
MeOH
Khối lƣợng mẫu (g) 3,9863 3,464 3,0362 3,2209
Diện tích pic Sac (SSac) 75,193 666,754 602,791 637,25
SSac/ Khối lƣợng mẫu 18,86 192,48 198,53 197,85
Diện tích pic Asp (SAsp) 202,347 168,769 161,277 170,862
SAsp/ Khối lƣợng mẫu 50,76 48,72 53,12 53,05
Diện tích pic BA (SBA) 5834,75 5207,6 4748,51 4984,68
SBA/ Khối lƣợng mẫu 1463,7 1503,3 1564,0 1547,6
Diện tích pic SA (SSA) 1776,62 1542,31 1433,92 1529,58
SSA/ Khối lƣợng mẫu 445,68 445,24 472,27 474,89
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 46/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 37 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Sơ đồ 3.2: Qui trình phân tích mẫu
Thuyết minh quy trình: Cân khoảng 2 ÷ 5 gam mẫu đối với mẫu rắn và 5 ÷ 10 ml
đối với mẫu lỏng vào ống ly tâm; thêm 5ml MeOH, votex kỹ, thêm 30 ml nƣớc cất,
rung siêu âm 30 phút. Sau khi siêu âm, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 2 ml
carrez 1, lắc đều, thêm 2 ml carrez 2, lắc đều, định mức vạch rồi lọc qua giấy lọc
băng xanh, lọc qua màng lọc whatman 0,45 µm và định lƣợng bằng phƣơng pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector DAD ở bƣớc sóng 210nm, 226 nm, 254 nm,
dƣ a va o thơ i gian lƣu, diê n t ch pic để định tính và định lƣợng.
- Hàm lƣợng chất phân tích đƣợc tính theo công thƣ c:
X(mg/100g) = Cm . m
Vm . 1000
100
Trong đo : Cm : Nông đô t nh theo đƣơ ng chuâ n (ppm).
Vm: Thê t ch dung di ch chiết sau khi xƣ ly mâ u(ml).
m : Khối lƣơ ng mâ u cân ban đầu (g)
Mẫu cân khoảng (2-5g) hoặc (5-10ml)
2ml Dun d ch Carrez 1 Lắc vortex2ml Dun d ch Carrez 2 Lắc vortex
HPLC
30ml H2O
Bình định mức 100 ml
Định mức bằng nƣớc
Lọc qua giấy lọc
Đồng nhất mẫu
Rung siêu âm 30 phút
5 ml MeOH Lắc vortex
Rung siêu âm
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 47/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 38 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
3.2. Xác định giá trị sử dụng của phƣơng pháp
3.2.1. Kê t qua nghiên cư u tính phù hợp của hệ thố ng
Tiến ha nh bơm 6 lần hỗn hợp dung dịch chuẩn saccharin 10,36 ppm, aspartam
11,603 ppm, acid benzoic 10,108 ppm và acid sorbic có nồng độ 10,623 ppm, tính độ
lặp lại của thời gian lƣu (tR ), diện tích pic, kết quả thu đƣợc trong bang 3.12:
Bảng 3.12: Kêt qua t nh toa n sư phù hợp của hệ thống
Sô lâ n
bơm
Thơ i gian lƣu (phút) Diê n t ch peak (mAU)
Sac Asp BA SA Sac Asp BA SA
1 6,619 8,311 9,45 9,933 1764,85 588,96 959,64 2637,36
2 6,639 8,321 9,471 9,948 1796,79 595,20 955,12 2634,18
3 6,644 8,323 9,476 9,95 1790,32 602,70 955,73 2633,45
4 6,647 8,322 9,478 9,952 1799,25 597,02 954,35 2639,28
5 6,663 8,329 9,482 9,955 1800,95 602,53 953,58 2640,20
6 6,646 8,322 9,476 9,951 1791,1 596,27 955,94 2646,99
Xtb
6,643 8,321 9,472 9,948 1790,54 597,11 955,73 2638,58
S 0,014 0,006 0,011 0,008 13,2939 5,1245 2,1090 4,9227
RSD(%) 0,215 0,07 0,121 0,078 0,7424 0,8582 0,2207 0,1866
Nhận xét : Qua bảng thấy kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký
cho thấy độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%) của thời gian lƣu và diện tích pic của các
chất phân tích trong 6 lần thử nằm trong khoảng 0,07 đến 0,86 % nằm trong khoảng
cho phép theo AOAC, điều này khă ng đi nh hê thông săc ky phu hơ p , ổn định, đảm bảo cho phân tích.
3.2.2. Độ đặc hiệu, chọn lọc
Để xác định tính chọn lọc, chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu trắng và
mẫu trắng có thêm chất chuẩn, so sánh mẫu trắng có thêm chuẩn acid benzoic và
acid sorbic. Kết quả thu đƣợc ở hình 3.10:
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 48/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 39 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
(A)
(B)
Hình 3.10: Sắc đồ của mẫu trắng (A) và mẫu trắng có thêm chuẩn (B)
Trên sắc đồ mẫu trắng không xuất hiện pic tại các thời gian lƣu của
saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic. Còn trên sắc đồ mẫu thêm chuẩn
có xuất hiện các pic tại các thời gian lƣu tƣơng ứng của acid benzoic và acid sorbic.
Nhƣ vậy phƣơng pháp có tính đặc hiệu và chọn lọc đáp ứng yêu cầu.
- Độ phân giải R S =)(2/1
A B
RA RB
W W
t t
và hệ số tách α =
'
'
RA
RB
t
t
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 49/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 40 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Từ sắc đồ của mẫu trắng thêm chuẩn thể hiện ở hình 3.9, xác định hệ số tách và độ
phân giải của 2 pic liền kề nhau:
Bảng 3.11. Hệ số tách và độ phân giải của pic các chất phân tích
Thông số Độ phân giải (α)
Saccharin Aspartam A. Benzoic A. Sorbic
Thời gian (phút) 6,416 8,172 9,367 9,861
Hệ số tách α 1,27 1,15 1,05
Độ rộng đáy pic (W) 0,0892 0,0898 0,0890 0,0820
Độ phân giải (R S) 19,6 13,4 5,8
Bảng 3.11 cho thấy: hệ số tách lớn hơn hoặc bằng 1,05, độ phân giải lớn hơn1,5. Vậy, các chất phân tích đã đƣợc tách khỏi nhau hoàn toàn, mức độ chọn lọc cao.
3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị đo
Chúng tôi đã xác định giới hạn phát hiện của thiết bị đối với các chất cần
phân tích và thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.12 : Giới hạn phát hiện của thit bị đối với các chất đang nghiên cứu
Chất phân tích LOD (ppm) LOQ (ppm) S/N
Saccharin 0,0216 0,07128 3,8
Aspartam 0,58 1,914 3,2
Acid benzoic 0,0843 0,27819 3,0
Acid sorbic 0,0162 0,05346 2,7
Sắc đồ xác định LOD của thiết bị đối với saccharin đƣợc biểu diễn theo hình 3.13
Hình 3.13: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với saccharin
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 50/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 41 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Sắc đồ xác định LOD của thiết bị đối với aspartam đƣợc biểu diễn theo hình 3.14
Hình 3.14: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với aspartam
Sắc đồ xác định LOD của thiết bị đối với acid benzoic đƣợc biểu diễn theo hình3.15
Hình 3.15: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với acid benzoic
Sắc đồ xác định LOD của thiết bị đối với acid sorbic đƣợc biểu diễn theo hình 3.16
Hình 3.16 : Sắc đồ LOD của thiết bị đối với acid sorbic
3.2.4. Khoảng tuyến tính
Trong phân tích định lƣợng khi tăng nồng độ chất phân tích đến một giá trị
giới hạn nào đó thì quan hệ giữa tín hiệu đo và nồng độ chất phân tích không còn
phụ thuộc tuyến tính. Khoảng nồng độ chất phân tích phụ thuộc tuyến tính vào
chiều cao hay diện tích pic gọi là khoảng tuyến tính, thƣờng đƣợc tính từ giới hạn
định lƣợng đến giới hạn tuyến tính.
