833 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2013

PATOGENISITAS BAKTERI Vibrio harveyi YANG DIISOLASI DARI LOKASI BERBEDA

Ince Ayu Khairana Kadriah, Endang Susianingsih, dan Koko KurniawanBalai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Payau

Jl. Makmur Dg. Sitakka No. 129, Maros 90512, Sulawesi SelatanE-mail: inceayu@gmail.com

ABSTRAK

Penelitian dengan tujuan untuk mengetahui tingkat patogenisitas bakteri Vibrio harveyi yang diisolasi darilokasi berbeda telah dilakukan di Laboratorium Basah Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya AirPayau (BPPBAP). Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) pola faktorial masing-masingdengan perlakuan: tiga isolat bakteri Vibrio harveyi yang diisolasi dari tiga lokasi yang berbeda yaitu dariBanyuwangi dengan kode isolat-1; dari Negara, Bali dengan kode isolat-2; dan dari Gondol, Bali dengankode isolat-3. Hewan uji yang digunakan berupa post larva udang windu PL-14 yang ditempatkan dalamstoples volume 2 L dengan kepadatan 20 ekor/L. Konsentrasi bakteri yang dinfeksikan adalah 107 CFU/mL,105 CFU/mL, dan 103 CFU/mL. Tingkat patogenisitas masing-masing isolat bakteri diketahui denganmelakukan pengamatan terhadap sintasan (SR) udang uji pada masing-masing perlakuan selama 6, 12, 18,24, 36, 60, 84, dan 90 jam yang hasilnya dianalisis secara statistik. Hasil penelitian memperlihatkan: padajam ke-6 bakteri dengan kode isolat-1 yang diisolasi dari Banyuwangi dengan kepadatan 107 CFU/mLmemberikan tingkat patogenisitas yang tertinggi dan berbeda nyata pada taraf perlakuan 5% (P<0,05)dibandingkan dengan isolat-2, dan isolat-3, serta kontrol, sedangkan untuk jam ke–12 hingga jam ke-90tidak ada perlakuan yang berbeda nyata dengan kontrol yang diberikan. Populasi bakteri yang diisolasi darimedia air pemeliharaan cenderung mengalami penurunan selama pengamatan.

KATA KUNCI: patogenisitas, Vibrio harveyi, udang windu, lokasi berbeda

PENDAHULUAN

Di antara beberapa bakteri patogen, spesies Vibrio sudah dikenal sebagai penyebab penyakitVibriosis pada udang penaeid. Bakteri Vibrio adalah salah satu penyebab penyakit yang cukup banyakmenyerang hewan budidaya seperti udang windu (Karunasagar et al., 1994), beberapa spesies ikandan kekerangan (Austin, 2006) bahkan juga karang (Ben-Haim et al., 2003). Beberapa spesies Vibrioberpendar seperti Vibrio cholerae (biotype albensis), V. fischeri, V. harveyi, V. logei, V. splendidus, V.mediterranei (Farmer & Hickman-Brenner, 1992), V. orientalis (Yang et al., 1983), Photobacterium leiognathidan P. Phosphoreum diketahui berhubungan erat dengan beberapa kejadian penyakit pada lingkunganpembenihan dan pembesaran hewan budidaya.

Penyakit yang cukup berbahaya ini diketahui menyerang baik larva Penaeus monodon yang dipeliharadi hatcheri maupun yuwana udang yang dipelihara pada tambak-tambak pembesaran serta udangdewasa (Lavilla-Pitogo et al., 1998). Pada umumnya penyakit Vibriosis disebabkan oleh V. anguillarum,V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. penaeicida, & V. campbellii. Agen bakteri Vibrio inidapat menjadi penyebab penyakit yang utama dan pertama ditandai dengan meningkatnya populasibakteri Vibrio pada air tambak (Vandenberghe et al., 2003; Saulnier et al., 2000a). Salah satu spesiesdari genus Vibrio tersebut yang kemudian diketahui mendominasi penyebab penyakit Vibriosis tersebutadalah Vibrio harveyi.

