Plan i dizajn pokusa sa životinjama · 2013. 11. 11. · Plan i dizajn pokusa sa životinjama. Kontrola C1 C2 C3 C4 C5 0 20 40 60 80 100 Kontrola C1 C2 C3 C4 C5 68.666 105.045 33.98

Plan i dizajn pokusa sa životinjama

prof. dr. sc. Branimir K. Hackenberger

• smanjenje broja životinja (N)

• smanjenje realnih troškova (C)

• osiguranje preciznosti i pouzdanosti (P&P)



P & P C

N






Precizno Neprecizno

Pouzdano

Nepouzdano


Da li je mjerena

varijabla

normalno

distribuirana ?

Može li se

transformirati u

normalno

distribuiranu ?

DA

NE NE

Procjena

parametara Transformacija

DA

Odabir

statistike

nezavisne o

distribuciji

Određivanje

veličine

uzoraka


Da li je mjerena veličina normalno distribuirana? Da li je mjerena

varijabla

normalno

distribuirana ?

1. Podaci iz literature ?!

2. Podaci iz prethodnih istraživanja ?!

PILOT istraživanje !!!


Za većinu testova normalnosti broj uzoraka mora biti veći od 7. Međutim ......!!!

X

Gustoća

2 4 6 8 10 12

0.0

00

.02

0.0

40

.06

0.0

80

.10

0.1

2

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

46

81

0

Kvantili norm. distribucije

X

P Anderson Darling = 0.9068863

P Cramer von Mises = 0.9243362

P Shapiro = 0.915829

X

Gustoća

0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0


X



P Shapiro = 0.9774996

Kod malih uzoraka pouzdanost je vrlo mala !




Male uzorke ima smisla testirati samo ako imamo prethodnu informaciju o očekivanoj distribuciji rezultata!

Za pilot istraživanje distribucije rezultata moramo upotrijebiti najmanje 30 životinja.

Da li to znači da je minimalan broj životinja u pokusu 30?