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 51/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 42 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Với các điều kiện chạy HPLC đã chọn, chúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ
thuộc tuyến tính của diện tích pic sắc ký vào nồng độ của saccharin, aspartam, acid
benzoic và acid sorbic. Từ dung dịch chuẩn gốc 1000ppm chúng tôi đã pha loãng
thành chuẩn trung gian 100ppm và sau đó pha thành dãy dung dịch chuẩn làm việccủa các chất phân tích với các nồng độ khác nhau rồi tiến hành bơm vào hệ thống
HPLC. Kết quả phân tích dãy chuẩn trên máy HPLC đƣợc chỉ ra trong bảng 3.13:
Bảng 3.13: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ chất phân tích
Nồng
độ Sac
(ppm)
Diện tích
pic Sac
(mAU)
Nồng
độ Asp
(ppm)
Diện tích
pic Asp
(mAU)
Nồng
độ BA
(ppm)
Diện tích
pic BA
(mAU)
Nồng
độ SA
(ppm)
Diện tích
(mAU)
0,0216 3,673 0,58 22,658 0,0843 6,478 0,0162 2,578
0,518 93,439 1,166 59,130 0,505 47,764 0,531 131,83
1,036 184,694 5,802 302,98 1,011 97,137 1,062 264,43
5,18 910,542 11,603 588,96 5,054 489,032 5,312 1336,44
10,36 1764,85 17,405 906,35 10,108 959,641 10,623 2637,36
15,54 2687,81 23,206 1231,34 15,162 1450,87 15,935 3986,59
20,72 3627,47 46,412 2328,79 20,216 1956,81 21,246 5386,59
41,44 7023,94 69,618 3552,07 40,432 3744,21 42,492 10470,862,16 10448,1 92,824 4697,92 60,648 5678,09 63,738 15533
82,88 13420,2 80,864 7438,14 84,984 19850,6
Hình 3.17: Đường chuẩn của saccharin
trong khoảng nông độ 0,02 ÷ 80 ppm
Hình 3.18: Đường chuẩn của aspartam
trong khoảng nông độ 0,5 ÷ 90 ppm
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 52/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 43 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Hình ảnh pic của chuẩn hỗn hợp nồng độ 1 ppm đƣợc thể hiện ở hình 3.21
Hình 3.21. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp chuẩn 1 ppm của các chất phân tích.
3.2.5 . Độ lặp lại của phương pháp phân tích
Qua nghiên cứu chúng tôi thấy kết quả phân tích của phƣơng pháp phụ thuộc
rất nhiều vào nền mẫu. Muốn đƣa ra đƣợc qui trình phân tích chung cho các đối
tƣợng thực phẩm chúng ta phải tiến hành xác định độ lặp lại của phƣơng pháp trên
các nền mẫu khác nhau. Lựa chọn 7 đối tƣợng mẫu khác nhau: Xúc xích đại diện
cho thực phẩm giàu chất béo và protein, bánh ngọt đại diện cho thực phẩm giàu
Hình 3.19: Đường chuẩn của A. benzoic
trong khoảng nồng độ 0,08÷90 ppm
Hình 3.20: Đường chuẩn của A.sorbic
trong khoảng nông độ 0,01 ÷ 85 ppm
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 53/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 44 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
cacbon hydrat, và thạch bách vị đại diện cho thực phẩm tạo gel, dƣa chuột muối đại
diện cho rau củ đóng hộp, ô mai, kẹo và nƣớc ngọt .
Xác định độ lặp lại bằng cách phân tích mẫu lặp lại 6 lần bắt đầu từ bƣớc cân
mẫu (áp dụng cho 7 đối tƣợng mẫu khác nhau ), xác định độ lệch chuẩn tƣơng đối
RSD(%), để đánh giá RSD (%) của phƣơng pháp với RSD (%) của AOAC ở nồng
đô chất tƣơng ƣ ng.
Lâ p đƣơ ng chu ẩn với ca c nồng đô tƣ giới hạn phát hiện của máy đến nồng
độ phù hợp với chất phân tích trong mẫu, kết qua đƣợc thể hiện trong bảng 3.14 và
phụ lục 9.1
Bảng 3.14: Phương trình hồi quy và hệ số tương quan của đường chuẩn
Chất phân tích Khoảng nồng độ
ppm
Phƣơng trình hồi quy Hệ số tƣơng quan
Saccharin 0,05 – 20 y = 174,07x + 1,4182 R² = 0,9999
Aspartam 1,16 – 23 y = 42,936x - 1,0979 R² = 0,9999
Acid benzoic 0,08-20 y = 94,011x + 0,9942 R² = 1
Acid sorbic 0,02-21 y = 178,25x - 3,5319 R² = 1
K ết quả xác định lặp lại saccharin trên các đối tƣợng mẫu khác nhau theo các bảng dƣới đây:
Bảng 3.15: Kt quả phân tích lặp lại hàm lượng saccharin trong mẫu thực (n=6)
Tênmẫu
Khốilƣợng
mẫu (g)
Diện tíchpic mAU
Hàm lƣợng
Sac
(mg/100g)
Hàmlƣợng Sac(mg/100g)
SD RSD %
Xúcxích
3,1102 21,7397 0,187 0,182 0,0102 5,61
3,0042 20,4645 0,168
3,1315 21,3961 0,179
3,1253 21,1482 0,175
3,1028 21,8105 0,189
3,0233 21,918 0,196
Bánhđậuxanh
3,7609 300,304 4,58 4,62 0,0649 1,40
3,6821 300,286 4,67
3,5425 291,007 4,70
3,6682 294,084 4,59
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 54/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 45 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
3,6587 298,34 4,66
3,6233 287,042 4,53
Thạch
báchvị
3,3217 766,995 12,7 12,8 0,0753 0,589
3,3270 769,674 12,83,2650 759,402 12,8
3,1520 726,68 12,7
3,1250 729,252 12,8
3,1370 737,389 12,9
Dƣachuộtmuối
đónghộp
3,2309 47,8873 0,664 0,630 0,0248 3,94
3,0314 45,1916 0,655
3,1205 43,9134 0,611
3,0425 44,2305 0,6333,1841 44,163 0,604
3,0126 42,939 0,614
Ô mai 3,312 2528,087 44,4 44,3 0,172 0,389
3,314 2516,61 44,2
3,314 2521,52 44,2
3,292 2519,5 44,5
3,293 2517,1 44,5
3,321 2520,19 44,1Kẹo 3,5609 - - - - -
3,4121 - -
3,2425 - -
3,1462 - -
3,2121 - -
3,2133 - -
Nƣớc
ngọt
5 (ml) 110,262 1,31 1,31 0,0138 1,06
5 (ml) 111,707 1,325 (ml) 110,663 1,31
5 (ml) 107,807 1,28
5 (ml) 110,673 1,31
5 (ml) 109,451 1,30
Kết quả xác định lặp lại aspartam trên các đối tƣợng mẫu khác nhau theo
bảng 3.16 dƣới đây
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 55/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 46 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Bảng 3.16: Kt quả phân tích lặp lại hàm lượng aspartam trong mẫu thực (n=6)
Tên
mẫu
Khối
lƣợng mẫu
(g)
Diện tích
pic mAU
Hàm lƣợng
Asp
(mg/100g)
Hàm
lƣợng
Asp TB
SD RSD %
Xúc
xích
3,1102 - - - - -
3,0042 - -
3,1315 - -
3,1253 - -
3,1028 - -
3,0233 - -
Bánhđậu
xanh
3,7609 - - - - -3,6821 - -
3,5425 - -
3,6682 - -
3,6587 - -
3,6233 - -
Thạch
bách vị
3,3217 199,411 11,11
11,2 0,151 1,35
3,3270 196,241 10,9
3,2650 199,689 11,3
3,1520 190,837 11,2
3,1250 190,555 11,3
3,1370 189,256 11,1
Dƣa
chuột
muối
đónghộp
3,2309 32,2806 1,70
1,68 0,0668 3,98
3,0314 29,6205 1,64
3,1205 31,8874 1,73
3,0425 29,7113 1,643,1841 29,9637 1,59
3,0126 31,5202 1,77
Ô mai 3,312 - - - - -
3,314 - -
3,314 - -
3,292 - -
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 56/93