Vibrio harveyi merupakan bakteri yang membutuhkan sodium klorida untuk hidupnya, berbentukcurve-rod dan termasuk dalam kelompok bakteri gram negatif yang banyak ditemukan pada lingkunganperairan (Farmer et al., 2005), serta dapat memendarkan cahaya sendiri pada kondisi tertentu. Spesiesbakteri ini terdistribusi secara luas pada lingkungan akuatik dan diketahui menjadi penyebab utamapenyakit kunang-kunang pada organisme laut maupun payau. Selain sebagai penyebab utama, seringkali juga bertindak sebagai agen oportunistik pada infeksi sekunder (Saulnier et al., 2000b).

834Patogenisitas bakteri Vibrio harveyi yang diisolasi ... (Ince Ayu Khairana Kadriah)

Berdasarkan hal tersebut, patogenisitas Vibrio harveyi utamanya yang diisolasi dari udang windudari lokasi budidaya berbeda perlu dikaji. Hal ini ke depannya diharapkan dapat dijadikan acuanuntuk upaya pencegahan penyakit Vibriosis.

BAHAN DAN METODE

Penelitian ini terdiri atas tiga tahap:1. Pembuatan bakteri resisten dari masing-masing isolat2. Uji pertumbuhan bakteri resisten masing-masing isolat bakteri3. Uji patogenisitas masing-masing isolat bakteri

Pembuatan Bakteri Resisten Rifampicin

Pembuatan resisten dari masing-masing isolat dimaksudkan untuk merubah sifat bakteri tersebutdari sensitif terhadap suatu antibiotik menjadi resisten. Hal ini bertujuan untuk memberikan penandapada bakteri agar mudah dikenali pada saat isolasi ulang bakteri tersebut pada prosedur postulatKoch.

Proses pembuatan resisten tersebut dilakukan dengan cara:

Isolat bakteri yang akan diuji (isolat 1, 2, dan 3) masing-masing diinokulasi ke dalam media tumbuhnutrient broth (NB), yang dibuat dengan cara melarutkan sebanyak 8 g NB ke dalam 1 L aquadessteril dan diberi penambahan NaCl sebanyak 1,5%; dihomogenkan dan kemudian dibagi ke dalam6 tabung reaksi masing-masing sebanyak 10 mL. Sterilisasi terhadap media tersebut dilakukandengan menggunakan autoclave pada suhu 121°C tekanan 1 atm selama 15 menit. Setelah sterildan suhunya telah sesuai dengan suhu ruang, inokulasi masing-masing bakteri uji dilakukan denganmemasukkan sebanyak 1 ose bakteri ke dalam media NB tersebut. Penumbuhan dan homogenisasidilakukan menggunakan shaker pada 150 rpm selama 4 jam.

Setelah 4 jam (penentuan 4 jam berdasarkan uji tumbuh yang dilakukan pada isolat bakteri yangWT/wild type) bakteri tersebut ditanam (diinokulasi) ke dalam media TCBS (Thiosulfat Ctrate BileSucrose Agar). Media TCBSA dibuat dengan cara menimbang sebanyak 89 g TCBSA dan dilarutkanke dalam 1.000 mL aquades steril. Larutan ini kemudian dimasak hingga mendidih dan disterilkanmenggunakan autoclave. Setelah steril dan suhunya telah sesuai dengan suhu ruang kemudiandituang ke plate (petri dish) steril masing-masing sebanyak 20 mL/plate. Inokulasi bakteri padamedia TCBSA dilakukan dengan cara mengambil sebanyak 100 mikron (0,1 mL) biakan bakteridalam NB dan disebarkan secara merata ke media TCBSA tersebut.

Untuk mengetahui sensitivitas bakteri terhadap antibiotik rifampicin, maka dilakukan uji hambatanmenggunakan rifampisin 5, 10, 50, dan 100 mg/L, dengan cara merendam papper disk ke dalammasing-masing konsentrasi rimfampisin kemudian diletakkan (ditempatkan) pada media TCBSAsesuai penomoran yang telah diberikan (Gambar 1). Sebelumnya dilakukan penanaman bakteriVibrio dengan metode sebar pada media TCBS yang akan dijadikan media uji hambat.