NE


02

04

06

08

01

00

1 2 3 4 5 6

70

80

90

10

01

10

12

0


X

Gustoća

70 80 90 100 110 120 130

0.0

00

0.0

05

0.0

10

0.0

15

0.0

20

0.0

25

0.0

30

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

80

90

10

01

10

12

0


X



P Shapiro = 1

X

Gustoća

80 85 90 95 100 105 110 115

0.0

00

.01

0.0

20

.03

0.0

40

.05

0.0

6

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

85

90

95

10

01

05

11

01

15


X



P Shapiro = 0.996

X

Gustoća

80 85 90 95 100 105 110 115

0.0

00

.01

0.0

20

.03

0.0

4

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

85

90

95

10

01

05

11

01

15


X



P Shapiro = 0.982

X

Gustoća

80 85 90 95 100 105 110

0.0

00

.01

0.0

20

.03

0.0

40

.05

0.0

6

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

85

90

95

10

01

05

11

0


X



P Shapiro = 0.971


X

Gustoća

2 4 6 8 10 12 14

0.0

00

.05

0.1

00

.15

0.2

0

-2 -1 0 1 2

46

81

01

2


X



P Shapiro = 0.3681413

X

Gustoća

0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2

01

23

-2 -1 0 1 2

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1


X



P Shapiro = 0.9974735


Kontrola 10 mg/kg 30 mg/kg 50 mg/kg

17.7 29.33 73.47 106.55

13.81 46.07 64.96 56.62

16.38 26.07 54.01 94.64

15.83 38.63 35.85 80.04

15.28 52.49 87.66 48.04

12.14 34.79 23.12 27.77

13.18 42.83 63.63 87.61

14.08 36.98 47.19 66.51


Kontrola 10 ug/kg 30 ug/kg 50 ug/kg

1.165 1.964 2.021 5.532

1.202 1.392 1.301 3.683

1.242 1.489 3.208 4.633

1.183 1.678 2.857 3.164

1.13 1.827 2.367 6.063

1.23 1.204 1.584 8.138

1.148 1.592 1.801 6.842

1.1 1.376 4.053 9.687


0.152721 0.674983 0.703592 1.710549

0.183987 0.330742 0.263133 1.303728

0.216723 0.398105 1.165648 1.533205

0.168054 0.517603 1.049772 1.151837

0.122218 0.602675 0.861623 1.802205

0.207014 0.185649 0.459953 2.096544

0.138021 0.464991 0.588342 1.92308

0.09531 0.319181 1.399457 2.270785



1.165 1.964 2.021 5.532

1.202 1.392 1.301 3.683

1.242 1.489 3.208 4.633

1.183 1.678 2.857 3.164

1.13 1.827 2.367 6.063

1.23 1.204 1.584 8.138

1.148 1.592 1.801 6.842

1.1 1.376 4.053 9.687


0.152721 0.674983 0.703592 1.710549

0.183987 0.330742 0.263133 1.303728

0.216723 0.398105 1.165648 1.533205

0.168054 0.517603 1.049772 1.151837

0.122218 0.602675 0.861623 1.802205

0.207014 0.185649 0.459953 2.096544

0.138021 0.464991 0.588342 1.92308

0.09531 0.319181 1.399457 2.270785



1.107 1.258 1.97 3.805

1.135 1.515 2.84 1.345

1.168 1.338 1.855 1.782

1.088 1.335 1.831 6.244

1.123 1.074 1.638 6.142

1.058 1.442 2.449 2.843

1.13 1.213 1.876 5.467

1.031 1.355 1.296 1.625

1.084 1.605 1.849 2.983

1.074 1.19 2.059 3.754

1.192 1.18 1.749 5.089

1.088 1.127 1.724 2.313

1.141 1.532 2.647 4.858

1.168 1.092 1.713 3.406

1.161 1.245 1.764 4.549

1.112 1.305 1.509 2.317

1.115 1.101 1.88 2.74

1.121 1.284 1.697 4.531

1.131 1.269 2.255 2.621

1.139 1.65 2.375 2.265

1.16 1.376 2.059 3.089

1.141 1.267 2.05 4.194

1.049 1.422 1.462 3.026

1.059 1.169 1.587 1.438

1.102 1.386 2.545 9.645

1.2 1.269 1.386 3.039

1.214 0.987 2.092 3.989

1.089 1.45 1.144 2.296

1.107 1.364 1.535 3.64

1.194 1.25 2.265 4.386


Kontrola C1 C2 C3 C4 C5

02

04

06

08

01

00


68.666 105.045 33.98 53.197 17.933 10.798

56.2 75.773 23.9 19.148 8.067 16.762

71.491 92.85 58.779 3.287 4.106 8.296

76.446 52.861 73.596 20.176 0.714 13.632

81.96 46.43 41.754 72.363 27.505 5.384

93.742 69.67 9.234 8.402 44.669 19.771

88.938 83.69 47.358 41.41 15.442 12.046

60.692 61.358 108.381 32.186 13.198 23.277



02

04

06

08

01

00

X

Gustoća

7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5


X

X

Gustoća

50 60 70 80 90 100

0.0

00

0.0

10

0.0

20

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

60

70

80

90


X

P Anderson Darling = 0.956P Cramer von Mises = 0.983

P Shapiro = 0.921

xT x


P Shapiro = 0.92

x = 74.77



02

04

06

08

01

00

X

Gustoća

6 7 8 9 10 11

0.0

00.1

00.2

0

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

7.0

8.0

9.0

10.0


X

X

Gustoća

40 60 80 100 120

0.0

00

0.0

10

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

50

60

70

80

90


X


P Shapiro = 0.976

xT x


P Shapiro = 0.961

x = 73.46



02

04

06

08

01

00

X

Gustoća

2 4 6 8 10 12

0.0

00.0

50.1

00.1

5

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

46

810


X

X

Gustoća

0 20 40 60 80 100 120

0.0

00

0.0

10

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

20

40

60

80

100


X


P Shapiro = 1

xT x


P Shapiro = 0.827

x = 49.62



02

04

06

08

01

00

X

Gustoća

0 2 4 6 8 10

0.0

00.0

50.1

00.1

5

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

23

45

67

8


X

X

Gustoća

0 20 40 60 80

0.0

00

0.0

10

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

10

30

50

70


X


P Shapiro = 0.977

xT x


P Shapiro = 0.734

x = 31.27


X

Gustoća

0 2 4 6 8

0.0

00.1

00.2

0

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

12

34

56


X

X

Gustoća

0 10 20 30 40 50

0.0

00.0

10.0

20.0

3

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

010

20

30

40


X


P Shapiro = 0.998

xT x


P Shapiro = 0.401

x = 16.45


02

04

06

08

01

00



02

04

06

08

01

00

X

Gustoća

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5


X

X

Gustoća

5 10 15 20 25

0.0

00.0

20.0

40.0

6

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

510

15

20


X


P Shapiro = 0.995

xT x


P Shapiro = 0.973

x = 13.75


Pokusi sa normalno distribuiranim rezultatima ili rezultatima koji mogu biti transformirani u normalno distribuirane.

