Upload
ninabegovic
View
277
Download
14
Embed Size (px)
DESCRIPTION
h
Citation preview
H R O M A T O G R A F I J A- Gasna hromatografija- HPLC
ZATVORENE KOLONE
�Gasna hromatografija (GC)
U zavisnosti od stacionarne faze:� gasno-čvrsta (GSC) - stacionarna faza u obliku
aktivnog čvrstog adsorbenta: aktivni ugalj, teflon, silikagel, zeoliti ili aluminijum-oksid.
Osnovni proces: adsorpcija
� gasno tečna (GLC)- stacionarna faza je teškoisparljiva tečnost koja je u vidu tečnog slojaravnomerno nanešena preko površine inertnogčvrstog nosača.
Osnovni proces: raspodela
Mobilna fazaGas nosač: inertni gas, vrhunske čistoće�Azot ????�Helijum�ArgonRegulisati pritisak i brzinu protoka gasa nosača
A carrier gas should have the following properties:
1. Highly pure (> 99.9%)2. Inert so that no reaction with stationary phase or
instrumental components can take place, especially at high temperatures.
3. A higher density (larger viscosity) carrier gas is preferred.
4. Compatible with the detector since some detectors require the use of a specific carrier gas.
5. A cheap and available carrier gas is an advantage.
Koja jedinjenja se analiziraju GC?
� Isparljiva i termostabilna jedinjenja
� Uglavnom organska jedinjenjado 800 Da u neutralnom (molekulskom) obliku
� Ako nisu dovoljno isparljiva -prevesti ih u isparljiviji oblik derivatizacijom (hemijskom reakcijom: acetiliranjem, esterifikacijom, alkiliranjem…)
Razdvajanje u GC zavisi od:
� Isparljivosti komponente (isparljivije brže)� Rastvorljivosti komponente(rastvorljivije
sporije)� Polarnosti komponente i kolone (polarnije
sporije)� Temperature kolone(veća temperatura-brže)
� Brzine gasa(optimalna brzina)� Dužine kolone(duža kolona-duže putovanje)
constTR
HK +∆=
303,2log
Osnovni delovi GC� Izvor gasa nosača sa regulatorom
pritiska i protoka
� Injektor (sistem za unošenje uzorka)
� Hromatografska kolona u termostatu
� Detektor
� Sistem za registraciju signala iz detektora (računar i pisač)
Shema GC
Injektori
MIKROLITARSKI ŠPRICEVI
Kolone: pakovane (punjene) i kapilarne
1-5 m 10-150 m
GC Columns
Capillary columnsPacked columns
•Typically a glass or stainless steel coil. •1-5 total length and 5 mm inner diameter.• Filled with the st. ph. or a packing coated with the st.ph.
•Thin fused-silica.•Typically 10-150 m in length and 250µm inner diameter.•St. ph. coated on the inner surface.•Provide much higher separation eff.•But more easily overloaded by too much sample.
Detektor na bazi toplotne provodljivosti Thermal conductivity detector (TC)Shema
NEDESTRUKTIVAN
Plameno jonizacioni detektor (FID)
Ne mogu voda, CO, CO2 i većina
neorganskih jedinjenja
DESTRUKTIVAN
Detektor na bazi zahvata elektronaElectron capture detector (ECD)
HalogeniElectrons from a beta-source (Ni-63) ionize the carrier gas (nitrogen). Organic molecules containing electronegative atoms capture electrons and decrease current
Detektor: maseni spektrometar (GC-MS)
Maseni spektrometar je detektor
Uskladiti pritiske i osloboditi se gasa nosača
Koji detektor se nekoristi kod gasne hromatografije?
� katarometar
� maseni spektrometar
� atomski apsorpcioni spektrofotometar
� plameno-jonizacioni detektor
Koji gas nemože biti gas nosač kod gasne hromatografije?
� azot
� kiseonik
� helijum
� argon
Koji detektor ima radioaktivni izvor?
