of 128 /128
תל אוניברסיטת- אביב סאקלר שם על לרפואה הפקולטה קלינית לביוכימיה החוג ל הגן בקרת מנגנון- Insulin-like Growth Factor-I Receptor על ידיBRCA1 התואר קבלת לשם חיבור" לפילוסופיה דוקטור" אברמוביץ שירלי מאת תל אוניברסיטת של לסאנט הוגש- אביב אוק טובר2003

לע Insulin-like Growth Factor-I Receptor ןונגנמprimage.tau.ac.il/libraries/theses/lifemed/free/1971700.pdf · SAOS-2 Osteosarcoma cell line SAP Shrimp alkaline phosphatase

  • Author
    others

  • View
    0

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of לע Insulin-like Growth Factor-I Receptor...

  • אביב-אוניברסיטת תל

    הפקולטה לרפואה על שם סאקלר

    החוג לביוכימיה קלינית

    על Insulin-like Growth Factor-I Receptor -מנגנון בקרת הגן ל

    BRCA1ידי

    חיבור לשם קבלת התואר

    "דוקטור לפילוסופיה"

    מאת שירלי אברמוביץ

    אביב-הוגש לסאנט של אוניברסיטת תל

    2003טובר אוק

  • TEL AVIV UNIVERSITY

    SACKER SCHOOL OF MEDICINE

    DEPARTMENT OF

    CLINICAL BIOCHEMISTRY

    Regulation of Insulin-like Growth Factor-I Receptor

    Gene Expression by BRCA1

    THESIS SUBMITTED FOR THE DEGREE OF “DOCTOR OF PHILOSOPHY”

    BY SHIRLEY ABRAMOVITCH

    SUBMITTED TO THE SENATE OF TEL-AVIV UNIVERSITY

    October 2003

  • :עבודה זו נעשתה בהדרכת

    פרופ' חיים ורנר

  • This work was carried out under the supervision of: Prof. Haim Werner

  • ....תודה

    על תמיכתו ועל יחסו , חיים ורנר על הנחייתו המדעית והמקצועית' לפרופ

    .תודה מיוחדת על עידוד העצמאות במחקר ומתן האמון. האישי והאנושי

    איתי , לימור שהרבני גרגיר, סנר'מיכל שליטא צוהנספחים לחברי המעבדה

    ירב גפן מ, נעמה רייזנר, עירית נהור, מורן רובינשטיין, שרון מאור, בנטוב

    חברותם , ובמיוחד גילה אידלמן על עבודת צוות נעימה ופוריהטרייביש

    .ותמיכתם המקצועית

    .טובה גלזר על רעיונותיה המדעיים' לדר

    . לאורך כל הדרךהתמיכעל הו, האהבעל ה, האמון על להורי היקרים

    השקעתם ותמיכתם , על סבלנותם, על העזרה הרבה, האהובים לאשר ושני

    . בולותללא ג

  • רשימת פרסומים

    Abramovitch, S., and Werner H. (2003). ). "Functional and physical interactions

    between BRCA1 and p53 in transcriptional regulation of the IGF-IR gene." Hormone and

    Metabolic Research, 35: 758-762 (2003).

    Abramovitch, S., Glaser, T., Ouchi, T., and Werner, H. (2003). "BRCA1-Sp1

    interactions in transcriptional regulation of the IGF-IR gene." FEBS Lett. 541:

    149-154.

    Maor, S. B., Abramovitch, S., Erdos, M.R., Brody, L.C., and Werner, H. (2000).

    "BRCA1 suppresses insulin-like growth factor-I receptor promoter activity:

    potential interaction between BRCA1 and Sp1." Mol. Genet. Metab. 69: 130-

    136.

    Werner, H., Shalita-Chesner, M., Abramovitch, S., Idelman, G., Shaharabani-Gargir, L.,

    and Glaser, T. (2000). "Regulation of the insulin-like growth factor-I receptor

    gene by oncogenes and antioncogenes: implications in human cancer." Mol Genet

    Metab. 71: 315-320.

  • תוכן עניינים

    I רשימת איורים

    II רשימת קיצורים

    VI תקציר

    1 מבוא.1

    Insulin like Growth Factor (IGF) 1-מערכת ה. 1.1

    IGF 1-מרכיבי מערכת ה. 1.1.1

    1 הליגנדים. 1.1.2

    1.1.3 .IGF-I 2

    1.1.4 .IGF-II 2

    3 הרצפטורים. 1.1.5

    4 חלבוני קישור. 1.1.6

    1.2 .Insulin like growth factor I receptor 5

    7 והעברת האותותIGF-IR-מנגנון הפעלת ה. 1.3

    1.4 .IGF-I Receptor 7 ומחזור התא

    1.5 .IGF-I Receptor8 ואפופטוזיס

    1.6 .IGF-I Receptor9 וטרנספורמציה

    IGF-IR 10-פרומוטר הגן ל. 1.7

    IGF-IR promoter 11- גורמים המשפיעים על ה1.7.1

    IGF 14-הקשר שבין סרטן השד ומערכת ה. 1.8

    1.9 .BRCA1 ,16 גן המקנה רגישות לסרטן השד והשחלה

    1.10 BRCA1 , 18 תורשתי ודיכוי גידולסרטן

  • 1.11 .BRCA119 וסרטן שד ספורדי

    20 ותפקידוBRCA1-מבנה ה. 1.12

    1.12.1 .BRCA1 ומנגנוני תיקון נזקי DNA 22

    1.12.2 .BRCA124 והבקרה על מחזור התא

    1.12.3 .BRCA125 כפקטור שעתוק

    1.12.4 .BRCA126 הכרומוזומים והפרדת

    27 מטרות המחקר. 2

    27 מטרות ספציפיות. 2.1

    27 חשיבות העבודה. 2.2

    28 חומרים ושיטות. 3

    28 תרביות תאים. 3.1

    28 שורות תאים3.1.1

    28 מצעי גידול ותנאי הגידול. 3.1.2

    29 פלסמידיםהפקת. 3.2

    30 פלסמידים וטרנספקציות. 3.3

    3.3.1 .Transient Transfection31 בשורות תאי סרטן השד

    3.3.2 .Transient Transfection בתאי Saos-2 32

    3.3.3 .Transient Transfection בתאי Drosophila Schneider 33

    3.3.4 .Transient Transfection בתאיHCT 116 33

    34 בדיקת פעילות לוציפרז. 3.3.5

    34 נירמול תוצאות הטרנספקציה . 3.3.6

    35 חישובים סטטיטסטים לתוצאות הטרנספקציה. 3.3.7

    3.4 .Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) 35

  • transcription/translation 35 בעזרת ערכת BRCA1הפקת חלבון . 3.4.1

    36 הכנת האוליגונוקלאוטיד הדו גדילי. 3.4.2

    initiator 37-הכנת מקטע גנומי הממוקם באזור ה. 3.4.3

    IGF-IR 38- מהפרומוטר ל-115+/40פוספורילציה של מקטע -דה. 3.4.4

    38 סימון הגלאי. 3.4.5

    EMSA 39ביצוע . 3.4.6

    Western Blotting 40-שיקועים אימונים ו. 3.5

    40 הכנת הדגימות. 3.5.1

    41 קביעת תכולת החלבון בתאים. 3.5.2

    העברה לממברנת ניטרוצלולוז, SDS-PAGEל 'הרצת החלבונים על גבי ג. 3.5.3

    41 וזיהוי חלבונים

    43 הנוגדנים. 3.5.4

    GST-pulldown 43שיטת . 3.6

    GST-BRCA1 43הפקת פרגמנטי . 3.6.1

    SDS-PAGE 45ל 'הרצת הפרגמנטים על גבי ג. 3.6.2

    Glutathione sepharose 45- לGST-BRCA1קשירת פרגמנטי . 3.6.3

    3.6.4 .Transient Transfection בתאי Drosophila Schneider 46

    Sp1 46 לחלבון BRCA1בדיקת קשר בין פרגמנטי . 3.6.5

    47 הנוגדנים. 3.6.6

    48 תוצאות. 4

    BRCA1 48 על ידי IGF-IR-וויסות הפרומוטר ל. 4.1

    BRCA1 54- האחראי על פעילות הIGF-IR-מיקום האזור בפרומוטר ל. 4.2

    IGF-IR 57- בוויסות הפרומוטר לSp1- וBRCA1ונים בדיקת קשר פונקציונלי בין החלב. 4.3

  • IGF-IR 58- בוויסות הפרומוטר לSp1- וBRCA1בדיקת הקשר בין . 4.4

    Sp1 63- וBRCA1חיפוש אחר קשר פיסי בין החלבונים . 4.5

    Sp1 65 האחראי על קישור לחלבון BRCA1חיפוש אחר האזור בחלבון . 4.6

    IGF-IR 67- על פעילות הפרומוטר לBRCA1 ∆ 11פעת החלבון בדיקת הש. 4.7

    IGF-IR 68- בוויסות הפרומוטר לp53- וBRCA1בדיקת קשר פונקציונלי בין החלבונים . 4.8

    BRCA1 69 על דיכוי פעילות הפרומוטר על ידי p53השפעת סטטוס . 4.9

    Sp1 71-ו p53 ,BRCA1 חיפוש אחר קשר פיסי בין החלבונים 4.10

    73 דיון. 5

    80 רשימת ספרות. 6

  • רשימת איורים

    עמוד איור IGF. 5- תיאור סכמתי של מרכיבי מערכת ה- 1איור

    IGF-IR. 6- תיאור סכמתי של הפרקורסור ל- 2איור

    11 . מחולדהpromoter IGF-IRאיור סכמתי של - 3 איור

    BRCA1. 21החלבון איור סכמתי של - 4 איור

    במספר שורות תאי BRCA1 על ידי IGF-IR-ל ה בקרת פעילות הפרומוטר ש- 5איור

    49 . סרטן השד

    51 . השוואת פעילות הפרומוטר לפי כמות משקל מולקולרי כנגד כמות מולרית- 6איור

    52 . תקיןBRCA1 מוטנטי לרצף BRCA1 השוואת רצף - 7איור

    53 . מוטנטיBRCA1 לעומת wild type BRCA1 בנוכחות IGF-IR- פעילות הפרומוטר ל- 8איור

    Saos-2. 54 בשורת תאי BRCA1 על ידי IGF-IR- וויסות הפרומוטר ל- 9איור

    של flanking region‘5 - על מקטעים בעלי חסרים שונים באזור הBRCA1 השפעת - 10איור

    IGF-IR. 56-ל הפרומוטר

    IGF-IR. 58- בבקרה על פעילות הפרומוטר לSp1- וBRCA1 קשר פונקציונלי בין - 11איור

    IGF-IR . 60- עם הפרומוטר לBRCA1-Sp1 לבדיקת קשרי EMSA ניסויי - 12איור

    61 . 115+ ועד לנוקלאוטיד בעמדה -40 הכנת המקטע הגנומי המתמשך מנוקלאוטיד בעמדה - 13איור

    IGF-IR . 62- עם הפרומוטר לBRCA1-Sp1 לבדיקת קשרי EMSA שימוש בניסויי - 14איור

    Sp1. 64- וBRCA1 בין החלבונים in vivo קישור - 15איור

    GST. 65 המאוחים לחלבון BRCA1 הפקת מקטעי - 16איור

    Sp1 . 66 אשר אחראים על הקישור עם החלבון BRCA1- איתור אחר האזורים השונים ב- 17איור