Gambar 1. Penempatan papper disk yang telahmengalami perendaman rifampisinpada konsentrasi 50 dan 100 mg/L

835 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2013

Uji resistensi bakteri Vibrio sp. dilakukan dengan menanambiakan bakteri yang telah dipadatkanmelalui proses sentrifugasi pada media TCBS yang telah ditambahkan antibiotik rifampicin 50 dan100 mg/L. Koloni bakteri Vibrio sp. yang berhasil tumbuh pada media TCBSA + Rif 50 mg/Lselanjutnya ditumbuhkan lagi pada media TCBSA + Rif 100 mg/L. Koloni bakteri yang tumbuhpada media TCBSA + Rif 100 mg/L selanjutnya diisolasi dan merupakan isolat bakteri Vibrio sp.resisten rifampicin.

Setelah bakteri resisten terhadap rifampisin diperoleh maka selanjutnya dilakukan uji tumbuhuntuk masing-masing isolat bakteri tersebut.

Uji Pertumbuhan Masing-Masing Isolat Bakteri Resisten Rifampicin

Uji tumbuh ini dimaksudkan untuk melihat kemampuan tumbuh dari masing-masing isolatsehingga dapat diketahui pada saat kapan bakteri tersebut berada pada puncak pertumbuhannya.

Uji tumbuh dilakukan dengan cara menginokulasi bakteri uji ke dalam media tumbuh NB yangkemudian dihomogenkan dengan menggunakan inkubator bergoyang secara terus-menerus padakecepatan 150 rpm. Pengamatan pertumbuhan dilakukan dengan cara menginokulasi bakteri padamedia NB ke dalam media TCBSA yang telah diberi penambahan rifampisin masing-masing padakonsentrasi 50 dan 100 mg/L. Pengambilan sampel untuk pengamatan pertumbuhan dilakukan denganinterval setiap 2 jam selama 24 jam. Sampel bakteri yang diinokulasi pada media TCBSA penanamannyadilakukan dengan menggunakan larutan fisiologis saline solutin (0,85% NaCl) secara berseri(pengenceran) mengikuti prosedur penanaman bakteri (Austin, 1993). Bakteri-bakteri yang telahditanam pada media TCBSA tersebut pertumbuhannya kemudian dihitung setelah diinkubasi selama24 jam untuk setiap waktu pengamatan. Penghitungan dilakukan dengan cara menghitung setiapkoloni bakteri yang tumbuh pada setiap pengenceran yang diberikan berdasarkan rumus:

Uji Patogenisitas Masing-Masing Isolat Bakteri

Uji patogenisitas dimaksudkan untuk mengetahui patogenisitas masing-masing isolat tersebutterhadap benur udang windu. Uji ini dilakukan dengan metode perendaman (Hameed, 1995)menggunakan tiga isolat dari tiga lokasi yang berbeda: isolat Banyuwangi dengan kode isolat-1;dari Negara, Bali dengan kode isolat-2; dan dari Gondol, Bali dengan kode isolat-3, dengan tigakonsentrasi 107 CFU/mL, 105 CFU/mL, dan 103 CFU/mL, dan kontrol (tanpa pemberian bakteri) yangmasing-masing diulang sebanyak tiga kali. Benur yang digunakan benur udang windu PL-14 yangdiinfeksi dengan teknik perendaman. Pengamatan sintasan dan pengambilan sampel bakteri padamedia pemeliharaan dilakukan dengan interval waktu 6 jam pada 12 jam pertama, 24 jam, 36 jam,84 jam, dan 90 jam. Penanaman sampel dilakukan pada media TCBSA yang telah diberi rifampisin100 mg/L dan penghitungan koloni bakteri dilakukan 24 jam setelah inkubasi.

Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap pola faktorial dengan perlakuan tiga jenisisolat bakteri, tiga konsentrasi bakteri, dan kontrol yang masing-masing diulang sebanyak tiga kali.

Gambar 3. Proses infeksi pada ujipatogenisitas

Gambar 2. Penuangan bakteri

836Patogenisitas bakteri Vibrio harveyi yang diisolasi ... (Ince Ayu Khairana Kadriah)

Data sintasan dianalisis secara statistik menggunakan ANOVA dengan uji lanjut jika terdapat perbedaandi antara perlakuan yang dicobakan. Sedangkan data populasi bakteri dianalisis secara deskriptifsebagai bahan pembanding.