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 57/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 48 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
3,6233 - -
Thạch bách
vị
3,3217 5813,02 188
188 0,816 0,434
3,3270 5802,26 188
3,2650 5706,25 189
3,1520 5479,24 187
3,1250 5469,99 189
3,1370 5484,19 189
Dƣa
chuột
muối
đónghộp
3,2309 - -
- - -
3,0314 - -
3,1205 - -
3,0425 - -3,1841 - -
3,0126 - -
Ô mai
3,312 2920,65 94,3
94,4 0,320 0,340
3,314 2922,08 94,2
3,314 2918,55 94,1
3,292 2924,32 94,9
3,293 2915,06 94,6
3,321 2922,69 94,1
Kẹo
3,5609 35,395 1,03
1,06 0,0346 3,27
3,4121 34,625 1,05
3,2425 35,023 1,12
3,1462 32,82 1,08
3,2121 32,61 1,05
3,2133 32,12 1,03
Nƣớc
ngọt
5 (ml) 1341,13 28,1
28,0 0,358 1,28
5 (ml) 1344,85 28,2
5 (ml) 1338,76 28,0
5 (ml) 1305,04 27,3
5 (ml) 1339,88 28,1
5 (ml) 1350,21 28,3
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 58/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 49 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Kết quả xác định lặp lại acid sorbic trên các đối tƣợng mẫu khác nhau theo
bảng 3.18 dƣới đây
Bảng 3.18: Kt quả phân tích lặp lại hàm lượng acid sorbic trong mẫu thực (n=6)
Tênmẫu
Khốilƣợng mẫu
(g)
Diện tí ch
pic mAU
Nồng độ SA
(mg/100g)
Nồng độSA TB
SD RSD %
Xúcxích
3,1102 3480,896 76,8 77,3 1,35 1,75
3,0042 3462,004 79,0
3,1315 3456,847 75,7
3,1253 3475,055 76,3
3,1028 3477,23 76,9
3,0233 3473,607 78,8
Bánhđậuxanh
3,7609 1272,2 19,0 19,3 0,200 1,043,6821 1261,02 19,3
3,5425 1235,27 19,6
3,6682 1261,77 19,4
3,6587 1256,13 19,3
3,6233 1238,05 19,2
Thạch bách
vị
3,3217 1153,204 13,3 13,3 0,0816 0,615
3,3270 1146,933 13,2
3,2650 1131,82 13,3
3,1520 1091,38 13,2
3,1250 1084,8 13,2
3,1370 1099,41 13,4
Dƣachuộtmuốiđónghộp
3,2309 - - - - -
3,0314 - -
3,1205 - -
3,0425 - -
3,1841 - -
3,0126 - -
Ô mai 3,312 - - - - -
3,314 - -3,314 - -
3,292 - -
3,293 - -
3,321 - -
Kẹo 3,5609 114,178 1,86 2,04 0,107 5,23
3,4121 115,852 1,96
3,2425 116,191 2,07
3,1462 116,358 2,14
3,2121 116,57 2,10
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 59/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 50 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
3,2133 116,692 2,10
Nƣớcngọt
5 (ml) - - - - -
5 (ml) - -
5 (ml) - -
5 (ml) - -
5 (ml) - -
5 (ml) - -
Ghi chú: dấu (-) trong bảng là các mẫu có hàm lƣợng nhỏ hơn LOD.
Các kết quả thực nghiệm đƣợc so sánh với số liệu trong bảng phụ lục 1 cho
thấy độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%) nằm trong khoảng cho phép theo AOAC [9]
Nhƣ vậy phƣơng pháp có độ lặp lại tốt.
Sắc đồ của mẫu nƣớc ngọt sau khi đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp đangnghiên cứu thể hiện ở hình 3.22.
Hình 3.22. Sắc đồ của mẫu nước ngọt
3.2.6 . Độ đúng
Để xác định độ đúng chúng tôi thực hiện xác định độ thu hồi bằng cách thêm
một lƣợng các chất chuẩn vào mẫu phân tích và tiến hành phân tích nhƣ quy trình
đã nêu. Kết quả đƣợc thể hiện trong các bảng 3.18, bảng 3.19, bảng …
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 60/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 51 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
3.2.6 .1. Mẫu xúc xích
Mẫu xúc xích đƣợc thêm 4 ml; 6ml chuẩn trung gian có nồng độ: saccharin:
103,6 ppm; aspartam: 98,03 ppm; acid benzoic: 80,864 ppm; acid sorbic: 106,23
ppm. Mỗi nồng độ thêm chuẩn đƣợc lặp lại 3 lần.
Bảng 3.19: Kt quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu xúc xích
Lƣợngcân (g)
Diệntích pic
Hàm lƣợng
mẫu thêmchuẩn Cm+C
(mg/100g)
Hàmlƣợngchuẩn
thêm CC
(mg/100g)
Hàmlƣợng TB
Cm
(mg/100g)
Độ thuhồi(%)
Độ thuhồi TB
(%)
Sac
3,1141 709,18 13,4 13,3
0,182
99,3
96,5
3,1034 704,38 13,4 13,4 98,6
3,0558 695,80 13,4 13,6 97,4
3,1477 1012,8 19,0 19,7 95,4
3,2166 1003,3 18,4 19,3 94,5
3,1852 996,2 18,5 19,5 93,8
Asp
3,1141 220,37 13,1 12,6
0
103,8
104,2
3,1034 223,53 13,3 12,6 105,3
3,0558 221,69 13,4 12,8 104,4
3,1477 331,74 19,6 18,7 104,7
3,2166 328,16 18,9 18,3 103,5
3,1852 328,71 19,1 18,5 103,7
BA
3,1141 311,08 9,90 10,4
0
95,3
96,0
3,1034 314,40 10,0 10,4 96,4
3,0558 316,39 10,3 10,6 97,0
3,1477 470,29 14,8 15,4 96,1
3,2166 468,16 14,4 15,1 95,6
3,1852 467,74 14,6 15,2 95,5
SA
3,1141 4070,1 89,6 13,6
77,3
90,2
93,7
3,1034 4060,1 89,7 13,7 90,5
3,0558 4015,1 90,1 13,9 92,0
3,1477 4510,2 98,2 20,2 103,3
3,2166 4476,5 95,4 19,8 91,3
3,1852 4475,2 96,3 20,0 95,0
3.2.6 .2. Mẫu bánh đậu xanh
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 61/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 52 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Mẫu bánh đƣợc thêm 4 ml; 6ml chuẩn trung gian có nồng độ: saccharin: 103,6
ppm; aspartam: 104,427 ppm; acid benzoic: 101,08 ppm; acid sorbic: 106,23 ppm.
Mỗi nồng độ thêm chuẩn đƣợc lặp lại 3 lần.
Bảng 3.20: Kt quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu bánh đậu xanh
Lƣợng
cân (g)
Diện
tíchpic
Hàm lƣợng
mẫu thêmchuẩn Cm+C
(mg/100g)
Hàm
lƣợngchuẩn
thêm CC
(mg/100g)
Hàm
lƣợng TBCm
(mg/100g)
Độ thu
hồi(%)
Độ thu
hồi TB(%)
Sac 3,0161 962,59 18,3 13,7
4,62
99,9
101,2
3,0242 984,17 18,7 13,7 102,8
2,9361 983,30 19,2 14,1 103,4
3,0046 1334,2 25,5 20,7 100,9
2,9044 1319,7 26,1 21,4 100,4
2,9855 1318,4 25,4 20,8 99,9
Asp 3,0161 170,19 13,2 13,8
0
95,7
94,8
3,0242 171,46 13,2 13,8 95,7
2,9361 168,48 13,3 14,2 93,7 3,0046 249,19 19,4 20,9 92,8
2,9044 256,17 20,6 21,6 95,4
2,9855 257,43 20,1 21 95,7
BA 3,0161 368,88 13,4 13,4
0
100,0
98,7
3,0242 372,44 13,4 13,4 100,0
2,9361 359,19 13,8 13,8 100,0
3,0046 543,71 19,2 20,2 95,0
2,9044 559,16 20,4 20,9 97,6 2,9855 568,17 20,2 20,3 99,5
SA 3,0161 1717,7 32,0 14,1
19,3
90,1
91,4
3,0242 1719,5 32,0 14,1 90,1
2,9361 1716,1 32,9 14,5 93,8
3,0046 2055,9 38,5 21,2 90,6
2,9044 2045,8 39,6 21,9 92,7
2,9855 2053,9 38,7 21,3 91,1
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 62/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 53 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
3.2.6.3. Mẫ u thạch bách vị
Mẫu thạch bách vị đƣợc thêm 2ml; 4 ml; 6ml chuẩn trung gian có nồng độ:
saccharin: 103,6 ppm; aspartam: 116,03 ppm; acid benzoic: 101,08 ppm; acid
sorbic: 106,23 ppm. Mỗi nồng độ thêm chuẩn đƣợc lặp lại 2 lần.