    חסר BRCA1 לעומת wild type BRCA1 השוואת פעילות הפרומוטר בנוכחות - 18איור

    67 .11 אקסון

    IGF-IR. 69- בבקרת הפרומוטר לp53- וBRCA1 קשר פונקציונלי בין - 19איור

    BRCA1. 70 על דיכוי פעילות הפרומוטר על ידי p53 השפעת סטטוס - 20איור

    p53. 71- וBRCA1 דיכוי פעילות הפרומוטר על ידי - 21איור

    p53. 72- וBRCA1 דיכוי פעילות הפרומוטר על ידי - 22איור

    I

  • רשימת קיצורים

    Abbreviation Full name

    Acc# Accession number

    ATP Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)

    β-ME β-Mercaptoethanol

    BAD Bcl-2 antagonist of cell death

    BARD1 BRCA1-associated RING domain protein

    BASC BRCA1-associated genome surveillance complex

    Bcl-2 B-cell CLL/lymphoma 2; Oncogene B-cell leukemia

    BP Binding protein

    bp base pair

    BRCA1 Breast cancer 1

    BSA Bovine serum albumin

    CIP Calf intestinal phosphatase

    CMV Cytomegalovirus

    DDW Double distilled water

    DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium DNA Deoxyribonucleic acid

    DSB Double strand breaks

    DTT Dithiothreitol

    EDTA Ethylenediamine-tetraacetic acid (disodium salt)

    EGTA Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N,N-tetraacetic acid

    EGF Epidermal growth factor

    II

  • EGFR Epidermal growth factor receptor

    EMSA Electrophoretic mobility shift assay

    FBS Fetal bovine serum

    FGF Fibroblast growth factor

    F.P.U. Footprinting unit

    GH Growth Hormone

    GST Gluthatione S transferase

    HCT Human colorectal carcinoma

    HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazine ethane sulfonic acid

    HR Homologous recombination

    HRP Horseradish peroxidase

    IGF-BP Insulin -like growth factor binding protein

    IGF-I Insulin -like growth factor I

    IGF-II Insulin -like growth factor II

    IGF-IR Insulin -like growth factor I receptor

    I.P. Immunoprecipitation

    IPTG Isopropyl beta-D-thiogalactose

    IR Insulin receptor

    IRS-I Insulin receptor substrate-I

    LUC Luciferase

    MAPK Mitogen-activated protein kinase

    MDM2 Mouse double minute 2

    Mut Mutant

    III

  • NHEJ Nonhomologous end-joining

    NP-40 Nonidet® P 40 Substitute

    OD Optical density

    PBS Phosphate buffered saline

    PCR Polymerase chain reaction

    PDGF Platelet-derived growth factor

    PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride

    PML Promyelocytic leukemia protein

    PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase

    PKB Protein kinase B

    Poly dIdC Poly deoxyinozide deoxycytidine

    RB Retinoblastoma

    RNA Ribonucleic acid

    SAOS-2 Osteosarcoma cell line

    SAP Shrimp alkaline phosphatase

    SCID severe combined immunodeficient

    SDS Sodium dodecyl sulfate

    SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

    SV40 Simian virus 40

    TBP TATA box binding protein

    TEMED N-tetramethyl ethylenediamine

    UTR Untranslated region

    UV Ultra Violet

    IV

  • VEGF Vascular endothelial growth factor

    VHL Von-Hippel Lindau

    WT1 Wilm’s Tumor 1

    V

  • תקציר

    הינו רצפטור המבוטא ברוב הרקמות וממלא (Insulin like Growth Factor-I Receptor (IGF-IR -ה

    בגדילה IGF-IRהדרישה המוחלטת לפעילותו של . גדילה ובהתפתחות נורמלית ביונקיםתפקיד מרכזי ב

    עברו טרום לידתית שהתקבלה בעכברים שתמותההודגמה באופן ברור על ידי עיכוב גדילה חמור ו והתפתחות

    “knock-out”הומוזיגוטי ב -IGF-IR .הרצפטור ל-IGF-Iהוא בעל פעילות ו מעורב גם בתהליכים ממאירים

    .in vitro וגם in vivoאנטי אפופטוטית חזקה גם

    TATA או CAAT וחסר מוטיבים C- וG עשיר בנוקלאוטידים IGF-IR-אזור הבקרה של הגן ל

    box ,נמצא כי באזור . לת שעתוק יעיל ברוב הגנים האאוקריוטיםשני אזורי בקרה הדרושים לרוב להתח

    . IGF-IR- אשר מכוון את נקודת תחילת השעתוק לגן ל”Initiator“הפרומוטר קיים אתר ייחודי המכונה

    אזור התחלת . זה מופיע במספר פרומוטרים של גנים המווסתים התמיינות והתפתחות initiatorמוטיב

    על כן אזור , (ATG)תרגום לאזור התחלת הupstream 1 Kb ממוקם IGF-IR-השעתוק של הגן ההומני ל

    מכיל מספר אתרי קישור פוטנציאלים הפרומוטר אזור . ארוך במיוחד ’UTR) untranslated region 5) -ה

    . את פעילות הפרומוטרצורה ניכרתחלבון בעל אצבעות אבץ המגרה ב, Sp1לגורם שעתוק

    הם בעלי תפקיד חשוב הן IGF-IR-הפועלים על ידי קישורם אל ה, IGF-II- וIGF-I, הליגנדים

    רוב גידולי סרטן השד ושורות התאים . בהתפתחות וגדילה של בלוטות החלב והן בהתמרה סרטנית של השד

    בעזרת IGF-IR-בעוד שדיכוי ה, ושל חלבוןIGF-IR mRNAהנגזרות מהם מבטאים רמות גבוהות של

    מונעים את שגשוג התאים המשופעל על ידי הרצפטור antisense oligomersנוגדנים ספציפיים או בעזרת

    .ועל כן מרמזים שקיימת דרישה בסיסית לפעילות הרצפטור בהתפתחות גידולי שד

    ה יינט אשר מוטציה בו נמצאה בהתאמה לkDa 220 מקודד לפקטור שעתוק במשקל BRCA1-הגן ל

    משתתף במספר מסלולים ביולוגים BRCA1-חלבון ה. עירהופעת גידולי סרטן שד ושחלה בגיל צמוקדמת לה

    .גידול תאים ואפופטוזיס, ושמירה על יציבות גנומיתDNAתיקון נזקי , הכוללים שעתוק גנים

    כמדכא גידול התקבלו ממחקרים אשר הראו כי החדרת BRCA1-עובדות התומכות בפעילות ה

    BRCA1יתרה מזאת. שד ושחלה לתאים הובילה לעצירת גדילה של שורות תאי סרטן,antisense

    VI

  • oligomers כנגד BRCA1 mRNA האיצה את גדילת התאים הנורמלים ותאים סרטניים ואף עודדה התמרה

    .NIH3T3של תאי

    גבוהות מאד בגידולי IGF-IR- בעל פעילות של מדכא גידול ומאחר ורמות ביטוי הBRCA1-מאחר ו

    מטרתנו היתה לבחון את , על כן. BRCA1- מהווה גן מטרה לפעילות הIGF-IR-הנחנו כי הגן ל, סרטן השד

    .IGF-IR- על ביטוי הגן לBRCA1יכולת הבקרה הפוטנציאלית של

    transientוג התבצעו טרנספקציות מס,IGF-IR- על הפרומוטר לBRCA1על מנת להעריך את השפעת

    תמשנו בפלסמיד המכיל נוקלאוטידים השותבטרנספקצי. שונות ובמספר שורות תאיםת וי שימוש בשיט"ע

    ווקטור יחד עם , luciferase reporter gene- לupstream המשובט IGF-IR- של הפרומוטר ל-640+/476

    הוכנס , לשם נירמול התוצאות על פי יעילות הטרנספקציה. (BRCA1 (pcBRCA1-385- להמקודדביטוי

    . pcDNA3הריק פלסמיד בורת שלילית השתמשנו כביק .β-galactosidase-לתאים בנוסף ווקטור המקודד ל

    , יתר על כן. במספר שורות תאי סרטן השד42-45%~התוצאות הראו כי הדיכוי שהתקבל היה בשיעור של

    BRCA1דיכא את פעילות הפרומוטר ל -IGF-IRבשורת תאי אוסטאוסרקומה ,Saos-2 . דיכוי זה נמצא

    אלו נתמכו גם בתוצאות הניסויים אשר הראו כי ממצאים . שהוחדרה לתאיםBRCA1-בתלות לכמות ה

    הובילה לירידה ביכולת דיכוי (185delAG) מוטנטי BRCA1החדרת ווקטור המקודד לחלבון קטום של

    .IGF-IR-הפעילות הפרומוטר ל

    IGF-IR על הפרומוטר לגן של BRCA1מאחר ומצאנו כי האזור אשר אחראי לפעילות הדיכוי של

    , Sp1 ומאחר שאזור זה מכיל מספר אזורי קישור לחלבון השעתוק -188 לבין -476ם משתרע בין נוקלאוטידי

    מגביר את פעילות הפרומטור של ה Sp1 גורם השעתוק בין לBRCA1 בדקנו את הקשר הפונקצינלי בין

    IGF-IR . לצורך זה השתמשנו בתאיSchneider ממקור דרוזופילה אשר אינם מבטאים Sp1אנדוגני .

    45%- בSp1 הנגרמת על ידי IGF-IR- מדכא את פעילות השפעול של הפרומוטר לBRCA1הראנו כי

    IGF-IR מדכא את פעילות השפעול של BRCA1הממצא כי . Drosophila Schneiderבשורת תאי

    לדכא BRCA1הובילה לחשיבה כי קיימים שני מנגנונים אפשריים באמצעותם מצליח , Sp1הנגרמת על ידי

    ועל ידי כך מונע IGF-IR נקשר אל רצף הפרומוטר של BRCA1, האחד. Sp1על ידי את פעילות השפעול

    VII

  • נקשר BRCA1החלבון , להיקשר אל אתרי הקשירה השמורים שלו ולשפעל את הפרומוטר והשניSp1-מ

    בכדי . להיקשר לאתרי הקשירה השמורים שלוSp1-חלבון ובעקבות זאת לא מאפשר ל- בקשר חלבוןSp1-ל

    Electrophoretic mobility shift- החלטנו להשתמש בשיטת הBRCA1ו מהמנגנונים פועל לבדוק לפי אל

    assay (EMSA) עם חלבון BRCA1 , שהופק על ידי שעתוק ותרגוםin vitro . מצאנו כיBRCA1 ,בעצמו ,

    לאתרי הקישור שלו הממוקמים Sp1אך מנע את יכולת הקישור של , DNA-לא הציג יכולת קישור ל

    שימוש בשיטת השיקוע . שהוספהBRCA1-כתלות בכמות ה, ”initiator“- ולאזור הIGF-IR- לבפרומוטר

    שימוש , בנוסף. Sp1 נבעה מקישור ספציפי לחלבון BRCA1האימוני הראה כי פעילות הדיכוי של

    איפשר לנו למקם BRCA1 הכוללים את כל רצף החלבון GST המאוחים לחלבון BRCA1בפרגמנטים של

    חיזוק נוסף לממצאים התקבל בניסויי טרנספקציה . 260-802 בין החומצות האמיניות Sp1ושר את האתר הק