HASIL DAN BAHASAN

Pembuatan Resisten dari Masing-Masing Isolat Bakteri Uji

Hasil pembuatan resisten terhadap isolat-isolat bakteri yang akan digunakan menunjukkan bahwasemua isolat tersebut resisten terhadap rifampisin baik pada konsentrasi 50 maupun 100 mg/L. Halini ditandai dengan adanya zona hambatan yang ditimbulkan oleh bakteri akibat pemberian antibiotikrifampisin. Untuk selanjutnya rifampisin yang digunakan pada konsentrasi 100 mg/L. Hal inidikarenakan rifampisin yang digunakan adalah rifampisin dengan dosis 600 mg/tablet. Di sampingmetode uji hambat dengan paper dish, dilakukan juga uji resisten dengan metode sebar.

Isolat Banyuwangi Isolat Negara Isolat Gondol

Gambar 4. Hasil uji hambat dengan menggunakan paper dish

Rif 100 ppm Rif 50 ppm Kontrol

Gambar 5. Hasil uji bakteri resistensi asal Banyuwangi

Rif 100 ppm Rif 50 ppm Kontrol

Gambar 6. Hasil uji resistensi bakteri asal Negara, Bali

837 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2013

Uji Pertumbuhan Masing-Masing Isolat Bakteri Resisten Rifampicin

Hasil uji pertumbuhan untuk masing-masing isolat dengan interval waktu pengamatan setiapdua jam pada media NB (Nutrien Broth) dapat dilihat pada Gambar 8.

Dari Gambar 8 terlihat bahwa untuk isolat 1 dan 2 puncak pertumbuhannya diperoleh pada jamke-4 kemudian mengalami penurunan, sedangkan isolat-3 mengalami puncak pertumbuhan padajam ke-6.

Uji Patogenisitas Masing-Masing Isolat Bakteri Uji

Pada pengamatan enam jam pertama dapat terlihat sintasan terendah pada perlakuan 1,7 dan1,5. Hasil yang hampir sama juga terlihat pada pengamatan 12 jam setelah infeksi. Secara statistikdapat dibuktikan bahwa perlakuan dengan isolate-1 (konsentrasi 107 dan 105 CFU/mL) berbedanyata dengan kontrol dan perlakuan lainnya pada pengamatan 6 jam pertama setelah infeksi. Namunpada pengamatan selanjutnya tidak terdapat perbedaan yang signifikan pada sintasan benur udangantara perlakuan dengan kontrol.

Hal ini dapat dijelaskan dengan melihat data populasi bakteri yang diisolasi dari media uji. Populasibakteri tertinggi pada pengamatan 6 dan 12 jam setelah infeksi diperoleh dari perlakuan isolate-1dengan konsentrasi 107 CFU/mL. Secara umum populasi bakteri terlihat menurun setelah 6 jampasca infeksi pada semua perlakuan. Menurunnya tingkat patogenisitas bakteri setelah 12 jam

Gambar 7. Hasil uji resistensi bakteri asal Gondol, Bali

Rif 100 ppm Rif 50 ppm Kontrol

Gambar 8. Grafik pertumbuhan isolat bakteri dalam media NB

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Popu

lasi

bak

teri

(log

CF/

mL)

Waktu pengamatan (interval waktu 2 jam)

1 2 3

838Patogenisitas bakteri Vibrio harveyi yang diisolasi ... (Ince Ayu Khairana Kadriah)

perlakuan diduga berhubungan dengan penurunan populasi bakteri pada media uji. Seperti diketahuibahwa uji patogenisitas dengan metode perendaman sangat dipengaruhi oleh populasi bakteri yangbertahan hidup pada media pemeliharaan. Data sintasan dan data populasi bakteri pada media ujimemberikan gambaran tingkat patogenisitas tertinggi pada pengamatan jam ke-6 dan ke-12 pascainfeksi diperoleh dari perlakuan dengan isolat bakteri No. 1 asal Banyuwangi.