Bảng 3.21: Kt quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu thạch bách vị
Lƣợngcân (g)
Diệntích
pic
Hàm lƣợngmẫu thêm
chuẩn Cm+C
(mg/100g)
Hàm
lƣợngchuẩn
thêm CC
(mg/100g)
Hàmlƣợng TB
Cm
(mg/100g)
Độ thuhồi
(%)
Độ thu
hồi TB(%)
Sac
3,6092 1194,9 18,8 5,74
12,8
104,5
103,2
3,617 1200,5 18,8 5,73 104,7
4,171 1689,0 23,3 9,94 105,6
4,211 1670,4 22,8 9,84 101,6
3,7895 1926,7 29,4 16,4 101,2
3,8047 1929,3 29,3 16,3 101,2
Asp
3,6092 324,96 17,1 6,43
11,1
93,3
93,0
3,617 323,12 16,9 6,42 90,3
4,171 472,46 21,8 11,1 96,4 4,211 471,18 21,5 11 94,5
3,7895 546,61 27,8 18,4 90,8
3,8047 552,11 28,0 18,3 92,3
BA
3,6092 6489,8 194 5,60
188,3
103,6
101,3
3,617 6500,7 194 5,59 102,0
4,171 7672,7 198,8 9,69 108,4
4,211 7680,5 197 9,60 90,6
3,7895 7184,6 205 16,0 104,4 3,8047 7179,3 204 15,9 98,7
SA
3,6092 1750,5 19,0 5,89
13,3
96,8
97,9
3,617 1746,9 19,0 5,87 97,1
4,171 2466,1 23,5 10,2 100
4,211 2482,3 23,4 10,1 100
3,7895 2814,4 29,7 16,8 97,6
3,8047 2805,8 29,4 16,8 95,8
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 63/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 54 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
3.2.6.4. Mẫu dưa chuột muối đóng hộp
Mẫu dƣa chuột muối đƣợc thêm 4 ml; 6ml chuẩn trung gian có nồng độ:
saccharin: 103,6 ppm; aspartam: 98,03 ppm; acid benzoic: 80,864 ppm; acid sorbic:
106,23 ppm. Mỗi nồng độ thêm chuẩn đƣợc lặp lại 3 lần.
Bảng 3.22: Kt quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu dưa chuột muối
Lƣợng
cân (g)
Diện
tích pic
Hàm lƣợng
mẫu thêm
chuẩn Cm+C
(mg/100g)
Hàm lƣợng
chuẩn thêm
CC
(mg/100g)
Hàm
lƣợng TB
Cm
(mg/100g)
Độ
thu
hồi
(%)
Độ thu
hồi TB
(%)
Sac
3,2124 718,497 13,2 12,9
0,63
97,4
96,9
3,2014 718,033 13,2 12,9 97,4
3,6225 704,134 11,4 11,4 94,5
3,3487 1062,09 18,8 18,6 97,7
3,0145 1058,54 20,8 20,6 97,9
3,2136 1050,86 19,3 19,3 96,7
Asp
3,2124 251,868 14,5 12,2
1,68
105
98,9
3,2014 250,904 14,5 12,2 105
3,6225 259,446 13,3 10,8 108
3,3487 370,69 20,6 20,8 91,0
3,0145 375,325 23,1 23,1 92,7
3,2136 372,9 21,6 21,7 91,8
BA
3,2124 316,757 9,78 10,1
0
96,8
97,0
3,2014 318,106 9,85 10,1 97,5
3,6225 318,777 8,72 8,93 97,7
3,3487 474,888 14,1 14,5 97,2
3,0145 472,732 15,5
16,1
96,3
3,2136 472,393 14,6 15,1 96,7
SA
3,2124 586,4 12,6 13,2
0
95,5
95,3
3,2014 585,366 12,7 13,3 95,5
3,6225 585,889 11,2 11,7 95,7
3,3487 878,179 18,1 19,0 95,3
3,0145 874,752 20,0 21,1 94,8
3,2136 873,934 18,8 19,8 94,9
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 64/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 55 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
3.2.6.5. Mẫu ô mai
Mẫu ô mai đƣợc thêm 4 ml; 6ml chuẩn trung gian có nồng độ: saccharin:
113,96 ppm; aspartam: 92,824 ppm; acid benzoic: 90,972 ppm; acid sorbic: 95,607
ppm. Mỗi nồng độ thêm chuẩn đƣợc lặp lại 3 lần.
Bảng 3.23: Kt quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu ô mai
Lƣợngcân (g)
Diệntích pic
Hàmlƣợng mẫu
thêmchuẩnCm+C
(mg/100g)
Hàmlƣợngchuẩn
thêm CC
(mg/100g)
Hàmlƣợng TB
Cm
(mg/100g)
Độ thuhồi(%)
Độ thuhồi TB
(%)
Sac
3,8794 3772,45 56,8 11,8
44,3
106,4
98,2
3,8742 3754,91 56,6 11,8 104,7
3,8657 3704,58 56,0 11,8 99,0
3,6061 3801,16 61,6 19,0 91,2
3,5659 3802,88 62,3 19,2 93,9
3,5947 3823,21 62,2 19,0 93,8
Asp
3,8794 189,596 8,8 9,6
0,0
92,1
96,1
3,8742 191,884 8,9 9,6 93,3
3,8657 192,115 9,0 9,6 93,53,6061 294,979 15,3 15,4 99,0
3,5659 301,478 15,8 15,6 101,3
3,5947 290,791 15,1 15,5 97,5
BA
3,8794 3728,86 103 9,38
94,4
91,5
96,5
3,8742 3720,45 103 9,39 90,4
3,8657 3722,82 103 9,41 93,3
3,6061 3683,68 109 15,1 99,3
3,5659 3674,25 110 15,3 104,4
3,5947 3678,34 110 15,2 100,3
SA
3,8794 975,003 9,78 9,86
0,0
99,2
99,8
3,8742 967,251 9,71 9,87 98,4
3,8657 968,541 9,75 9,89 98,5
3,6061 1467,6 16,1 15,9 101,0
3,5659 1469,16 16,3 16,1 101,1
3,5947 1465,72 16,1 16,0 100,8
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 65/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 56 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
3.2.6.6 . Mẫu kẹo
Mẫu kẹo đƣợc thêm 4 ml; 6ml chuẩn trung gian có nồng độ: saccharin: 103,6
ppm; aspartam: 122,78 ppm; acid benzoic: 80,864 ppm; acid sorbic: 84,984 ppm.