    תקין מדכא את פעילות הפרומוטר בעוד שווקטור BRCA1 בהם החדרת ווקטור המבטא MCF7בתאי

    . החסר חומצות אמינו אלו לא הצליח לדכא את פעילות הפרומוטרBRCA1המבטא

    . p53 מבוקר בצורה שלילית על ידי מדכא הגידול IGF-IR-וק הגן למחקרים קודמים הראו כי שעת

    . IGF-IR- בבקרת הגן לp53 לבין BRCA1החלטנו לבדוק את הקשר התפקודי הפוטנציאלי בין , על כן

    להם החדרנו את הגן המדווח המכיל MCF7טרנספקציה בשורת תאי סרטן השד -בצענו ניסויי קו, למטרה זו

    . מוטנטיp53- ולwild type p53-ל, BRCA1- בשילוב עם ווקטורים המקודדים לIGF-IR-את הפרומוטר ל

    ואת , p53המבטאים את הגן לחלבון , +/+ HCT 116ניסויים דומים התבצעו גם בשורת תאי סרטן המעי

    .p53אשר אינם מבטאים , -/- HCT, התאים הנגזרים מהם

    . p53 הן בנוכחות והן בהעדר IGF-IR- הצליח לדכא את פעילות הפרומוטר לBRCA1מצאנו כי

    הראנו , כמו כן. מוטנטיp53 לא היה השפעה על פעילות הפרומוטר בתאים המבטאים BRCA1לחלבון , אולם

    .p53- וBRCA1כי קיים קשר פיסי בין

    דיכוי שעתוק . BRCA1- מהווה גן מטרה לפעילות הIGF-IR-ממצאנו מרמזים כי הגן ל, לסיכום

    אינו מסוגל להקשר אל Sp1בעקבות כך . Sp1 מערב קישור לחלבון BRCA1על ידי IGF-IR-הפרומוטר ל

    דיכוי הפעילות , יתרה מזאת. IGF-IR- ולעורר את ביטוי הגן לIGF-IR-האתרים השמורים שלו בפרומוטר ל

    VIII

  • p53-הופעת מוטציה בגן ל, אך יחד עם זאת. p53 יכול להתקיים הן בנוכחות והן בהעדר BRCA1בידי

    חוסר היכולת של מדכאי גידול מוטנטים לדכא את . BRCA1למנוע את פעילות הדיכוי הנגרמת על ידי עלולה

    המתבטאות על פני התא ולקישור ליגנדים IGF-IR- עלולה לגרום לעליה ברמות הIGF-IR-ביטוי הגן ל

    ברה בחלוקת הג, קישור זה עלול להוביל לירידה באפופטוזיס. הקיימים במחזור הדם או המיוצרים מקומית

    .התאים וההישרדות של תאים ממאירים

    IX

  • מבוא .1

    IGF(Insulin like Growth Factor(-מערכת ה .1.1

    גדילה נורמלית והתמיינות הינם תוצאה של תוכנית גנטית אשר מעורבים בה פקטורים תוך וחוץ תאיים

    . הפועלים יחדיו באיזון עדין בין שני תהליכים מנוגדים של שגשוג תאי ומוות תאי

    תפקיד חשוב בגדילה ובהתפתחות נורמלית ממלאת(Insulin like Growth Factor (IGF-מערכת ה

    Receptor--Insulin like Growth Factor-Iהדרישה המוחלטת לפעילות הביולוגית של ה. ביונקים

    (IGF-IR) ,טרום לדתית שהתקבלה בעכברים שעברו תמותההודגמה באופן ברור על ידי עיכוב גדילה חמור ו

    “knock-out”הומוזיגוטי בגן ל -IGF-IR) Liu et al., 1993 & Baker et al., 1993.(

    IGF-מרכיבי מערכת ה .1.1.1

    אשר מהווים פקטורי IGF-I, IGF-IIהליגנדים : מורכבת ממספר רב של משתתפיםIGF-מערכת ה

    עד IGFBP-1(ששה חלבוני קישור , )IGF-IR, IGF-IIR(רצפטורים המתבטאים על פני התאים , גדילה

    IGFBP-6 (שר מווסתים את פעילות הוחלבונים נוספים א-IGFBPs כגון פרוטאזות ועוד )Moschos &

    Mantzoros, 2002.(

    הליגנדים .1.1.2

    בנויים משרשרת יחידה בעלת , ומכאן שמם, הדומים מבנית לאינסולין, IGF-II- והIGF-I-חלבוני ה

    לו בנויים הפרקורסורים לליגנדים א. (Moschos & Mantzoros, 2002) לפרואינסולין62%הומולוגיה של

    מכיל גם , אשר בדומה למבנה של הפרואינסולין) D- וA,B,C( אזורים 4-משרשרת פוליפפטידית המורכבת מ

    C-בו חל חיתוך של אזור ה, לאינסולין בניגוד לתהליך עיבוד הפרואינסולין. Dמלבד אזור , הוא אזורים אלה

    , )Chan et al., 1992(סולפידים -די נשארות קשורות יחדיו באמצעות קשרים B- וAועל ידי כך יחידות

    1

  • ועל כן הליגנדים נשארים כשרשרת C אינם כוללים חיתוך אזור IGFs-תהליכי הבשלת הפרקורסורים ל

    .(Werner & LeRoith, 1996a)פוליפפטידית אחת

    1.1.3. I-IGF

    5 - אקסונים ו6 -ומורכב מ, 12 המקודד על ידי הגן ההומני ממוקם על כרומוזום IGF-Iהליגנד

    חומצות 70 ומקודדים לחלבון בעל (kb (Rotwein et al., 1986 80 -ינטרונים המשתרעים לאורך של כא

    רמות . אך למעשה כמעט כל רקמות הגוף מסוגלות ליצרו, מתרחשת בעיקר בכבדIGF-I-יצירת ה. אמינו

    בד ומהרקמות מהכIGF-Iאך עיקר בקרת היצור וההפרשה של , בסרום מושפעות מפקטורים רביםIGF-I-ה

    ,.GH) (Schwander et al., 1983; Roberts et al(האקסטרהפטיות מתבצעת על ידי הורמון הגדילה

    המופרשות GH- מפעיל משוב שלילי על בלוטת ההיפופיזה ועל ידי כך משפיע על רמות הIGF-I-ה ).1986

    חות העוברית אך חשוב נמוך בשלבי ההתפתIGF-I-ביטוי ה). Tannenbaum et al., 1983(מבלוטת זו

    הוא הורמון הכרחי בהתפתחות אברים IGF-Iכמו כן נמצא כי . מאד לגדילה והתפתחות לאחר הלידה

    (organogenesis)כפי שנצפה בעכברים בהם חלה פגיעה מכוונת בגן ל -IGF-I) Powell-Braxton et al.,

    הראו שיעור הישרדות של Cre/Loxp שנוצרו בעזרת שימוש בשיטת IGF-I-nullבדיקת עכברי ). 1993

    בנוסף עכברים אלה אינם מגיעים לבגרות . ואיחור בהתבגרות35%עיכוב גדילה של , לאחר לידה42%

    אך אלה לא , בסרוםGH הוביל להופעת כמויות גבוהות של IGF-Iכמו כן המחקר הראה כי העדר . מלאה

    GH מבקר שלילית את הפרשת IGF-Iכי ממצאים אלו מחזקים את ההנחה . הצליחו לעורר את גדילת הגוף

    (Liu & LeRoith, 1999).

    1.1.4. II-IGF

    ומקודד kb30 אקסונים המשתרעים לאורך 9מכיל , 11 מופה לכרומוזום IGF-IIהגן ההומני של

    הינו בעל מאפיינים שונים IGF-II-שעתוק הגן ל). Tricoli et al., 1984( חומצות אמינו 67לחלבון בעל

    2

  • ברוב הרקמות , לאמור. (genomic imprinting) והוא בעל מנגנון של החתמה גנומית IGF-I-מאלה של ה

    .(DeChiara et al., 1991) מבוטא מהאלל האבהי בעוד ששעתוק האלל האימהי מושתק IGF-IIהנורמליות

    זאת מאחר ששני , ישנה פעילות פרוליפרטיבית ואנטיאפופטוטיתIGF-II-גם ל, IGF-I-בדומה ל

    ניתן לציין כי מידע חשוב שהתקבל ). IGF-IR)O'Dell & Day, 1998 -הללו פועלים דרך ההליגנדים

    , )כל אחד לחוד או בשילוב (IGF-IR- ולIGF-II, IGF-I- לKnockoutממודל של עכברים אשר עברו

    בעוד שחשיבותו פוחתת לאחר , משחק תפקיד חשוב בהתפתחות ובגדילה העובריתIGF-II-הראה כי ה

    ). Baker et al., 1993(חשוב במיוחד בשלבים שלאחר הלידה , לעומתו, IGF-I-ה. הלידה

    הרצפטורים .1.1.5

    יש עדויות המוכיחות כי , למרות שכל אחד מהליגנדים הינו בעל אפיניות גבוהה ביותר לרצפטור שלו

    ומה שהינו רצפטור טרנסממברנלי הד, IGF-IR- מתווכות באמצעות הIGFs-רוב הפעילויות הביולוגיות של ה

    חוץ תאיות הקושרות את הליגנד αהרצפטור מורכב משתי שרשראות . במבנהו לזה של הרצפטור לאינסולין

    ). 1,2איורים (שבחלקן הציטופלסמטי הן בעלות פעילות טירוזין קינז , חוצות ממברנהβושתי שרשראות

    ממלא IGF-I-ר להרצפטו. (LeRoith et al., 1991)השרשראות קשורות זו לזו בקשרים דיסולפידים

    מעודד שגשוג ואף תורם , הוא בעל פעילות אנטיאפופטוטית, משמע. תפקיד חשוב בהישרדות התאים

    .כמו כן מאפשר גם העברת אותות להתמיינות התאים. לטרנספורמציה של התאים

    והוא חסר , חוץ תאית ברובה, בנוי משרשרת פוליפפטידית אחת(II (IGF-IIRהרצפטור מטיפוס

    האחראי למיחזור (mannose 6 phosphate (Man-6-P-רצפטור זה זהה לרצפטור ל. טירוזין קינזפעילות

    והגן שלו , בא לידי ביטוי ברוב רקמות ותאי היונקיםIGF-II/Man-6-P-Receptor. אנזימים ליזוזומלים

    . שמור במינים שונים

    טורים היברידים הנוצרים ישנן עדויות המצביעות על קיומם של רצפ, בנוסף לרצפטורים שהוזכרו

    ). IGF-I -הרצפטור לאינסולין והרצפטור ל( מכל רצפטור β- וαכהטרוטטרמרים משתי תת היחידות

    וכיום ידוע כי רצפטורים היברידים פזורים ברקמות רבות , רצפטורים אלה אופיינו לראשונה בשורות תאים

    3

  • IGF-I) Federici etלק חשוב בקשירת הם אחראים לח, כמו הלב ושריר שלד, במספר רקמות. של יונקים

    al., 1997; Bailyes et al., 1997.(

    חלבוני הקישור .1.1.6

    . (IGF Binding protein (IGFBP - נישאים בזרם הדם על ידי משפחת הIGFs, בניגוד לאינסולין

    נלי טרמיN-במיוחד במתחמי ה, חולקים דמיון במבנה ראשוני, הכוללים כששה חלבוני קישור, חברי המשפחה

    , )בפרופפטיד16-20 (אחד ממאפייניהם החשובים הוא הימצאות מספר ציסטאינים שמורים . טרמינליC-וה

    פעילותם של הליגנדים מושפעת ממשפחה. (Shimasaki & Ling, 1991)המסודרים כקבצים באזורים אלו