0

20

40

60

80

100

6 12 18 24 36 60 84 90

Pers

enta

se s

inta

san

Waktu pengamatan (jam)

Isolat 1,7 Isolat 2,7 Isolat 3,7 Kontrol

0

20

40

60

80

100

6 12 18 24 36 60 84 90

Pers

enta

se s

inta

san

Waktu pengamatan (jam)

Isolat 1,5 Isolat 2,5 Isolat 3,5 Kontrol

0

20

40

60

80

100

6 12 18 24 36 60 84 90

Pers

enta

se s

inta

san

Waktu pengamatan (jam)

Isolat 1,3 Isolat 2,3 Isolat 3,3 Kontrol

A B

Gambar 9. Grafik sintasan udang infeksi buatan dengan perendaman; kepadatan bakteri 107cfu/mL (A); kepadatan bakteri 105 cfu/mL (B); dan kepadatan bakteri 103 cfu/mL (C)

C

Gambar 10. Kurva pertumbuhan bakteri pada air media pemeliharaanudang

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

6 12 18 24 36 60 84 90

Popu

lasi

bak

teri

CFU

/mL

(log)

Waktu pengamatan (jam)

Isolat 1,7 Isolat 1,5Isolat 1,3 Isolat 2,7Isolat 2,5 Isolat 2,3Isolat 3,7 Isolat 3,5Isolat 3,3 Kontrol

839 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2013

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil pengamatan pertumbuhan bakteri pada media NB diketahui bahwa puncakpertumbuhan terjadi pada jam ke-4 dan ke-6. Dari tiga isolat yang diuji patogenisitasnya diketahuibahwa isolate-1 asal Banyuwangi memiliki tingkat patogenisitas lebih tinggi dibandingkan dua isolatlainnya.

DAFTAR ACUAN

Austin, B. & Zhang, X.-H. 2006. Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates andinvertebrates. Lett. Appl. Microbiol., 43: 119-124.

Ben Haim, Y., Thompson, F.L., Thompson, C.C., Cnockaert, M.C., Hoste, B., Swings, J., & Rosenberg, E.2003. Vibrio coralliilyticus sp. nov., a temperature-dependent pathogen of the coral Pocilloporadamicornis. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 53: 309–315.

Farmer, J.J. & Hickman-Brenner, F.W. 1992. The genera Vibrio and Photobacterium. In The Prokaryotes– a Handbook on the Biology of Bacteria: Ecophysiology, Isolation, Identification, Applications.Edited by A. Balows. New York. Springer, p. 2,952–3,011.

Hameed, A.S.S. 1995. Susceptibility of three Penaeus sp. to a Vibrio campbelli-like bacterium. J. WorldAqua. Soc., 26(3): 315-319.

Lavilla-Pitogo, C.R., Leano, E.M., & Paner, M.G. 1998. Mortalities of pond-cultured juvenile shrimp,Penaeus monodon, associated with dominance of luminescent Vibrios in the rearing environment.Aquaculture, 164: 337–349.

Saulnier, D., Haffner, P., Goarant, C., Levy, P., & Ansquer, D. 2000a. Experimental infection models forshrimp Vibriosis studies: a review. Aquaculture, 191: 133–144.

Saulnier, D., Avarre, J.C., Le Moullac, G., Ansquer, D., Levy, P., & Vonau, V. 2000b. Rapid and sensitivePCR detection of Vibrio penaeicida, the putative etiological agent of Syndrome 93 in New Caledonia.Dis. Aquat. Org., 40: 109–115.

Vandenberghe, J., Thompson, F.L., Gomez-Gil, B., & Swings, J. 2003. Phenotypic diversity amongVibrio isolats from marine aquaculture systems. Aquaculture, 219: 9–20.

Yang, Y.K., Yeh, L.P., Cao, Y.H., Baumann, L., Baumann, P., Tang, J.E. & Beaman, B. 1983. Characterizationof marine luminous bacteria isolatd off the coast of China and description of Vibrio orientalis sp.nov. Curr Microbiol., 8: 95–100. http://mic.sgmjournals.org 1777 Molecular identification of V.harveyi-related isolats.