Mỗi nồng độ thêm chuẩn đƣợc lặp lại 3 lần
Bảng 3.24: Kt quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu kẹo
Lƣợngcân (g)
Diệntích pic
Hàmlƣợng mẫu
thêmchuẩnCm+C
(mg/100g)
Hàmlƣợngchuẩn
thêm CC
(mg/100g)
Hàmlƣợng TB
Cm
(mg/100g)
Độ thuhồi(%)
Độ thu
hồi TB(%)
Sac
3,2161 665,941 11,9 12,9
0
92,2
95,1
3,0242 683,061 13,0 13,7 94,6
3,2461 680,97 12,0 12,8 94,0
3,5823 1044,62 16,7 17,4 96,0
3,3175 1049,31 18,2 18,7 97,3
3,3329 1045,1 18,0 18,7 96,3
Asp
3,2161 218,434 15,9 15,3
0
103,9
104
3,0242 220,692 17,0 16,2 104,9
3,2461 222,365 16,0 15,1 106,0 3,5823 328,334 21,5 20,6 104,4
3,3175 331,108 23,4 22,2 105,4
3,3329 322,23 22,6 22,1 102,3
BA
3,2161 331,878 10,9 10,1
1,06
97,4
100
3,0242 331,539 11,6 10,7 98,5
3,2461 333,045 10,9 9,96 98,8
3,5823 504,444 14,9 13,5 102,5
3,3175 499,212 16,0 14,6 102,3
3,3329 497,447 15,8 14,6 101,0
SA
3,2161 667,121 11,7 10,6
2,04
91,2
96,1
3,0242 676,128 12,6 11,2 94,3
3,2461 674,911 11,7 10,5 92,0
3,5823 1024,11 16,1 14,2 99,0
3,3175 1028,17 17,5 15,4 100,4
3,3329 1024,34 17,3 15,3 99,8
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 66/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 57 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
3.2.6.7 . Mẫu nước ngọt
Mẫu nƣớc ngọt đƣợc thêm 4 ml; 6ml chuẩn trung gian có nồng độ: saccharin:
103,6 ppm; aspartam: 122,78 ppm; acid benzoic: 80,864 ppm; acid sorbic: 84,984
ppm. Mỗi nồng độ thêm chuẩn đƣợc lặp lại 3 lần
Bảng 3.25: Kt quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu nước ngọt
Thể
tích
mẫu
(ml)
Diện
tích pic
Hàm lƣợng
mẫu thêm
chuẩn Cm+C
(mg/100ml)
Hàm lƣợng
chuẩn thêm
CC
(mg/100ml)
Hàm lƣợng
TB Cm
(mg/100ml)
Độ
thu
hồi
(%)
Độ thu
hồi TB
(%)
Sac
5 786,146 9,06 8,29
1,31
93,5
94,3
5 789,659 9,1 8,29 94,0 5 790,981 9,11 8,29 94,1
5 1122,66 12,9 12,4 93,5
5 1130,12 13,0 12,4 94,3
5 1129,73 13,0 12,4 94,3
Asp
5 1036,65 39,8 9,28
30,9
95,9
92,1
5 1036,9 39,8 9,28 95,9
5 1039,73 39,9 9,28 97,0
5 1130,18 43,4 13,9 89,9 5 1135,65 43,7 13,9 92,1
5 1136,02 43,7 13,9 92,1
BA
5 1696,04 35,6 8,09
28,0
93,9
94,2
5 1696,12 35,6 8,09 93,9
5 1698,03 35,7 8,09 95,2
5 1855,64 39 12,1 90,9
5 1866,3 39,3 12,1 93,4
5 1871,67 39,4 12,1 94,2
SA
5 995,274 8,06 8,50
0,0
94,8
95,3
5 995,555 8,06 8,50 94,8
5 996,076 8,07 8,50 94,9
5 1487,58 12,0 12,7 94,5
5 1488,96 12,1 12,7 95,3
5 1490,95 12,1 12,7 95,3
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 67/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 58 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Các kết quả đƣợc so sánh với số liệu trong phụ lục 2 cho thấy độ thu hồi của
saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic trên đối tƣợng xúc xích, bánh đậu
xanh, thạch bách vị, dƣa chuột muối đóng hộp, ô mai, kẹo, nƣớc ngọt trong khoảng
90% - 104,2%, đạt yêu cầu trong quy định về độ thu hồi của AOAC.
Chú ý: Phƣơng pháp nghiên cứu tính kết quả theo hàm lƣợng acid benzoic và acid
sorbic. Thực phẩm bổ sung chất bảo quản là muối benzoat hoặc muối sorbat. Hàm
lƣợng muối benzoat hoặc muối sorbat đƣợc tính:
Hàm lƣợng muối benzoat = K× hàm lƣợng acid benzoic
Hàm lƣợng muối sorbat = K× hàm lƣợng acid sorbic
Trong đó K là hệ số qui đổi phụ thuộc vào loại muối.
VD: Với muối kali sorbate K=1,339 (Khối lƣợng phân tử kali sorbate/ khối lƣợng
phân tử acid sorbic)
3.2.7 . Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ = 3,3 × LOD)
của phƣơng pháp bằng cách phân tích mẫu thực và tiến hành pha loãng chất phân tích tớinồng độ nhỏ nhất mà vẫn thu đƣợc tín hiệu gấp 3 lần tín hiệu đƣờng nền (S/N = 3). LOD
hính bằng nồng độ trƣớc khi pha loãng chia cho hệ số pha loãng.
Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp đƣợc xác định đồng thời trong mỗi nền
mẫu sử dụng để xác định độ chụm và độ thu hồi . Kêt qua thƣ c hiê n nhƣ bảng 3.26:
Bảng 3.26. MDL và MQL của từng nền mẫu
Mẫu
Diện
tích
pic
S/N
MDL theo
đƣờng chuẩn
mg/100g
MQL theo
đƣờng chuẩn
mg/100g
MDL
Thực tế
mg/100g
MQL
thực tế
mg/100g
Xúc
xích
Sac 8,1087 3,6 0,062 0,205 0,0642 0,212
SA 21,787 3,6 0,644 2,125 0,687 2,27
Bánh Sac 5,2848 4,1 0,063 0,208 0,0623 0,205
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 68/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 59 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
3.2.8. Đánh giá độ chính xác của phương pháp bằng phân tích đối chứng
Trong quá trình xác nhận giá trị phƣơng phá p, mẫu nƣớc ngọt và mẫu thạch
bách vị đƣợc chúng tôi chia hai, một nửa thực hiện độ chụm, độ thu hồi, LOD theo
phƣơng pháp đang nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của Labo xét nghiệm an toàn vệ
sinh thực phẩm, trƣờng Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dƣơng. Một nửa đƣợc gửi tới
Viện Kiểm nghiệm Quốc gia (VKNQG), Hà Nội. Tại Viện Kiểm nghiệm Quốc Gia,
mẫu gửi phân tích đối chứng đƣợc thủy phân ở 50 0C, rung siêu âm và loại tạp rồi
bơm vào hệ thống HPLC với cột phân tích là cột anion để xác định đồng thời các
chất phân tích là saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic.
Kết quả so sánh của hai phòng thí nghiệm đƣợc thể hiện ở bảng 3.27:
đậu
xanhSA 5,0689 4,6 0,136
0,449
0,149 0,491
Thạch bách
vị
Sac 8,9441 2,8 0,142 0,469 0,138 0,454
Asp 31,154 3,0 1,85 6,105 1,99 6,56
BA 16,068 2,8 0,331 1,092 0,327 1,08
SA 8,0163 2,2 0,074 0,244 0,0756 0,249
Dƣa
chuột
muối
Sac 13,107 4,1 0,133 0,4390,137 0,453
Asp 10,468 2,7 0,5651,865
0,571 1,89
Ô mai Sac 13,151 6,5 0,074 0,244 0,0754 0,25
BA 14,649 2,6 0,304 1,003 0,315 1,04
Kẹo BA 35,22 3,0 0,372 1,228 0,372 1,23
SA 5,556 2,6 0,084 0,277 0,0874 0,288
Nƣớc
ngọt
Sac 5,41 3,1 0,065 0,215 0,0689 0,227
Asp 38,47 2,5 1,545 5,099 1,68 5,54
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 69/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 60 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Bảng 3.27 . Kt quả mẫu kiểm nghiệm đối chứng
Hàm lƣợng
Sac
(mg/100g)
Hàm lƣợng
Asp
(mg/100g)
Hàm lƣợng
BA
(mg/100g)
Hàm lƣợng
SA
(mg/100g)
Mẫu
nƣớc
ngọt
VKNQGKPH
(<0,2)29,5 26,8
KPH
(<0,2)
Hàm lƣợng
trung bình
(mg/100g)
(n=6)
1,30 30,86 27,99KPH
(< 0,16)
Mẫu
thạch
bách
vị
VKNQG 12,0 11,5 195 15,0
Hàm lƣợng
trung bình
(mg/100g)
(n=6)
12,79 10,29 188,37 13,27
Bảng 3.27 cho thấy, các kết quả đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp đang nghiên cứu
khá tƣơng đồng với kết quả của Viện Kiểm nghiệm Quốc gia, thậm chí, đối với chỉ
tiêu saccharin, phƣơng pháp chúng tôi đang nghiên cứu còn tỏ ra nhạy hơn khi xác
định đƣợc nồng độ saccharin trong mẫu nƣớc ngọt nhƣng Viện Kiểm nghiệm Quốc
gia thì không phát hiện.