    הארכת זמן : קישור כוללתפקיד חלבוני ה. המצויים במחזור הדם ובנוזלים החוץ תאיים, זו של חלבוני קישור

    ,.Rajah et al(מניעת גירוי יתר לגדילת התאים או אפופטוזיס מופרז , בסרוםIGFs-מחצית החיים של ה

    ,.Zapf et al(אל כלי הדם ובקרה על קישור הליגנדים אל הרצפטורים /בקרה על מעבר הליגנדים מ, )1999

    שלילית על פעילות הליגנדים על ידי שליטה חלבונים אלה יכולים להשפיע בצורה חיובית או ). 1995

    (IGFBP proteases)פעילות חלבוני הקישור מווסתת בעזרת פרוטאזות . בזמינותם של ליגנדים חופשים

    IGFs-בעקבות חיתוך זה רמות ה. ים בעלי אפיניות נמוכה יותר לליגנדיםמקטע לIGFBP-החותכות את ה

    רמת ). LeRoith & Werner, 2001( ולשפעלו IGF-IR-ר לומאפשרים לליגנדים להיקש, החופשיים עולות

    . תלויה ברמת הורמון הגדילה, IGFs-שהוא חלבון הגדול ביותר ממשפחה זו והמשמש מאגר ל, IGFBP-3-ה

    4

  • IGF-תיאור סכמתי של מרכיבי מערכת ה -1איור

    וחלבוני ) IR- וIGF-IR ,IGF-IIR(הרצפטורים לליגנדים אלה , ואינסוליןIGF-I ,IGF-II: כוללת את הליגנדיםIGF-משפחת ה

    . דומה במבנהו לרצפטור לאינסוליןIGF-IRניתן להבחין כי . IGFsהקישור של

    : הנמצא בכתובתIGF Societyאיור זה מבוסס על סכמה המופיעה באתר האינטרנט של *

    html.overview/h/org.society-igf.www://http

    1.2. Insulin like growth factor I receptor

    הינו תוצר של גן יחיד המשתרע על פני , חומצות אמינו 1367בעל, אנושיIGF-IRהפרקורסור של

    הגן . (Ullrich et al., 1986) 15וממוקם בקצה הדיסטלי של כרומוזום , גנומיDNA של kb 100-למעלה מ

    untranslated region-’5- המקודדים ל1-3אקסונים : אקסונים המחולקים על פי החלוקה הבאה21מכיל

    (5' UTR) ,signal peptideולמתחם ה -N טרמינלי של תת יחידה α , מקודדים להמשך תת 4-10ואקסונים

    ר פרוטאוליזה באתר בשלות נוצרות בצורה ליניארית מהפרקורסור העובβ - וαשרשראות . αהיחידה

    אזור חוצה , הכוללת אזור חוץ תאי, βתת היחידה . 11הממוקם באקסון , ארגינין- ארגינין- ליזין-ארגינין

    תהליך ). 2Aאיור ( 21- 12מקודדת באמצעות אקסונים, ממברנה ואזור תוך תאי בעל פעילות טירוזין קינז

    נוצרים קשרים דיסולפידים , בהמשך. signal peptide-עיבוד הפרקורסור כולל גליקוזילציה וסילוק ה

    5

  • . בשלותβ - וαמתרחשות גליקוזילציות נוספות וחיתוך פרוטאוליטי שמניב תת יחידות , בפרורצפטור

    ). 2Bאיור (α-β-β-αההטרוטטרמר הבשל מסודר בקונפורמציה

    2A.

    NH2 COOH

    קבוצה αתת קבוצה βתת

    Signal Peptide

    Cysteine rich

    Proteolytic cleavage

    Transmembrane Tyrosine kinase

    2B.

    IR-IGF- תיאור סכמתי של הפרקורסור ל-2איור

    . IGF-IR-נה הפרקורסור ל מב-2Aאיור

    .α-β-β-α מבנה ההטרוטטרמרי של הרצפטור אשר מסודר בקונפורמציה -2Bאיור

    ובכמה רקמות מופיע פס נוסף אשר גודלו בערך kb 11-ברקמות הומניות הוא כmRNA IGF-IRגודלו של

    7 kb . במכרסמים מופיעmRNA 11 רק בגודל kb.

    המאופיין בפעילות , מופיעות בשלב עובריmRNA IGF-IRבדרך כלל רמות ביטוי גבוהות של

    רמות אלו יורדות לאחר הלידה ומגיעות לערך נמוך בתא בוגר אשר סיים את תהליך . חלוקה נמרצת

    . כמעט אינה ניתנת לזיהויIGF-IR mRNA-רמת ה, נמצא כי בכבד. (Werner et al., 1989)ההתמיינות

    6

  • ההסבר לכך נעוץ ככל הנראה בויסות . הגבוהה ביותר שהתגלתה בכבד היאIGF-Iרמת הביטוי של , מאידך

    . על ידי ייצור מקומי של הליגנדIGF-IR של (down regulation)שלילי

    גבוהה יותר IGF-I-זיקתו ל, )IGF-I, IGF-II( מסוגל לקשור את שני הליגנדים IGF-IR -על אף שה

    ). Sepp-Lorenzino, 1998(פיניות פחותה בהרבה וכן התברר כי הרצפטור אף יכול לקשור אינסולין אך בא

    והעברת האותותIR-IGF-מנגנון הפעלת ה .1.3

    חלה העברת α אל תת יחידה IGFs-לאחר קשירת ה. הינו בעל פעילות אלוסטריתIGF-I-הרצפטור ל

    הגורמת לשינוי קונפורמציה וזירחון עצמי של אזור , βסיגנל דרך ממברנת התא המובילה אל תת יחידה

    גם כן תורמת לזירחון עצמי , יצירת צברים של הרצפטור המתרחשים בעקבות קישור הליגנד. הטירוזין קינז

    בשלב הבא מתרחש זירחון של אזורים אחרים בתת יחידה . (Sepp-Lorenzino, 1998)באזור הטירוזין קינז

    βהעברת האותות המובילים לקישור וזירחון של סובסטרטים שונים בתא אשר משפעלים את מנגנוני

    ;PI3K-PKB/AKT) LeRoith et al, 1995- והRas-Raf-MAPK-במסלולים שונים כגון מסלול ה

    Dupont & LeRoith, 2001 .(

    ישנן מספר מחקרים המצביעים כי הפעלת הרצפטור בעזרת הליגנד שלו יכולה להוביל להפעלת מנגנונים

    התמיינות ואף , הפעלת מסלול אנטיאפופטי, עשויה לגרום לחלוקת התאיםIGF-IRהפעלת . שונים בתא

    קובעים , או זמינותם של סובסטרטים שונים\עבודות אלו הראו כיצד אזורים שונים ברצפטור ו. טרנספורמציה

    .(Baserga & Morrione, 1999; Baserga, 2000; Valentinis & Baserga, 2001)את גורל התא

    1.4. I Receptor-IGFומחזור התא

    . (Baserga & Rubin, 1993) במשך שנים רבות כהכרחי להתקדמות במחזור התא הוכרIGF-I-ה

    נדרשת להם , G1 יכנסו אל מחזור התא לשלב G0מחקרים שונים הראו כי בכדי שתאים הנמצאים בשלב

    (FGF (fibroblast growth factor- שונים כ(competence factors) מאפשריםנוכחותם של פקטורים

    , על מנת שהתאים יוכלו להמשיך להתקדם במחזור התא. (PDGF (platelet-derived growth factor-וכ

    7

  • progression(מקדמים יש צורך לספק להם פקטורים , "מתחלקים"ל" מתחלקים-לא"כלומר לעבור מתאים

    factors(כגון ה -IGF-Iוה -EGF (epidermal growth factor)) Hernandez-Sanchez et al., 1997;

    Baserga & Rubin, 1993; Rubin & Baserga, 1995; Baserga et al., 1997 .( התברר כיFGFו -

    PDGFמעוררים את ביטוי ה -IGF-Iוה -IGF-IRאספקת , וכאשר התא הופך קומפטנטיIGF-I בלבד דיה

    .על מנת להשלים את מחזור התא

    תאים : למתחלקים על פני ממברנת התאים מהווה גורם קריטי להפיכת התאים IGF-IR-מספר ה

    , יגדלו במדיום גידול בתוספת סרום, רצפטורים על פני התאים15,000-פיברובלסטים המבטאים פחות מ

    מסוגלים לגדול במדיום חסר סרום ובתוספת של IGF-I- אתרי קשירה ל22,000-בעוד שתאים המבטאים כ

    IGF-I .עובדה . ם שגשוג גם באגר רךאף עוברי, רצפטורים30,000-תאים אשר מבטאים מעל ל, יתרה מכך

    זו מרמזת כי ביטוי הרצפטורים עלולה לתרום לא רק לחלוקה נורמלית אלא גם ליכולת טרנספורמציית התאים

    (Rubini et al. 1997).

    1.5. I Receptor-IGFואפופטוזיס

    לא רק בזכות תפקידו המיטוגני אלא גם עקב היותו בעל , הינו מתווך הישרדות רב עוצמהIGF-IR-ה

    מתפקדים כגורמים אנטיאפופטוטים , בפרטIGF-IR- בכלל והIGF-מערכת ה. פעילות אנטיאפופטוטית חזקה

    או IGF-Iמתן , בשורת תאי מעי הומנית שהושרה בה אפופטוזיס, למשל. in vitro - וin vivoבמערכות

    וגדנים כנגד העובדה שנ. DNA-מנע את עיכוב גידול התאים ואת פרגמנטצית ה, ריכוז אינסולין גבוה

    מתווכת , או אינסוליןIGF-Iמרמזת על כך שהגנה מפני מוות תאי על ידי , חסמו מצב זהIGF-I-הרצפטור ל

    או EGFאך לא , PDGFובמידה פחותה יותר (IGF-I, כמו כן. (IGF-IR (Wu et al., 1995באמצעות

    FGF ( אשר בטאו ) ב אי אספקת סרוםעק(הגן מפני אפופטוזיס שהושרה על ידי הרעבת תאים פיברובלסטים

    etoposideבניסויים בהם השרו אפופטוזיס על ידי. (c-Myc (Harrington et al., 1994באופן מתמיד

    מנע את IGF-ΙR-אולם הרס מכוון של הגן ל, מנע מעט מוות תאי topoisomerase I, IGF-I)מעכב של (

    שבהן השתמשו באנטיסנס in vivoבמערכות . (Sell et al., 1995)לעצור את האפופטוזיס , IGF-I-יכולת ה

    8

  • ראו שקיימת התאמה בין רמת הרצפטורים המתבטאים על פני התאים לבין חיות , IGF-IR mRNA-כנגד ה

    ,.Resnicoff et al(ירד מספר הרצפטורים והיקף האפופטוזיס גדל , כשריכוז האנטיסנס עלה. התאים

    1995a; 1995b .(הפעלת ה-IGF-IRנעשת במספר מסלולים , להגנה מפני אפופטוזיס, ין היתרב, המובילה

    מסלולים . Raf/14.3.3- וPI3K ,MAPK: העברת האותות יכולה לזרום במסלולים שונים כגון . חלופיים

    אשר במצבו המזורחן אינו מסוגל לקשור חלבונים , BADאלו מתנקזים לבסוף לזירחון החלבון

    Peruzzi et( ועל כן הופך ללא פעיל בעידוד מוות תאי ,Bcl-XLכגון, Bcl2-אנטיאפופטוטים ממשפחת ה

    al., 1991.(

    1.6. I Receptor-IGFהתמרה סרטנית ו

    את IGF-IR-מעניקים ל, תפקיד הרצפטור כפקטור אנטיאפופטוטי בשילוב עם פעילותו כפקטור מיטוגני