Kolika im je varijanca ?

s



Procjena varijance

1. Na temelju literaturnih podataka. 2. Na temelju prethodnih mjerenja.

6

MINMAXpr

xx s3.

4. Steinova sekvencijalna procedura.


Veličina uzorka ?


ili ili

zašto ne samo 1 !?


ili



Određivanje veličine uzorka za procjenu srednje vrijednosti

Interval povjerenja:

nzx

nzx

ss 2/2/ ,

1- z 0.997 0.003 3

0.99 0.01 2.56

0.955 0.045 2

0.95 0.05 1.96

0.9 0.1 1.64

x1

x2

x3

...

...

...

xn 2

2/

prn

zn

s2

2/

pr

Sn

szn


Primjer: Preliminarnim mjerenjem dobiveni su sljedeći rezultati

124.9

82.9

89.9

114.4

115.2

149.2

92

105.8

145

62.2

Kolika veličina uzorka iz ove populacije je potrebna za određivanje srednje vrijednosti u intervalu povjerenja od 95%?

41.72s

96.105.0 z

9.2810

41.27*96.122

2/

S

Sn

szn

10n


Primjer: Želimo procijeniti prosječnu vrijednost aktivnosti AChE u populaciji CBA miševa tako da greška procjene ne bude veća od 2 mmol mgpr

-1 min-1 , s vjerojatnosti od 95% ?

296.1

Sn

s2

2

2

96.1snS

s n

0 0

1 1

2 4

5 25

10 97

15 217

20 385

25 601

50 2401

100 9604 0

100

200

300

400

500

600

700

0 5 10 15 20 25 30

n

standardna devijacija (s)


Određivanje veličine uzorka za procjenu proporcije

2

2

2/ )1(

uuz

nS

Primjer: Želimo procijeniti udio populacije s genotipom qq s vjerojatnošću od 95%. Poznato je da je normalan udio ovog genotipa u populaciji 13%. Kolika je minimalna veličina uzorka potrebna?

17405.0

87.0*13.0*96.12

2

Sn


greška (greška tipa I): vjerojatnost da je H0 odbačena iako je istinita

b greška (greška tipa II): vjerojatnost da H0 nije odbačena iako nije istinita

1-b (snaga): vjerojatnost da je H0 odbačena ako nije istinita

Samo ne !!! Samo ne b !!!

Farmaceut / Kemičar Toksikolog


Određivanje veličine uzoraka za procjenu značajnosti razlike srednjih vrijednosti dvije grupe

a1 b1

a2 b2

a3 b3

... ...

... ...

... ...

an ...bn

21

210

:

:

mm

mm

AH

H

2

2

1

22

2

2

1 1

n

n

zzn

n

nS

sb

2

22sb zz

nS


2

22

2/ sb zznS

Koliki ?

Koliki b ?

Ukoliko se radi o skupom istraživanju i ukoliko se potreba ponavljanja želi izbjeći greška tipa je važnija i treba ju smanjiti na razinu =0.01 ili =0.02.

Ukoliko se radi o periodičnom mjerenju koje će se ponavljati u bez obzira na rezultate, pogreška je manje značajna za dizajn i može se držati na uobičajenih =0.05.

U znanstvenoj literaturi akceptabilne razine greške su 0.05 , pa i 0.10, te nema ni znanstvene ni praktične potrebe tu razinu snižavati.

Značajnost b greške je u prosjeku oko 4 puta manja od greške, pa se u praksi uzima da je tj. . b 4 b 411

Npr. ukoliko je 0.05 onda je 1-b=0.80.


2

22

2/ sb zznS

n

zz )( 2/ bs

n

zzs )( 2/ b


Pojednostavljeni izračuni potrebne veličine uzoraka

Lehrova jednadžba

2

22

1616s

s

nS

s

nS

4



A B 4 9 6 10 6 12 7 12 9

10

Broj „difuznih” stanica na 50 pregledanih.

A B

n 6 4

Srednja vrijednost 7 10.75

Standardna devijacija 2.19 1.5

Standardna greška 0.89 0.75

3.75 0

2

4

6

8

10

12

14

A B

A B0

24

68

10

12

14

H0: =3.75 nije slučajna i očekuje se pri randomiziranom uzorkovanju.

HA: =3.75 je slučajna i veća je od one koja se normalno očekuje pri randomiziranom uzorkovanju.