.
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 70/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 61 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
CHƢƠNG IV
KÊ T LUÂ N VA KIÊ N NGHI
Nhƣ vâ y, qua qua tr nh phân t ch thực nghiệm , nghiên cƣ u đã thu đƣợc các
kết quả phù hợp với mục tiêu đề ra:
1. Đã khảo sát, xây dựng đƣợc phƣơng pháp phân tích đồng thời saccharin,
aspartam, acid sorbic và acid benzoic phù hợp: Cân khoảng 2 ÷ 5 gam mẫu đối với
mẫu rắn và 5 ÷ 10ml đối với mẫu lỏng vào ống ly tâm; thêm 5 ml MeOH, votex kỹ
rồi thêm 30 ml nƣớc cất, rung siêu âm 30 phút, cho sang bình định mức 100 ml,
thêm 2 ml dung dịch K 4[Fe(CN)6] và 2 ml ZnSO4, lọc qua giấy lọc sau khi định
mức, rồi lọc dịch thu đƣợc qua màng lọc whatman 0,45 µm và định lƣợng bằng
phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với các điều kiện:
- Nhiệt độ buồng cột: 30oC - Thể tích bơm: 20µl
- Cột C18 (250 mm x 4,6 mm x 5µm) - Nồng độ chuẩn bơm: 1ppm
- Detector: DAD 210 nm, 26 nm, 254 nm - Tỷ lệ dung môi pha động
tuân theo gradient:
Thời gian(phút)
% KH2PO4 0,02M(pH = 4,3)
Tốc độ dòng(ml/phút)
0 95 1,0
1 95 1,0
3 80 1,0
6 55 0,8
7,5 55 0,6
9 55 0,8
9,5 95 1,0
10 95 1,0
2. Tiến hành xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp nghiên cứu trên 7 đối
tƣơ ng mâ u la xúc xíc, bánh ngọt, thạch bách vị, dƣa chuột muối, ô mai, kẹo và nƣớc
ngọt tại phòng thí nghiệm cho kết quả tốt. Các kết quả thẩm định cụ thể thể hiện ở
bảng 4.1 nhƣ sau:
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 71/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 62 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Bảng 4.1. Bảng tổng kt kt quả thẩm định
Sac Asp BA SA
Khoảng tuyến
tính (mg/l)
0,0216 – 82,88 0,58- 92,824 0,0843-80,864 0,0162-84,984
PT đƣờng chuẩn y = 174,07x +
1,4182
y = 42,936x
- 1,0979
y = 94,011x +
0,9942
y = 178,25x -
3,5319
Hệ số tƣơng quan R² = 0,9999 R² = 0,9999 R² = 1 R² = 1
LOD (mg/l) 0,0216 0,580 0,0843 0,0162
LOQ (mg/l) 0,0713 1,91 0,278 0,0535
MDL (g/100g) 0,0623-0,138 0,571-1,99 0,315-0,372 0,0756-0,687
MQL (g/100g) 0,205-0,454 1,89-6,56 1,04-1,23 0,249-2,27
RSD% 0,389-5,61 0,661-3,98 0,340-3,27 0,615-5,23
Độ thu hồi (%) 92,1 – 104,2 94,2 – 101,3 94,2 – 101,3 91,4 – 99,8
Bảng 4.1. cho thấy phƣơng pháp nghiên cứu có giá trị sử dụng, đáp ứng đủ các yêu
cầu của AOAC.
Kiê n nghi :
Để đề tài đƣợc hoàn thiện hơn, chúng tôi kiến nghị tiếp tục nghiên cứu thực
hiện một số vấn đề sau:
Với những kết quả bƣớc đầu này, chúng tôi mong muốn sẽ tiếp tục phát triển
nghiên cứu để có thể đƣa ra một quy trình và điều kiện chạy máy tối ƣu để phân tích
các chất bảo quản là acid benzoic, acid sorbic, các chất tạo ngọt là saccharin,
aspartam, acesulfame –K, cyclamate và một số chất tạo màu thực phẩm.
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 72/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 63 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. Tài liệu tiếng Việt
1. Hồ Phú Hà (2012), Bài giảng Cơ sở các phương pháp bảo quản thực phẩm.
Viê n Công nghê sinh ho c & Thƣ c phâ m – trƣơ ng Đa i Ho c Ba ch Khoa Ha Nô i.
2. Nguyễn Đức Hoàng (2012), Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng
RhodaminB bằng phương pháp HPLC và ứng dụng phân tích hóa chất này
trong một số loại thực phẩm trên địa bàn thành phố Hải Dương . Luận văn thạc
sĩ – Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội 3. Nguyễn Thị Thanh Hƣơng (2012), Thực trạng và giải pháp nâng cao năng lực
quản lý việc sử dụng một số phụ gia trong ch bin thực phẩm tại Quảng Bình .
Luận án tiến sĩ – Viện Dinh Dƣỡng Quốc Gia
4. Khoa An toàn Vệ sinh Thực phẩm - Viện Dinh Dƣỡng Quốc gia, Phương pháp
xác định hàm lượng acid benzoic và acid sorbic trong thực phẩm.
5. Phạm Luận (1987), Cơ sở ly thuyêt sắc ky lỏng hiệu năng cao , Khoa Hoa học-
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
6. Trần Phúc Nghĩa (2011), Ứng dụng kỹ thuật sắc ký điện di mao quản phân tích
Acesulfame-K, Saccharin, Aspartam trong đồ uống . Luận văn thạc sỹ – Khoa
Hóa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
7. QCVN 4-8: 2010/BYT, Qui chuẩn kỹ thuật quốc gia thực phẩm – chất ngọt
tổng hợp.
8. QCVN 4-12:2010/BYT, Qui chuẩn kỹ thuật quốc gia thực phẩm – chất bảo quản.
9. Trần Cao Sơn (2010), Thâ m đi nh phương pha p trong phân t ch hoa ho c và vi
sinh vâ t , nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật .
10. Nguyễn Văn Ri (2004), Chuyên đề các phương pháp tách chiêt , Khoa hoa -
Trƣờng ĐH KHTN Hà Nội.
11. Nguyễn Duy Thịnh (2008), Bài giảng Các chất phụ gia dùng trong sản xuất thực
phẩm, Viê n Công nghê sinh ho c& Thƣ c phâ m – trƣơ ng Đa i Ho c Ba ch Khoa Ha Nô i.
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 73/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 64 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
12. Thông tƣ 27/2012/TT-BYT, Hướng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm.
13. Bùi Thị Minh Thúy (2014), “Xác định một số đƣờng hóa học và chất bảo quản trong
thực phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng, hiệu năng cao (HPLC)“. Luận văn thạc sỹ
khoa học –Khoa Hóa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội
14. TCVN 4714:1989, Đồ hộp rau quả: Phương pháp xác định hàm lượng acid
benzoic.
15. TCVN 6428:2007, Rau, quả và sản phẩm rau quả - Xác định hàm lượng acid
benzoic – Phương pháp quang phổ .
16. TCVN 7807:2007 , Rau, quả và sản phẩm rau quả - Xác định hàm lượng
acid sorbic.17. TCVN 8122:2009, Sản phẩm rau, quả - Xác định hàm lượng acid benzoic và
acid sorbic – Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
18. TCVN 8471:2010, Thực phẩm – Xác định hàm lƣợng acesulfame-K, aspartam
và saccharin
19. Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, Phương pháp xác
định hàm lượng acid benzoic và acid sorbic trong thực phẩm.
B. Tài liệu tiếng tiếng Anh:
20. AOAC 967.15, Benzoic acid in food – Thin_layer chromatographic method,
Officical Methods of Analysis of AOAC International 18th
Edition, 2005.