    IGF-IR-את תרומתו של ה. (Baserga, 1994)היכולת הפוטנציאלית לגרום לטרנספורמציה

    שבהם , לטרנספורמציה ניתן לראות בניסוים שנעשו בשורת תאים פיברובלסטים שמקורם מעוברי עכברים

    סרטנית על ידי שימוש ותמרו הלאתאים אלו . על ידי רקומבינציה הומולוגיתIGF-I- הרצפטור לנפגע ביטוי

    SV40 large T antigen,bovine papillomavirus E5 protein, מופעלras: באונקוגנים שונים הכוללים

    , אולם החדרת הרצפטור הפונקציונלי לתאים הללו). Sell et al., 1993; Morrione et al, 1995(ועוד

    יש לציין כי קיימים , מאידך. השיבה את יכולתם לעבור התמרה סרטנית בעזרת האונקוגנים המוזכרים מעלה

    E7- וE6לדוגמא החדרה של חלבוני . IGF-IR-ת באונקוגנים המסוגלים לעודד טרנספורמציה גם ללא תלו

    human papillomavirus-16 יחדיו עודדה יצירת מושבות בתאים חסרי IGF-IR . יש לציין כי החדרת

    IGF-IRביטוי יתר של , בנוסף. (Steller et al., 1996) בנפרד לא השפיעה על התאיםE7- וE6חלבוני

    ,.Kaleko et al) סרטני אשר כלל יצירת גידולים בעכברי גרם לפנוטיפ, NIH3T3בפיברובלסטים מסוג

    1990) nude.

    מחקרים וניסוים קליניים אשר בוצעו במהלך העשרים שנה האחרונות רמזו כי תאים מותמרים מציגים

    גידולים אלו . IGF-IR mRNA על פני התאים ואף רמות גבוהות יותר של IGF-IRמספר רב יותר של

    9

  • מערכת ההמטופויטית וכליות , רבדומיוסרקומה, מעי, ערמונית, שחלה, גידולי שד,בין היתר, כוללים

    (Werner & LeRoith, 1996) . עליה בביטוי הרצפטור בסרטן משקפת חזרה של התאים לשלב נמוך יותר

    .בהתמיינות ובאונטוגנזה פרימיטיבית יותר

    IGF-IR שימוש באנטיסנס כנגד אוIGF-IR- החוסמים את הαIR3שימוש בנוגדנים ספציפיים כגון

    mRNA ,סרטן השד : מעכבת שגשוג של גידולי סרטן שונים כדוגמת(Neuenschwander et al., 1995) ,

    מלנומה , (El-Badry et al., 1989) גידולי נוירובלסטומה (McCubrey et al., 1991)גידולים המטופויטים

    (Furlanetto et al., 1993). נוסףפותח נוגדן, לאחרונה ,EM164 , החוסם את פעילות הרצפטור על ידי

    בשורות תאי סרטן הומני in vitroובעקבות כך גרם לעיכוב גדילה , הוספת ליגנדים או הפעלה על ידי סרום

    כאשר טיפול עם , in vivoהשפעת עיכוב הגדילה אף הוכחה . ערמונית ועוד, שחלה, מעי, ריאות, הכוללות שד

    . (SCID (Maloney et al., 2003י גדילה של סרטן הערמונית אשרו הושתל בעכברי הנוגדן זה הוביל לדיכו

    , IGF-IR טרמנלי של C- בקצה ה1245-1310ידוע כי נוכחות המקטע הממוקם בין שיירים , יתרה מזאת

    ).Baserga, 2000(הכרחי בכדי שרצפטור זה יהיה מעורב בטרנספורמציה

    IR-IGF-פרומוטר הגן ל .1.7

    הכרחי בכדי להבין את המנגנונים המולקולרים המבקרים את IGF-IR -הפרומוטר של הגן לאיפיון אזור

    או TATA box אך חסר מוטיבי C - וG עשיר בנוקליאוטידים IGF-IR-הפרומוטר ל. ביטויו של הרצפטור

    CAAT ,הדרושים בדרך כלל להתחלת שעתוק יעיל ברוב הגנים , שהם שני אזורי בקרה חשובים

    המכוון את נקודת תחילת ”Initiator“יחד עם זאת קיים באזור הפרומוטר אתר ייחודי המכונה . םהאאוקריוטי

    & Werner et al., 1990; Cooke et al., 1991; Mamula) (3איור (IGF-IR-השעתוק לגן ל

    Goldfine, 1992; Werner et al., 1992 .(שבדומה ל, מוטיב זה מופיע בפרומוטרים של גנים- IGF-IR,

    . מווסתים התמיינות והתפתחות

    bp (upstream 940, בחולדה(~ kb 1 ממוקם IGF-ΙR -נקודת התחלת השעתוק של הגן ההומני ל

    . זה הוא מהארוכים שתוארו עד היום בגנים אאוקריוטיםUTR-’5אזור . (ATG)לנקודת התחלת התרגום

    10

  • מעורב ביצירת מבנים שניוניים כמו מוטיב אם כי קיימים רמזים שהוא , תפקידו של מתחם זה אינו ברור דיו

    hairpin (Cooke et al., 1991) . מבניhairpinפקטורי : מדווחים לרוב בגנים המבקרים שגשוג תאי כגון

    .הרצפטורים שלהם ואונקוגנים שונים, גדילה

    מחולדהpromoter IR-IGFאיור סכמתי של - 3איור

    אתר תחילת ). לבן (flanking region ’5וכן ) מנוקד (UTR-’5, )שחור(ודד לחלבון האזור המק: באיור מתוארים שלושה אזורים

    החצים השחורים מציינים אתרי קישור , EGR/WT1-החץ השחור עם הנקודה מציין אתר קישור מוסכם ל. INR-השעתוק מסומן ב

    .SP1 - והחצים הלבנים הם אתרי קישור לEGR/WT1-פוטנציאלים ל

    promoter IR-IGF-ל הגורמים המשפיעים ע .1.7.1

    נקבעת על פי מאזן בין חלבוני , ובכל שלב התפתחותי, בכל רקמהIGF-IR-רמת הביטוי של הגן ל

    מכיל IGF-IR-מאחר והפרומוטר ל. מעכבים את ביטויו, ומאידך, המגרים מחד את שעתוק הגן, ויסות שונים

    Early growth- ומשפחת הSp1-ה: הוא מהווה אתר קישור למספר גורמי שעתוק כגון, רביםGCרצפי

    response genes (EGR) .

    Sp1המשפעל שעתוק מפרומוטרים התלויים ב, הינו חלבון גרעיני נפוץ-RNA polymerase II ,

    בעיקר לרצף השמור (GC נקשר לרצפים עשירים בנוקלאוטידים Sp1-ה. CAAT- וTATAשברובם חסרי

    5'-GGGCGG-3' .(קשירת החלבון ל-DNAבעוד שהפעלת השעתוק , ת בזכות שלוש אצבעות אבץ מתבצע

    11

  • חיוני להשגת רמות שעתוק משמעותיות Sp1-ה. מתאפשרת באמצעות אזור בחלבון העשיר בגלוטמין

    ,.Blake et al(על אף שאינו קובע את אתר תחילת השעתוק המדויק , CAAT - וTATAמפרומוטרים חסרי

    . ביטויו מבוקר כתלות במידת התמיינות התאים, מיוחד הינו בעל תפוצה רחבה בSp1-למרות ש). 1990

    בעוד שרמת ביטויו פוחתת בתאים אשר סיימו את , בתאים המתחלקים במהירות הינו רבSp1-ביטוי ה, כלומר

    היחסים הפיסיים והתפקודיים בין גורם שעתוק זה והפרומוטר של . (Saffer et al., 1991)התמיינותם

    אנדוגני Sp1שורת תאים זו חסרת . Drosophila Schneiderר בשורת תאי נבדקו בעבIGF-I-הרצפטור ל

    (Werner et al., 1992; Beitner-Johnson et al., 1995) . פעילות הפרומוטר הבזלית בתאים אלו הייתה

    . אקסוגניSp1 לערך באמצעות החדרתו של 500והוגברה פי , בהשוואה לפעילות תאי יונקים, נמוכה מאוד

    DNase I footprinting -ו, (Electrophoretic mobility shift assay (EMSAיזות בעזרת אנל

    ).3איור (IGF-IR בפרומוטר של Sp1זוהו מספר אתרי קשירה של

    הנקשרים ומפעילים פרומוטרים , אצבעות אבץ3-4 כוללת חלבונים גרעיניים בעלי EGR-משפחת ה

    קיימים מספר אונקוגנים אשר מנגנון פעולתם , ה מזאתיתר. המכילים רצפים שמורים המתאימים לקשירתם

    IGF-IR- משפעל את הפרומוטר לc-mybכך למשל נמצא כי הפרוטואונקוגן . IGF-IR-כולל שפעול הגן ל

    (Reiss et al., 1991; Travali et al., 1991) . כמו כן תוצר הגן שלhepatitis virus B מסוגל לעלות את

    פקטורי גדילה נוספים הידועים בהפעלת הפרומוטר . (IGF-IR mRNA (Kim et al., 1996-רמת ה

    ).FGF) Hernández-Sánchez et al., 1997- וה(PDGF (Rubini et al., 1994- הם הIGF-IR-ל

    , ואף יכול לגרום לטרנספורמציה, אנטיאפופטוטית, הוא בעל פעילות מיטוגניתIGF-IR-היות ו

    אשר (נשאלת השאלה כיצד תא בוגר , מספר הרצפטורים למידת שגשוג התאיםומאחר וקיים קשר ישיר בין

    מנגנון . וכתוצאה מכך להישאר במצב מנוחהIGF-IR-מצליח לדכא את ביטוי הגן ל) עבר התמיינות מלאה

    נמוכות מעורב במשפחה של פקטורים המכונים מדכאי IGF-IR-אפשרי אחד האחראי על שמירת רמות ה

    ההגיון העומד מאחורי מנגנון זה הינו העובדה כי במקרי סרטן הומניים . (Tumor Suppressors)גידול

    (Werner & Roberts, 2003)ניתן למצוא מדכאי גידול מוטנטים , IGF-IR-בהם יש ביטוי יתר של ה, רבים

    12

  • או WT1) Wilm's Tumor) כוללים חלבונים שונים כדוגמת החלבון IGF-IR-פקטורים המדכאים את ה .