A B 4 9 6 10 6 12 7 12 9

10

Grupa Rezultat

A 4 A 6 A 6 A 7 A 9 A 10 B 9 B 10 B 12 B 12


Grupa Rezultat

A 4 A 6 A 6 A 7 A 9 A 10 B 9 B 10 B 12 B 12

Grupa Rezultat

A 6 A 6 A 10 A 9 A 12 A 7 B 4 B 12 B 9 B 10

Grupa Rezultat

A 7 A 12 A 12 A 10 A 10 A 9 B 6 B 9 B 4 B 6

Originalni podaci Simulacija 1 Simulacija 2

A B

m 8.33 8.75

s 2.42 3.40

0.42

A B

m 10.00 6.25

s 1.90 2.06

-3.75

A B

m 8.83 8.00

s 2.14 3.65

-0.83

Grupa Rezultat

A 12 A 9 A 10 A 9 A 6 A 7 B 12 B 10 B 6 B 4

Simulacija x

.....

.....

x=103 do 109


n

0.96 7513

2.34 1756

3.06 491

3.63 160

4.12 2

4.56 21

4.96 48

5.33 9

5.68 0

6 0

6.31 0

6.61 0

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0.96 2.34 3.06 3.63 4.12 4.56 4.96 5.33 5.68 6 6.31 6.61

n 3.75 sim≤obs:9920 p=0.992 sim>obs:80 p=0.008


Glavni nedostatci Monte Carlo analize:

1. Zahtjevi za softwareom (i ponekad hardwareom )

2. Psihološka barijera („neegzaktna” metoda)


A B 4 9 6 10 6 12 7 12 9

10

grupaunutar

grupaunutargrupaizmedju

s

ssF

F=33.75/3.84=8.78

Fkrit=5.32


A B 4 9 6 10 6 12 7 12 9

10

Fkrit=5.32 ?)78.8( kritobs FFP

?)( 0 podaciHP

?)78.832.5( obsFFP testiranje alternativne hipoteze

)(

)()()(

00

0podaciP

HpodaciPHPpodaciHP

posteriori apriori

Srednje vrijednosti i varijanca su slučajne varijable!


),(~ 2

AAA N sm

),(~ 2

BBB N sm

Kako su parametri zapravo slučajne varijable za njih postoji distribucija vjerojatnosti.

Specifikacija prior vjerojatnosti

Koja je raspodjela vjerojatnosti ovih varijabli prije nego što je učinjen pokus?


Bayesova statistika


Glavna prednost Bayesove statistike:

Rezultati jednog pokusa mogu se bez problema upotrijebiti za interpretaciju i testiranje rezultata narednih pokusa.

Zahtjevan software i najčešće vrlo komplicirano korištenje.

Glavni nedostatak Bayesove statistike:


Osnovni tipovi dizajna pokusa

Uobičajeni osnovni tip dizajna u radu sa životinjama je „sve prema jedan” !

1. neograničeni dizajn

Kontrola (-) Tvar A Tvar B Tvar C


2. dizajn doza ovisnosti

Kontrola (-) C1 C2 C3 C4 C5

3. prošireni dizajn doza ovisnosti

Kontrola (-) C1 C2 C3 C4 C5 Kontrola (+)


4. Kompleksni ili složeni dizajn

Kontrola (-) C1a C2a C3a C4a C5a

Kontrola (+) Kontrola (0) C1a+B C2a+B C3a+B


1. neograničeni dizajn

2. dizajn doza ovisnosti

3. prošireni dizajn doza ovisnosti

4. Kompleksni ili složeni dizajn

STROGO zabranjena upotreba t-testa po principu „svaki sa svakim!!!

Višestruko povećanje vjerojatnosti b greške !!!

Isto vrijedi i z asve druge metode koje se primejnjuju po principu „svaki sa svakim” (npr. Tukey)


Vrsta varijable Primjer Test za dva uzorka

Normalno distribuirana, homogene varijance hemoglobin t-test

Normalno distribuirana, heterogene varijance broj eritrocita Welchov t-test

Nepoznata distribucija, kontinuirana aktivnost ASAT u-test (asimptotski)

Nepoznata distribucija, diskretna broj mikronukleusa u-test (permutativni)

Dihotomna mortalitet Fisherov ili Barnardov test

Vrsta varijable Procedura

Normalno distribuirana Dunett

Nepoznate distribucije Steel

Dihotomna Passing

Documents

Plan i dizajn pokusa sa životinjama · 2013. 11. 11. · Plan i dizajn pokusa sa životinjama. Kontrola C1 C2 C3 C4 C5 0 20 40 60 80 100 Kontrola C1 C2 C3 C4 C5 68.666 105.045 33.98