21. AOAC 963.19, Benzoic acid in food – Titrimetric method , Officical Methods
of Analysis of AOAC International 18th
Edition, 2005.
22. Ana Beatriz Bergamo, José Alberto Fracassi da Silva, Dosil Pereira de Jesus
(2011), “Simultaneous determination of aspartam, cyclamate, saccharin and
acesulfame – K in soft drinks and tabletop sweetener formulations by capillary
electrophoresis with capacitively coupled contractless conductivity detection”,
Food Chemistry 124, page 1714-1717.
23. Qing-Chuan Chen, Jing Wang (2001), “Simultaneous determination of
artificial sweeteners, preservatives, caffeine, theobromine and theophylline in
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 74/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 65 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
food and pharmaceutical preparations by ion chromatography”, Journal of
Chromatography A, Volume 937, Issues 1 – 2, 7, Pages 57 – 64
24. N. Dossi, et al (2006), “Simultaneous RP-hplc determination of additives in
soft drink”, Chromatographia, 63, pp 557 – 562.
25. Richard A. Frazier, Elizabeth L. Inns, Nicolo Dossi, Jennifer M. Harry E.
Nursten (2000), “Development of a capillary electrophoresis method for the
simultaneous analysis of artificial sweeteners, preservatives and colours in soft
drinks”, Journal of Chromatography A, 876, page 213 – 220.
26. Natalia E. Llamas & Maria S. Di Nezio & Miriam E. Palomeque & Beatriz S.
Fernández Band (2008), “Direct Determination of Sacchrin and Acesulfame – K in Sweeteners and Fruit Juices Powders”, Food Anal. Methods, 1:43-48.
27. Ion Trandafir, Violeta Nour, Mira Elena Ionică (2009), “Development and
validation of an HPLC method for simultaneous quantification of acesulfame-
K, saccharin, aspartam, caffeine and benzoic acid in cola soft drinks”,
Scientific study & research, Vol. X (2), ISSN 1582-540X, page 185 – 194.
28. Fatma Turak, Mahmure Üstün Özgür, and Abdürrezzak Bozdogan (2009),
“PLS-UV Spectrophotometric Method for the Simultaneous Determination of
Ternary Mixture of Sweeteners (Aspartam, Acesulfame – K and Saccharin) in
Commercial Products”, Innovations in Chemical Biology, page 305 – 311.
29. http://en.wikipedia.org/wiki/Saccharin
30. http://en.wikipedia.org/wiki/Aspartam
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 75/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 66 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Độ lặp lại chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) [9]
TT Hàm lƣợng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%)
1. 100 1 100% 1,3
2. 10 10-
10% 1,8
3. 1 10-2
1% 2,7
4. 0,1 10-3
0,1 % 3,7
5. 0,01 10-4
100 ppm 5,3
6. 0,001 10-
10 ppm 7,3
7.
0,0001 10-6 1 ppm 11
8. 0,00001 10-7
100 ppb 15
9. 0,000001 10-8
10 ppb 21
10. 0,0000001 10-9
1 ppb 30
Phụ lục 2.. Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC [9]
TTHàm lƣợ ng
[%]Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi [%]
1. 100 1 100% 98-102
2. 10 10-1
10% 98-102
3. 1 10-2
1% 97-103
4. 0,1 10-
0,1 % 95-105
5. 0,01 10-
100 ppm 90-107
6.
0,001 10
-5
10 ppm 80-1107. 0,0001 10
-6 1 ppm 80-110
8. 0,00001 10-7
100 ppb 80-110
9. 0,000001 10-
10 ppb 60-115
10. 0,0000001 10-9
1 ppb 40-120
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 76/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 67 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Phụ lục 3: Bảng giới hạn tối đa hàm lƣợng acid benzoic trong thực phẩm [12]
NHÓM BENZOAT
INS Tên phụ gia
210 Acid benzoic
211 Natri benzoat
212 Kali benzoat
213 Calci benzoat
Mã nhóm
thực
phẩm
Nhóm thực phẩm ML
(mg/kg)Ghi chú
01.7 Đồ tráng miệng từ sữa (VD: bánh
putđinh, sữa chua quả hoặc có hƣơng
liệu...)
300 13
01.2.1 Sữa lên men (nguyên chất) 300 13&CS243
04.1.2.2 Quả khô 800 13
04.1.2.3 Quả ngâm dấm, dầu, hoặc nƣớc muối 1000 13
04.1.2.5 Mứt, thạch, mứt quả 1000 13
04.1.2.7 Quả ngâm đƣờng 1000 13
04.1.2.9 Đồ tráng miệng chế biến từ quả, baogồm thức ăn tráng miệng từ nƣớc
hƣơng liệu quả
1000 13
05.1.5 Các sản phẩm tƣơng tự sô cô la, sản
phẩm thay thế sô cô la
1500 13
05.2 Sản phẩm kẹo cứng, kẹo mềm, kẹo
nuga…, khác với các sản phẩm thực
phẩm thuộc mã nhóm thực phẩm
050.1, 05.3 và 05.4
1500 13
05.3 Kẹo cao su 1500 13
07.0 Các loại bánh nƣớng 1000 13
08.3.1.2 Sản phẩm thịt, thịt gia cầm và thịt thú
xay nhỏ đã qua chế biến đƣợc xử lý
(VD nhƣ ƣớp muối) và làm khô không
xử lý nhiệt
1000 3&13
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 77/93
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 78/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 69 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
04.1.2.9 Đồ tráng miệng chế biến từ quả, bao gồm
thức ăn tráng miệng từ nƣớc hƣơng liệu
quả
1000 42
04.1.2.10 Sản phẩm quả lên men 1000 42
04.1.2.11 Nhân từ quả trong bánh ngọt 1000 42
04.1.2.12 Sản phẩm quả nấu chín 1200 42
04.2.2.3 Rau, củ (bao gồm nấm, rễ, thực vật thân củ
và thân rễ, đậu, đỗ, lô hội) tảo biển ngâm
trong dấm, dầu, nƣớc muối hoặc nƣớc
tƣơng
1000 42
04.2.2.5 Rau, củ (bao gồm nấm, rễ, thực vật thân củ
và thân rễ, đậu, đỗ, lô hội), tảo biển, quả
hạch và hạt, hạt nghiền và dạng phết nhuyễn
(VD: bơ lạc)
1000 42
05.2 Sản phẩm kẹo cứng, kẹo mềm, kẹo
nuga…, khác với các sản phẩm thực phẩm
thuộc mã nhóm thực phẩm 050.1, 05.3
1500 42
07.0 Các loại bánh nƣớng 1000 42
09.2.5 Cá, sản phẩm thủy sản hun khói, sấy khô,lên men hoặc ƣớp muối, kể cả nhuyễn thể,
giáp xác, da gai
200 305, 347,349&CS167
09.3 Thủy sản, sản phẩm thủy sản sơ chế, kể cả
nhuyễn thể, giáp xác, da gai
1000 42
10.2.1 Sản phẩm trứng dạng lỏng 5000 42
10.2.3 Sản phẩm trứng sấy khô và/hoặc đông tụ
nhiệt
1000 42
10.4 Đồ ăn tráng miệng từ trứng (VD: món sữatrứng)
1000 42
11.4 Đƣờng và siro khác (VD: xyloza, siro từ
cây thích, đƣờng dùng phủ bánh)
1000 42
11.6 Chất tạo ngọt, bao gồm cả chất tạo ngọt có
độ ngọt cao
1000 42&192
14.1.2.1 Nƣớc quả ép 1000 42,91&122
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 79/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 70 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Phụ lục 5: Bảng giới hạn tối đa hàm lƣợng aspartam trong thực phẩm [12]
ASPARTAM
INS Tên phụ gia
951 Aspartam
Mã nhóm
thực phẩm Nhóm thực phẩm
ML
(mg/kg)Ghi chú
01.1.2 Đồ uống từ sữa, có hƣơng liệu và/hoặc lên
men (VD: sữa sô cô la, sữa cacao, bia trứng,
sữa chua uống, đồ uống từ whey…)
600 161&191
01.2.1 Sữa lên men (nguyên chất) 1000 161&191
03.0 Kem lạnh thực phẩm, bao gồm nƣớc hoa quả
ƣớp lạnh và kem trái cây
1000 161&191
04.1.2.1 Quả đông lạnh 2000 161&191
04.1.2.2 Quả khô 2000 161&191
04.1.2.4 Quả đóng hộp hoặc đóng chai (đã thanh
trùng)
1000 161&191