    .p53לבון הח

    מסוגל לשפעל או לדכא , אשר נמצא מוטנטי בחלק גדול של גידולי הסרטן ההומנים, p53החלבון

    לרצפי קשירה שמורים בפרומוטרי p53 מערב קישור p53שפעול גנים על ידי . פעילות של מספר גנים

    , p53-רה ספציפי לשבפרומוטר שלו אין אתר קשי, p53דיכוי פעילות גן מסוים בעזרת , לעומת זאת. המטרה

    במקרה של . (TATA box binding protein (TBP) (Seto et al., 1992מתבצע על ידי קשירה לחלבון

    IGF-IR הוכח כי p53החדרת הפרומוטר של . מעכב את ביטוי הגן ברמת השעתוקIGF-IR עם כמויות

    מסוגל לדכא את p53ה למעש. הראתה עיכוב בפעילות הפרומוטר כתלות בכמותו, לתאיםp53עולות של

    מוטנטי לתאים הובילה לעליה בפעילות p53הוספת , מאידך. 90%-פעילות הפרומוטר לרצפטור עד לכ

    , IGF-I- הנגרם על ידי קישור הIRS-1- מסוגל לדכא את זירחון הרצפטור והp53, יתר על כן. הפרומוטר

    הצביעו על כך EMSAתוצאות אנליזת . (Ohlsson et al., 1998) מוטנטי מגביר את זירחונם p53-בעוד ש

    אינו נקשר ישירות אל אזור p53-ה, IGF-IRגם במקרה של , p53שבדומה לגנים אחרים המעוכבים על ידי

    ועל IGF-IR בפרומוטר של initiator- מסוגל להקשר אל אזור הTBP .TBPהפרומוטר אלא נקשר לחלבון

    חוסם את הפעלת השעתוק הנגרמת על ידי , ככל הנראה,קישור בין שני החלבונים הללו. ידי כך להפעילו

    TBP (Werner et al., 1996).

    הינו WT1. המכיל ארבע אצבעות אבץkDa 52-54 הינו חלבון גרעיני במשקל של WT1החלבון

    Wilm’s או מוטציה בו מעורבים באתיולוגיה של שלואשר חסר, גורם שעתוק הספציפי לסוגי תאים מסוימים

    Tumor) וכן של נפרופתיות דומות ) ן כליות בילדיםסרט)Rauscher, 1993 .(WT1 אומנם שייך למשפחת

    החלבון , כפי שמצוין מעלה, אך בניגוד לשאר חברי המשפחה אשר גורמים להפעלת הפרומוטר, EGR-ה

    WT1עדות לכך התקבלה הודות לניסויים בהם נמצאה התאמה בין ירידה בשגשוג . מדכא את הפעלת הגן

    ירידה ביכולת , ירידה בפעילות הפרומוטר, IGF-IR mRNA- לבין ירידה ברמות הWT1 המכילים תאים

    ,.Werner et al ( וגדילה שאינה תלויה בעיגון התאים למצע IGF-Iהתאים לעבור שגשוג עקב גירוי על ידי

    (1993; Werner et al., 1995 .ממצאים אלו רמזו כי הפרומוטר ל-IGF-IR ל משמש אתר מטרה-WT1

    13

  • DNaseI- וEMSAכגון שימוש באנליזות. `GCGGGGGCG-3-`5המזהה את הרצף השמור

    footprinting סייעו למפות אתרי קשירה של WT1ביניהם , לפרומוטרים של גנים שוניםIGF-IR

    (Werner et al., 1994) .

    , נמוך ביותר בין היתרIGF-I-ביטוי הרצפטור ל, מיטוטי-שבתא הבוגר הפוסט, לסכם ולומר, אם כן, ניתן

    אירוע (מעכבי גידול הנושאים מוטציות . שוניםמדכאי גידולכתוצאה מדיכוי הפרומוטר על ידי צורות בר של

    כתוצאה מכך . -IGFפגומים ביכולתם לדכא את הפרומוטר לרצפטור ל) שמקושר בדרך כלל עם ממאירות

    מיצור מקומי או IGFsיטוגנית גדלה על ידי ישנו ריכוז מוגבר של רצפטורים על פני התא והפעילות המ

    באתיולוגיה IGF-IR-את מעורבותו של ה, לפחות בצורה חלקית, פרדיגמה זו יכולה להסביר. ממחזור הדם

    שאלה חשובה שעדיין לא מצאה מענה הינה איזה גורמי שעתוק משתתפים בוויסות הגן . של גידולים שונים

    . בסרטן שדIGF-IR-ל

    IGF-טן השד ומערכת ההקשר שבין סר .1.8

    אחראים על התפתחות השד , בשיתוף עם אסטרוגן, הורמון הגדילה המופרש מבלוטת ההיפופיזה

    , בבלוטות השד IGF-I mRNA התברר כי הורמון הגדילה גורם ליצירת. ומורפוגנזה של צינוריות השד

    באים לידי IGF- הלמעשה כל מרכיבי מערכת. (Kleinberg, 1998)המסייע בין היתר להתפתחות השד

    :כפי שמפורט) Moschos & Mantzoros, 2002; Werner & LeRoith, 1997(ביטוי בגידולי סרטן השד

    , הממוקמים בסמיכות לתאי סרטן השד(stroma)מופרש מתאי הסטרומה , המופיע בסרוםIGF-I-ה

    . IGF-I mRNA-וכן בפיברובלסטים שנלקחו מביופסיות שאינן ממאירות שגם בהם ניתן להבחין ב

    השפעת , ככל הנראה, לכן. הינם נדיריםIGF-Iשורות של תאי סרטן שד המבטאים ביתר , מאידך

    ביר את יש את היכולת להג IGF-I-לכיום ברור כי . הינה פרקרינית ואנדוקריניתIGF-Iהליגנד

    . המיטוגניות של גידולי סרטן שד

    14

  • אך יחד עם זאת , ים הסמוכים למקום הגידול אותר גם בתאי סרטן השד וגם בפיברובלסטIGF-II-ה

    . השפעה אנדוקרינית של ליגנד זה, עד כה, לא זוהתה

    אשר מתבטאים על , IGF-I- מתווכת באמצעות הרצפטורים לIGFs-רוב הפעילות המיטוגנית של ה

    מתבטא ברמות גבוהות יותר בתאי סרטן השד לעומת תאים IGF-IR-ה. פני תאי האפיתל המתחלקים

    . ליםנורמ

    תורמים למניעת IGFBP-5- וIGFBP-4, לדוגמא. חלבוני הקישור מעורבים גם בגידולי סרטן השד

    מעכב את גדילת תאי הסרטן וזאת על ידי קישור IGFBP-3-לעומתם ה. אפופטוזיס של תאי הסרטן

    IGF-Iיחד עם זאת נמצא כי רמות . וכן על ידי קישור ישיר לרצפטוריםIGFBP-3 נמוכות יותר

    . חולות סרטן השדב

    על ידי נוגדנים כנגדו עיכבה IGF-IR-בניסויים אשר נעשו בשורות תאי סרטן השד נמצא כי חסימת ה

    ממצא זה מצביע . (Arteaga & Osborne, 1989; Arteaga et al., 1989)בצורה ניכרת את שגשוג התאים

    .IGF-I-על כך שיכולת חלוקת תאי סרטן השד תלויה בתפקודו של הרצפטור ל

    IGF-I-מחקרים אפידמיולוגים אשר התבצעו לפני מספר שנים מרמזים על קשר חיובי בין ריכוז ה

    IGFBP-3- והIGF-I-נבדקו רמות ה, באחד המחקרים. במחזור הדם לבין עליה בסיכון לפתח סרטן השד

    חודשים לפני 28הבדיקות נערכן בממוצע ( מקרי סרטן שד שאומתו 397שמתוכן נתגלו , נשים121,700-ב

    בשליש העליון 4.6 היה פי 50הסיכון היחסי לסרטן שד בנשים לפני גיל הבלות ומתחת לגיל ). הדיאגנוזה

    בחישובים עלה הסיכון IGFBP-3-כאשר שוקללו גם ערכי ה. ביחס לנשים בשליש התחתוןIGF-I-בערכי ה

    על IGF-IR-ך שהגברה בהפעלת הנתונים אלה מצביעים על כ). Hankinson et al., 1998 (7.3-היחסי ל

    ממצעים אלו רומזים כי , יתרה מזאת. עלול להיות שלב מכריע בהתפתחות סרטן שד, המצוי בסרוםIGF-Iידי

    IGF-I/IGFBP-3עשויים לשמש פקטורים פוטנציאלים לניבוי סרטן שד .

    אשר הניבו , כסמן אבחוני בסרטן שד נחקר על ידי מספר קבוצותIGF-IR-המשמעות של ביטוי ה

    Happerfield et (93%-39%הערכת ביטוי הרצפטור בגידולי סרטן שד הומניים נע בין . תוצאות סותרות

    (al., 1997 .לעומתם היו , מספר חוקרים טענו כי רמות ביטוי גבוהות מעידות על הישנות מוקדמת של המחלה

    15

  • Surmacz, 2000; Turner et (גבוהות מצביעות על תחזית טובה יותר למחלהIGF-IR שסברו כי רמות

    al., 1997; Yee, 1994; Lee et al., 1998; Papa et al., 1993; Peyrat et al., 1992; Lee et al.,

    מבחירה שונה של חולים ושימוש בשיטות , ככל הנראה, השוני בתוצאות המחקרים הללו נובע). 1999

    מתבטאים ברמות גבוהות IRS-I-וIGF-IR לאחרונה התפרסם מחקר אשר סבר כי . אנאליטיות שונות

    בעוד שרמות ביטוי נמוכות של , ברקמות שד בריאות ובקרצינומות בדרגת התמיינות מתונה או מלאה

    זאת בניגוד לרצפטור לאינסולין אשר לא הראה . קיימות בגידולי שד מתקדמיםIRS-I- וIGF-I-הרצפטור ל

    ניתוח סטטיסטי של התוצאות הראה כי , תר על כןי. התאמה משמעותית לרמת ההתמיינות של הגידולים

    עם התקדמות הגידול חזקה יותר מההתאמה הקיימת בין איבוד IRS-I-והIGF-IR -ההתאמה בין ירידת ה

    IGF-IRעל כן המליצו החוקרים כי . ביטוי הרצפטור לאסטרוגן או עליה בחלוקה תאית עם התקדמות המחלה

    .(Schnarr et al., 2000)לקביעת דרגת הגידול יכולים לשמש כסמנים חדשים IRS-I-ו

    התקבל ממחקר שנעשה לאחרונה אשר רמז כי התפתחות , לסרטן שדIGF-IRעדות נוספת לקשר שבין

    אשר משמש לטיפול כנגד HER2/NEU-נוגדן מונוקלונלי כנגד החלק החוץ תאי של ה(עמידות להרצפטין

    .(IGF-IR (Lu et al., 2001והות של קשורה עם רמות גב) ERBB2סרטן שד המבטא ביתר

    1.9. 1BRCA ,גן המקנה רגישות לסרטן השד והשחלה .

    אחת מכל תשע נשים עלולה לפתח , לפי מחקרים אפידמיולוגים שונים נמצא כי במדינות העולם המערבי

    מגידולי סרטן השד הם Alberg & Helzlsouer,1997; Brody & Biesecker, 1998) .90%)סרטן שד

    הנותרים הם germline) .5% - 10%)ומאובחנים בנשים ללא מוטציות בתאי נבט ) ספורדים(ים אקראי

    נשים . BRCA2- וBRCA1, הידועים כמדכאי גידול, לפחות, תורשתיים ונגרמים על ידי מוטציות בשני גנים

    תח לפ, באופן משמעותי, הן בעלות סיכון גבוהBRCA2 או BRCA1אשר קבלו בתורשה גן מוטנטי של

    סיכון 10%לעומת , 70 לפתח סרטן שד עד גיל 87%נשים אלו הן בעלות סיכון של . סרטן שד במהלך חייהן

    מוטציות תורשתיות בגנים אלו מעלות את הסיכון של הנשים הנושאות , בנוסף על כך. באוכלוסייה הכללית

    ולעיתים קרובות אף 50גיל לפתח סרטן שד לפני 59%עם סיכוי של , אותן לפתח סרטן שד לפני גיל הבלות

    16

  • 44%- ב70 מגבירות את הסיכון לפתח סרטן שחלה עד גיל BRCA1מוטציות בגן , כמו כן. 40לפני גיל

    מעלה את BRCA1-נוכחות מוטציות בגן ל, יתרה מזאת. באוכלוסייה הכללית1%-לעומת סיכון של פחות מ

    . (Tavtigian et al., 1996a)ערמונית בגברים וסרטן בלוטת ה, בשני המינים, הסיכון להתפתחות סרטן המעי

    כלומר תורשה של אלל מוטנטי אחד , הם בעלי תורשה אוטוזומלית דומיננטיתBRCA2- וBRCA1הגנים

    . מעלה את הסיכון של הפרט לפתח סרטן

    , בהתאמה, חומצות אמינו3418- וכ1863- מכילים כBRCA2- וBRCA1החלבונים ההומניים של

    בהתייחס לשוני הקיים ברצף . (Miki et al., 1994; Tavtigian et al., 1996b)צף ואינם דומים בר

    ~ 80Kb-שני הגנים גדולים ומשתרעים על כ: אזי ההקבלה הגנומית ביניהם מפתיעה, הראשוני בין שני הגנים

    מהחלבון 50%-המקודדים למעלה מ, הגנומי ושניהם מכילים אקסונים אמצעים ארוכים במיוחדDNA-מה

    (Welcsh et al., 2000).

    Miki( ושובט ארבע שנים מאוחר יותר (Hall et al., 1990)1990 מופה בשנת BRCA1-הגן ל

    et al.,1994 .(ממקרי סרטן שד ~ 90%-ממקרי סרטן שד תורשתיים ול~ 50%-מוטציות בגן זה גורמות ל

    נמצא כי קיים קשר בין כמו כן, ;Paterson, 1996) (Alberg & Helzlsouer,1997ושחלה משפחתיים

    . לבין סרטן החצוצרותBRCA1-מוטציות ב

    מוטציות בגן זה גורמות למחצית . ושובט שנה מאוחר יותר1994 מופה בשנת BRCA2-הגן ל

    ;Wooster et al., 1994)הנוספת ממקרי סרטן שד תורשתיים בנשים ולמרבית מקרי סרטן שד בגברים

    , בקיבה, וטציות בגן זה מקושרות עם סיכון גבוה יותר לפתח סרטן בלבלבכמו כן ישנם דיווחים כי מ. (1995

    . במעי ובבלוטת הערמונית

    לבין אלו הקשורים BRCA1-למעשה ישנם הבדלים בהתפתחות גידולי הסרטן הקשורים למוטציות בגן ל

    ול והשפעת הגיל בו אובחן הגיד, סיכון התלוי במין החולה: ההבדלים הללו כוללים. BRCA2-למוטציות ב

    נשאי מוטציות בגן , BRCA1-בהשוואה לנשאי מוטציות בגן ל. גורמים גנטיים על הסיכון לחלות בסרטן

    בעלי חדירות נמוכה יותר אך בסיכון לפתח סוגים רבים יותר , לוקים במחלה בגיל מאוחר יותרBRCA2-ל

    .(Moynahan, 2002)של גידולים בנשים ובגברים כאחד

    17

  • 1.10. 1BRCA ,רשתי ודיכוי גידול סרטן תו

    תואמת לתאוריית " התנהגותו"מאחר ו) tumor suppressor( מוגדר כמדכא גידול BRCA1החלבון

    two-hit hypothesis of carcinogenesis (Knudson,1996) אשר גורסת כי מוטציה באלל אחד של גן

    כאשר האלל . הטרוזיגוטיתאלא יוצרת מצב של מוטציה , המוגדר מדכא גידול אינה גורמת להתפתחות סרטן

    העלול להוביל להתפתחות גידול (loss of heterozygosity)קיים איבוד ההטרוזיגוטיות , השני נפגע או חסר

    מצב של איבוד . זאת בניגוד לאונקוגן אשר מוטציה באלל אחד מספיקה בכדי לגרום להתפתחות גידול. סרטני

    סביר שבלידה תאי החולה . ות בגידולי סרטן משפחתיים מתרחש לעיתים קרובBRCA1-ההטרוזיגוטיות בגן ל

    . (in utero) הינו לתלי ברחם BRCA1הכילו אלל תקין ואלל מוטנטי וזאת כיוון שחסר הומוזיגוטי של הגן

    איבוד האלל התקין יכול להתרחש בתאים שונים מאשר תאי . בעקבות איבוד האלל התקין התפתח גידול סרטני

    הינו חלבון BRCA1. אך רק רקמות אלו רגישות להתפתחות סרטן במסלול זה,האפיתל של השד והשחלה

    ,Brody & Biesecker)בעל תפוצה רחבה ועל כן הסיבה לספציפיות של הגידולים הללו עדין לא ידועה

    התמקד בחלוקה הנמרצת של תאים אלו , הסבר אחד שהוצע להתפתחות סרטן דווקא בתאי שד ושחלה. (1997

    חוקרים אלו הציעו כי . (Welcsh & King, 2001)ורמון אסטרוגן במהלך גיל ההתבגרות עקב הפרשת הה

    למרות שמנגנוני . תאי השד והשחלה מתחלקים במהירות, עקב עלייה בביטוי האסטרוגן, במהלך ההתבגרות

    . BRCA1יתכן ומוטציה נוספת מתרחשת באלל התקין של , התיקון של הגדילים המסונתזים פועלים נמרצות

    וכן רצפים חוזרניים Alu של רצפי 42%- מכיל כBRCA1-כיוון שהגן ל, הסבירות למצב זה אינה נמוכה

    אינם BRCA1-רוב התאים אשר נפגעו בשני עותקי ה. על היווצרות מוטציה נוספת" מקלים"נוספים ה

    יש BRCA1-ל, יחד עם זאת. ועל כן מתים במחזור התא הבאDNA-מצליחים לתקן את הנזק הקיים ב

    - עלולים לגרום לפגיעות באזורים שונים בBRCA1-null ולכן היווצרות תאי DNAתפקיד בתיקון נזקי

    DNAהתאים הללו עלולים להמשיך להתחלק . ביניהם פגיעה בגנים המקודדים לחלבוני בקרה במחזור התא

    של (checkpoint)החומקים מנקודת הביקורת " לא מתוקנים"חלוקה מואצת ולאפשר המשך קיום של תאים

    שהרי אם במהלך . הסבר זה נתמך גם בעובדה כי סרטן שד ושחלה תורשתיים חלים בגיל צעיר. מחזור התא

    בזמן שקיימת מוטציה תורשתית ( BRCA1 חלה מוטציה באלל התקין של, חלוקה נמרצת של תאי שד ושחלה

    18

  • סרטני עלול להתפתח בשלב מוקדם אזי גידול , חלה גם מוטציה נוספת בחלבון בקרהכןו) קריטית באלל השני

    . בחיים

    מבטאים רמות נמוכות של הרצפטור , BRCA1-ניתן לציין כי גידולים הנגרמים עקב מוטציות בגן ל

    Loman et al., 1998; Lakhani et(לאסטרוגן מאשר בגידולים המתפתחים עקב גורמים תורשתיים אחרים

    al., 2002 .(

    כמדכא גידול התקבלו בניסוים אשר הראו כי החדרת BRCA1 של עדויות נוספות התומכות בתפקידו

    BRCA1) אך , הובילה לעצירת גדילה של מספר שורות תאי סרטן שד ושחלה) על ידי שימוש ברטרווירוס

    antisenseהחדרת , יתר על כן. (Holt et al., 1996)לא מנעה גדילה של שורות תאי סרטן המעי או הריאות

    oligonucleotidesנגד כBRCA1 mRNA הובילה להאצת גדילה של תאי שד נורמלים וסרטנים ועודדה

    כל הממצאים הללו תומכים בהשערה שהגן . (NIH3T3 (Thompson et al., 1995טרנספורמציה של תאי

    , ואשר משתנה, הפעיל ברקמת האפיתל של שד ושחלה נורמליםtumor suppressor מהווה BRCA1-ל

    . ידולי שד ושחלהמופחת או חסר במספר ג

    1.11. 1ACBRוסרטן שד ספורדי

    . (Khoo et al., 1999) הן נדירות ביותר בגידולי שד ספורדים BRCA1-מוטציות סומטיות בגן ל

    , (Xu et al., 1997) לרוב נמוכות בעקבות שחבור חילופי שונה BRCA1בגידולים אלו רמות החלבון של

    או פגם במיקום , (Rice et al., 1998; Bianco et al., 2000; Esteller et al., 2000)מתילציה משובשת

    , כשלון בבקרת השעתוק על ידי הרצפטור לאסטרוגן. (BRCA1 (Chen et al., 1995-התאי של חלבון ה

    . (BRCA1 mRNA (Sourvinos & Spandidos, 1998יכול גם כן להיות אחראי על רמות נמוכות של

    ירידה בביטוי לרוב עקב נובעות, נמוכותBRCA1רמות , בסרטן ספורדי, תהא הסיבה אשר תהא

    . הגן ולא כתוצאה מאיבוד פעילות של שני האללים

    19

  • ותפקידו1BRCA-מבנה ה .1.12

    80Kb DNA~ אקסונים הפזורים לאורך 24- ומורכב מ17q21 ממוקם בכרומוזום BRCA1הגן

    ובעל שני אזורים , מצות אמינו חו1863 המכיל kDa 220מסגרת הקריאה מקודדת לחלבון במשקל . הגנומי

    המורכב משבע שיירי ציסטאין (RINGאחד מהם ממוקם בקצה האמיני ומכיל מוטיב של ). 4איור (שמורים

    . או חלבוןDNA, RNA: הידוע ביכולתו לקשור מולקולות כגון) ושיירי היסטידין הקושרות שני יוני אבץ

    BRCT (BRCA1יירים חומציים ומכיל שני אתרי האזור השמור השני מופה לקצה הקרבוקסילי העשיר בש

    C-terminal) המקנים פעילות של שפעול שעתוק (Chapman & Verma, 1996) . שני אזורים אלו מהווים

    11מקודד על ידי אקסון ) 60%-כ (BRCA1-החלק העיקרי של ה). חומצות אמינו300(חלק קטן מהחלבון

    תחילה נחשב מוטיב . אשר ממקמים את החלבון בגרעיןnuclear localization signalsהמכיל שלושה אתרי

    עקב הדמיון המשמעותי למוטיב אצבעות האבץ DNA- לאתר קשירה פוטנציאלי לBRCA1- של הRING-ה

    (zinc finger) ,הידועים כמוטיבים אשר מאפשרים קישור ל-DNA (Lovering et al., 1993) . בדיקות

    מסוגל BRCA1לאחרונה התברר כי . (Meza et al., 1999)אינה נכונה ישירות נוספות גילו כי הנחה זו

    כמו כן נמצא כי הוא יכול להקשר למבנה מסועף של . אך באופן בלתי ספציפי לרצף, DNA-להיקשר ל

    DNA ולמולקולות DNA ארוכות (Paull et al., 2001).