04.1.2.5 Mứt, thạch, mứt quả 1000 161&19104.1.2.7 Quả ngâm đƣờng 2000 161&191
04.1.2.8 Sản phẩm chế biến từ quả, bao gồm: thịt quả
nghiền, nghiền nhuyễn, lớp tráng bề mặt từ
quả và sữa dừa
1000 161&191
04.1.2.9 Đồ tráng miệng chế biến từ quả, bao gồm
thức ăn tráng miệng từ nƣớc hƣơng liệu quả
1000 161&191
04.2.2.4 Rau đóng hộp, đóng chai (đã thanh trùng)
hoặc đóng túi (bao gồm nấm, rễ, thực vậtthân củ và thân rễ, đậu, đỗ, lô hội) và tảo
biển
1000 161&191
05.2.1 Kẹo cứng 3000 161&148
05.2.2 Kẹo mềm 3000 161&148
07.2 Bánh nƣớng nhỏ (ngọt, mặn, hƣơng vị mặn) 1700 165&191
09.2 Cá và sản phẩm thủy sản đã qua chế biến, kể 300 144&191
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 80/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 71 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
cả nhuyễn thể, giáp xác, da gai
09.4 Cá, sản phẩm thủy sản lên men hoặc đóng
hộp, kể cả nhuyễn thể, giáp xác, da gai đóng
hộp đƣợc bảo quản hoàn toàn
300 144&191
10.4 Đồ ăn tráng miệng từ trứng (VD: món sữa
trứng)
1000 161&191
11.4 Đƣờng và siro khác (VD: xyloza, siro từ cây
thích, đƣờng dùng phủ bánh)
3000 159&191
11.6 Chất tạo ngọt, bao gồm cả chất tạo ngọt có
độ ngọt cao
GMP 191
Phụ lục 6: Bảng giới hạn tối đa hàm lƣợng saccharin trong thực phẩm [12]
NHÓM SACCHARIN
INS Tên phụ gia
954(i) Saccharin
954(ii) Calci saccharin
954(iii) Kali saccharin
954(iv) Natri saccharin
Mã nhóm
thực phẩm Nhóm thực phẩm
ML
(mg/kg)Ghi chú
01.1.2 Đồ uống từ sữa, có hƣơng liệu và/hoặc lên
men (VD: sữa sô cô la, sữa cacao, bia trứng,
sữa chua uống, đồ uống từ whey…)
80 161
01.2.1 Sữa lên men (nguyên chất) 100 161&CS243
01.6.5 Các sản phẩm tƣơng tự pho mát 100 161
01.7 Đồ tráng miệng từ sữa (VD: bánh putđinh,
sữa chua quả hoặc có hƣơng liệu...)
100 161
04.1.2.3 Quả ngâm dấm, dầu, hoặc nƣớc muối 160 144
04.1.2.3 Quả ngâm dấm, dầu, hoặc nƣớc muối 160 CS260
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 81/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 72 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
04.1.2.4 Quả đóng hộp hoặc đóng chai (đã thanh
trùng)
200 161
04.1.2.5 Mứt, thạch, mứt quả 200 161
04.1.2.9 Đồ tráng miệng chế biến từ quả, bao gồm
thức ăn tráng miệng từ nƣớc hƣơng liệu quả
100 161
04.1.2.10 Sản phẩm quả lên men 160 161
04.2.2.4 Rau đóng hộp, đóng chai (đã thanh trùng)
hoặc đóng túi (bao gồm nấm, rễ, thực vật
thân củ và thân rễ, đậu, đỗ, lô hội) và tảo
biển
160 144&161
07.2 Bánh nƣớng nhỏ (ngọt, mặn, hƣơng vị mặn) 170 165
08.2.2 Sản phẩm thịt, thịt gia cầm và thịt thú
nguyên miếng hoặc cắt nhỏ đã xử lý nhiệt
500 161
08.3.2 Sản phẩm thịt, thịt gia cầm và thịt thú xay
nhỏ đã qua xử lý nhiệt
500 161
11.6 Chất tạo ngọt, bao gồm cả chất tạo ngọt có
độ ngọt cao
GMP
12.2.2 Đồ gia vị 1500 161
12.3 Dấm 300
12.4 Mù tạt 320
14.1.4.1 Đồ uống hƣơng liệu có ga 300 161
14.1.4.3 Đồ uống hƣơng liệu cô đặc (dạng rắn hoặc
lỏng)
300 127&161
14.1.5 Cà phê, sản phẩm tƣơng tự cà phê, chè, đồ
uống thảo dƣợc và các loại đồ uống từ ngũ
cốc, trừ đồ uống từ cacao
200 160
15.0 Thực phẩm mặn ăn liền 100
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 82/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 73 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Phụ lục 7. Lựa chọn pha động
7.1. Lựa chọn thành phần pha động
Thành phần pha động: 95% KH2PO4 – 5% CAN
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 83/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 74 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Thành phần pha động: 90% KH2PO4 – 10% ACN
Thành phần pha động: 85% KH2PO4 – 15% ACN
Thành phần pha động: 75% KH2PO4 – 25% ACN
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 84/93
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 85/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 76 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Thành phần pha động: 70% KH2PO4 – 30% MeOH
7.2. Khảo sát pH pha động (Chuẩn hỗn hợp 4 chất 5ppm)
Tại pH = 3
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 86/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 77 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Tại pH = 4,3
Tại pH = 5
Phụ lục 8: Sắc đồ khảo sát các điều kiện tối ƣu xử lý mẫu
8.1. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian rung siêu âm (sử dụng mẫu thạch bách vị)
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 87/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 78 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Mẫu đƣợc votex với nƣớc
Mẫu đƣợc votex và rung siêu âm 15 phút với nƣớc
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 88/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 79 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Mẫu đƣợc votex và rung siêu âm 30 phút với nƣớc
Mẫu đƣợc votex và rung siêu âm 60 phút với nƣớc
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 89/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 80 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
8.2. Khảo sát lƣợng MeOH thêm vào (sử dụng mẫu thạch bách vị)
Mẫu đƣợc chiết bằng 2 ml MeOH
Mẫu đƣợc chiết bằng 5 ml MeOH
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 90/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 81 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Mẫu đƣợc chiết bằng 10 ml MeOH
Phụ lục 9: Xác định giá trị sử dụng của phƣơng pháp
9.1. Đƣờng chuẩn
Nồng
độ Sac
(ppm)
Diện tích
pic Sac
(mAU)
Nồng
độ Asp
(ppm)
Diện tích
pic Asp
(mAU)
Nồng
độ BA
(ppm)
Diện tích
pic BA
(mAU)
Nồng
độ SA
(ppm)
Diện tích
(mAU)
0,0216 3,673 0,58 22,658 0,0843 6, 478 0,0166 2,578
0,259 46,6289 1,16 48,725 0,253 23,386 0,0222 3,614
0,518 90,641 5,802 244,39 0,505 48,186 44,18
1,036 186,252 11,603 504,736 1,011 98,14 0,531 92,853
5,18 887,27 23,206 992,39 5,054 472,305 1,062 190,526
10,36 1824,54 10,108 961,161 5,312 921,509
20,72 3601,97 20,216 1897,45 10,623 1896,98
21,246 3785,13
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 91/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 82 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Bảng. Tƣơng quan nồng độ và diện tích pic của các chất phân tích
9.2. Phân tích mẫu thực
Sắc đồ phân tích mẫu xúc xích
Sắc đồ phân tích mẫu dƣa chuột muối
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 92/93
Nguyễn Thị Hồng Thúy 83 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Sắc đồ phân tích mẫu bánh đậu
Sắc đồ phân tích mẫu kẹo
8/20/2019 Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong đối tư…
http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-phuong-phap-phan-tich-acid-benzoicsorbic-muoi-cua-chung 93/93
Sắc đồ phân tích mẫu ô mai táo