    . חלבון-ת ליצור קשרי חלבון הינה היכולRING-אפשרות נוספת שיוחסה לאזור ה, כפי שציינתי קודם

    : מסוגל להיקשר לחלבונים נוספים כגוןBRCA1אפשרות זו נמצאה נכונה כיוון שנמצא כי החלבון

    BARD1ו -BAP1 .BARD1 (BRCA1-associated RING domain protein)הינו חלבון אשר ,

    BRCA1-ל ה טרמינלי ובעזרת אתר זה נקשר אN- בקצה הRINGמכיל אזור של , BRCA1-בדומה ל

    הוא ככל הנראה להיקשר לפקטור הפוליאדנילציהBARD1תפקידו של החלבון ). ומכאן שמו של החלבון(

    CstF-50 (cleavage stimulation factor) ועל ידי כך לעכב הוספת זנב של Poly A . יתכן כי הסיבה לכך

    & DNA) Kleimanן באתר תיקו, RNA-במהלך תהליך עיבוד ה, לא תקיןRNAהיא למנוע היווצרות

    Manley, 1999 .( תפקיד נוסף שיוחס לקישור ביןBRCA1 לבין BARD1 הינו הגברת פעילותו של

    BRCA1 בהוספת מולקולות יוביקוויטין (ubiqutin)תהליך זה מוביל להוספת שרשרת של . עצמית

    20

  • בניגוד להוספת (DNAקי התורמת לפעילויות שונות ביניהם מעורבות בתיקון נז63יוביקווטין לליזין בעמדה

    ,.Xia et al) ( שמובילה לפירוק החלבון על ידי מערכת הפרוטאוזום48שרשרת יוביקווטין לליזין בעמדה

    חלבון זה . BRCA1 בחלבון RING- לאזור הBAP1קיימת עדות לקישור של החלבון , לעומת זאת) 2002

    .(Jensen et al., 1998)מתפקד כהידרולאז של מולקולות יוביקוויטין

    NH2

    RING D Nuc als BRC T)omain lear Localization Sign A1 C-Terminal Domain (BRC

    COOH

    1BRCAאיור סכמתי של החלבון - 4איור

    הסיגנל למיקום בגרעין אשר נמצא , טרמינלי של החלבוןN- הממוקם בקצה הRING-ה: כולל שלושה אזוריםBRCA1חלבון

    .BRCA1 טרמינלי ותורם לשפעול שעתוק על ידי C- הממוקם בקצה הBRCT-בחלק המרכזי של החלבון וה

    וא בעל תפקיד חשוב בהתפתחות והתמיינות של השד וביטויו מושרה בזמן הBRCA1חלבון

    זאת בניגוד לתאי שריר או עצב אשר בהם חלבון זה מתבטא גם כן בכמויות , הבגרות המינית ובזמן הריון

    ממצאים אלו עולים בקנה אחד עם העובדה . אך אינו הכרחי להתפתחותם והתמיינותם של רקמות אלו, גבוהות

    Marquis et al., 1995; Kubista( גורמות להתפתחות גידולי סרטן שד ושחלה BRCA1-ות בגן לכי מוטצי

    et al., 2002 .( מוטציות בגן זה נפוצות במיוחד במשפחות בהן יש מקרים רבים של הופעת סרטן שד בגילאים

    רוב . BRCA1- מוטציות שונות בגן ל460-עד כה זוהו מעל ל. (Futreal et al., 1994)צעירים מאד

    במסגרת הקריאה המוביל ליצירת frameshiftבסיס הגורם ליצירת המוטציות הם הוספה או השמטה של

    תוארה כבעלת שכיחות של , 185delAG, מוטציה ייחודית אחת. (Sorlie et al., 1998)חלבונים קטומים

    בעלת סיכון גבוה לפתח לפיכך אחת ממאה נשים יהודיות אשכנזיות היא. בנשים יהודיות אשכנזיות~ 0.9%

    קיים בכמויות גדולות BRCA1 ישנם מחקרים שהראו כי . (Struewing et al., 1995)או שחלה /סרטן שד ו

    . בעוד שבשורות תאים לא ממאירים החלבון ממוקם בגרעין, בעיקר בציטופלסמה בשורות תאי סרטן שד

    21

  • מעורב בפתוגנזה של סרטני שד BRCA1תוצאות אלו מרמזות כי יתכן שהשינוי בתפוצה התוך תאית של

    .(Chen et al., 1995)ספורדים או משפחתיים , רבים

    ניסו חוקרים רבים לקבל רמזים בעזרת הסתכלות על , אינו ברורBRCA1מאחר ותפקידו של

    :BRCA1להלן מספר תפקידים שיוחסו לחלבון . מבנהו והקשר בינו לחלבונים אחרים

    1.12.1. 1BRCA ומנגנוני תיקון נזקי NAD

    עלולים להוביל ליצירת שברים בשני DNAחשיפת תאים לקרינה מייננת או לחומרים גורמי נזקי

    יש , כאשר לתא נגרם נזק מסוג זה. (Double Strand Breaks (DSBsשברים אלו מכונים . הגדילים

    (nonhomologous end-joining (NHEJ: ביכולתו להפעיל את שני מנגנוני תיקון הבאים

    .(homologous recombination (HR-ו

    במקרה של פגיעה . הינו תהליך מהיר ומדויק למדי במידה ולא חלה פגיעה בקצוות- NHEJ-מנגנון ה

    תיקון כזה . יכולים תאי היונקים לאחות את השברים על חשבון יצירת חסרים קטנים, בבסיס או בנוקלאוטידים

    מנגנון זה חשוב גם בתיקון ). לפני יצירת הנזקDNA-רצף ה(המקורי DNA-מועד לטעויות ביחס לרצף ה

    . (Jasin, 2002) וביצירת נוגדניםT של הרצפטור בתאי V(D)Jשברים הנוצרים במהלך רקומבינציות

    הינו תהליך מדויק מאד המבוסס על רקומבינציה הומולוגית בין כרומטידות אחיות – HR-מנגנון ה

    .DNA-שקיימות רק בשכפול ה

    אשר מוטציה בו (ATMמופעל החלבון , הגורם לשבירת שני הגדיליםDNA-חל נזק ב כאשר

    BRCA1המתפקד כקינז ומזרחן את החלבון ) Ataxia telangiectasia-גורמת להתפתחות מחלת ה

    (Cortez et al., 1999) .לאחר הזירחון נפרד ה-BRCA1 מהחלבון CtIPהקשור אליו .CtIP הינו חלבון

    . (Li et al., 1999) שתפקידו דיכוי שעתוק CtBPאך הוא מצוי באסוציציה עם החלבון , קידו אינו ידועשתפ

    כדוגמת , DNA לשפעל גנים אשר מסייעים בתיקון BRCA1- מאפשר לCtIP- מBRCA1יתכן כי שחרור

    . BRCA1 אשר ביטויו עולה עקב ביטוי יתר של GADD45הגן

    הוא יצירת קומפלקס יציב של החלבונים, BRCA1- התהליך נוסף המתרחש לאחר זירחון

    BRCA1-RAD51-BRCA2 הפועלים יחדיו להפעלת מנגנון תיקון מסוג HR .למעשה ,BRCA1 לא רק

    22

  • במחזור התא Sשמתבטא בפזת , אלא שניהם אף ממוקמים יחדיו במבנה תוך גרעיניRAD51נקשר לחלבון

    קיים הומולוג RAD51לחלבון . DNA- באזור שעתוק ה,DNAאו המופיע לאחר טיפול בחומרים גורמי נזקי

    ,.DNA) Scully et al הפועל במסלולי רקומבינציה הומולוגית ותיקון נזקי (RecA)בשמרים ובחיידקים

    1997a; 1997b; Chen et al., 1999 .(כאשר נוצר נזק ב-DNAכאשר , או לחילופין, אשר לא ניתן לתקנו

    המוביל להפעלת מסלולי עצירת גידול התאים p53מופעל החלבון , פלקסחלה מוטציה באחד ממרכיבי הקומ

    . (Brugarolas & Jacks, 1997)או אפופטוזיס

    ומורכב MRN מסוגל אף להיקשר לקומפלקס חלבונים נוסף המכונה BRCA1התברר כי

    HR- הן במנגנון הDNAקומפלקס חלבונים זה מעורב בתיקון נזקי . MRE11/RAD50/NBS1מהחלבונים

    ;Zhong et al., 1997( בעקבות רקומבינציה מיוטית DNA וכן פועל בתיקון נזקי NHEJ-והן במנגנון ה

    Haber, 1998; Haber, 2000.(

    יש תפקיד חשוב במנגנוני תיקון שברים BRCA1-על סמך הממצאים הללו התפתחה ההנחה כי ל

    פגומים , BRCA1 knockout גזע של עכברי חיזוקים להנחה זו התגלו בניסויים אשר הראו כי תאי. DNA-ב

    ביטוי , יתרה מזאת. (Moynahan et al., 1999) על ידי רקומבינציה הומולוגית DNAביכולתם לתקן שברי

    , )הפגועים בחלקים שונים בחלבון( מוטנטים BRCA1אך לא של חלבוני , wild type BRCA1של חלבוני

    ,.DSBs) Scully et al-ולהעלות את יעילות התיקון של היכולים להוריד את הרגישות לקרינה מייננת

    1999 .(

    (MSH MSH2, MSH3- אף יכול להקשר לחלבונים ממשפחת הBRCA1נמצא כי , בנוסף

    המתרחשים (mismatch) על בסיס אי התאמה DNA-חלבונים אלו מעורבים בתיקון נזקים ב. MSH6)-ו

    .(Wang et al., 2000)וצרים במהלך תיקון שברים דו גדילים או נDNA-באופן ספונטני במהלך שכפול ה

    בשילוב עם BRCA1קבוצת חוקרים זיהתה קומפלקס גדול של חלבונים המכיל את , זאת ועוד

    בעלי תפקידים שונים כדוגמת מדכאי גידול וחלבונים המסייעים , קבוצה של חמישה עשר חלבונים לפחות

    . (BRCA1-Associated genome Surveillance Complex (BASC אשר נקרא DNAבתיקון נזקי

    ממצא זה מרמז כי . DNA או נזקי DNA-לכל מרכיבי הקומפלקס יש תפקיד בזיהוי מבנה לא תקין של ה

    23

  • משמש כרכז של פעילויות BRCA1החוקרים הציעו כי . DNA מתפקדים כחיישנים לנזקי BASCחלבוני

    DNA ובעל תפקיד מרכזי בתיקון DNA-הלך שכפול הרבות הנדרשות לשמירה על יציבות גנומית במ

    Wang et al., 2000).(

    בעקבות חשיפת תאים , BRCA1-במחקר שהתפרסם לאחרונה נמצא כי חל זירחון שונה ב, לבסוף

    . וזאת כתלות בשלב בו נמצא התא במחזור התא ובמידת הנזק הנגרמת לו, UVלקרינה מייננת או לקרינת

    . (Okada & Ouchi, 2003) מיקום החלבון ופעילותו השוני בזירחון משפיע על

    1.12.2. 1BRCAוהבקרה על מחזור התא

    : והבקרה על מחזור התא התבסס על מספר ממצאיםBRCA1הקשר בין

    , CDC2-ה, E2F-ה: לחלבונים המעורבים במחזור התא כגוןBRCA1קיים קשר בין החלבון

    .(Wang et al., 1999)והציקלינים

    ועל כן G1/S המאוחרת ומגיעות לשיא לאחר המעבר בין G1 עולות בפזת BRCA1-רמות ביטוי ה

    .(G1/S (Vaughn at el., 1996 פעיל בנקודת הביקורת BRCA1יתכן כי

    מזורחן -לעומת מצב היפו, S המאוחרת ופזת G1מזורחן במהלך פזת - הופך היפרBRCA1חלבון

    .(M (Ruffner & Verma, 1997החל לאחר פזת

    BRCA