� katarometar
� maseni spektrometar
� detektor na bazi zahvata elektrona
� plameno-jonizacioni detektor
Detektor na bazi zahvata elektrona ima radioaktivni izvor:
� Alfa
� Beta
� Gama zraka
Injektor je deo koji služi za� Unos analize
� Razdvajanje analize
� Detekciju analize
Injektor se zagreva na temperaturu koja je
� Niža
� Ista
� Viša od temperature ključanja komponente
Objasniti sliku
Objasniti sliku
HPLC� High performance liquid
chromatographyTečna hromatografja visoke
efikasnosti ili Visoko efikasna tečna hromatografija
� High pressure liquid chromatography
Tečna hromatografija pod visokim pritiskomSamo TEČNA
HROMATOGRAFIJA
Najviše korišćena separaciona tehnika
HPLC ApplicationsChemical
Environmental
Pharmaceuticals
Consumer Products
Clinical
polystyrenesdyesphthalates
tetracyclinescorticosteroidsantidepressantsbarbiturates
amino acidsvitaminshomocysteine
Bioscienceproteinspeptidesnucleotides
lipidsantioxidantssugars
polyaromatic hydrocarbonsInorganic ionsherbicides
Hromatografija normalnih faza/reverznih fazaHromatografija normalnih faza/reverznih faza
Stacionarna faza Mobilna faza
Normalnefaze
manje od10%
PolarnaSilikagel
NepolarnaHeksan, heptan..
Reverzne faze
više od 90%
NepolarnaModifikovani
silikagel: C8, C18
PolarnaMetanol,
acetonitril, voda/pufer…
Eluiranje može biti� IzokratskoUvek ista mobilna faza, npr. 50% metanol
� GradijentnoSastav mobilne faze se menja za vreme eluiranja
Npr. prvih 5 minuta teče 50% metanol, drugih 5 minuta 60% metanol, trećih 5 minuta 70% metanol.......
Osnovni delovi HPLC
� Izvor protoka mobilne faze: rezervoar, pumpa i filter
� Deo za separaciju: injektor, hromatografska kolona i termostat
� Detektor ili sistem detektora
Shema HPLC
Injektor
Injektor sa petljom
Kolone
Detektori
� UV-Vis spektrofotometri� (Photo)Diode Array Detector (PDA ili
DAD)� Fluorimetri� Refraktometri� Hemiluminiscentni detektori� Elektrohemijski detektori� Maseni spektrometar HPLC/MS
Nove tehnologije: UHPLC ili UPLC � Ultra High Performance Liquid Chromatography Where standard HPLC typically uses column particles with sizes
from 3 to 5µm and pressures of around 400 bar, uHPLC use specially designed columns with particles down to 1.7µm in size, at pressures in excess of 1000 bar. The main advantage of an uHPLC is speed. These systems are faster, more sensitive, and rely on smaller volumes of organic solvents than standard HPLC, resulting in the ability to run more samples in less time. However, if the systems are run at typical pressures greater than 800 bar, the columns age, or degrade quicker. Newer technology is being developed for uHPLC units to use column particles with 1µm size, and pressure potentials up to 6,800 bar.
Injector
Detector
Column
Solvents
Mixer
Pumps
High Performance Liquid Chromatograph
Waste
HROMATOGRAM� Zapis hromatografskog razdvajanja
� Apscisa: vreme provedeno u koloni ili zapremina mobilne faze
� Ordinata: Jačina signala detektora (srazmerno koncentraciji uzorka)
KA>KB>KC
FtV RR =
Retenciono vreme- vreme koje je komponenta provela u koloni od momenta injiciranja do njene pojave u detektoru
KORIGOVANO t ,R i NEKORIGOVANO t R
Retenciona zapremina-zapremina mobilne faze potrebnada komponentu spere (eluira) sa kolone
Retencija
� - Faktor kapaciteta (faktor zadržavanja, retencioni faktor)
tR
t0
Str
engt
h of
det
ecto
r si
gnal
Time
tR – retenciono vreme komponente koja je zadržana na koloni;t0 – retenciono vreme komponente koja se ne zadržava na koloni –pik mobilne faze
0
0,
t
ttk R −=
fazemob
uzorkaRF.υ
υ=Retencija
Rezolucija- koliko su dobro pikovi razdvojeni
2121
12 2
2WW
tWWtt
R RR
+∆=+
−=
DOBRO RAZDVAJANJE R>2.0
Broj teorijskih platoa
N
LH =
2)(16W
tN R=
L- dužina koloneN – broj teorijskih platoa
2
2/1
)(54.5W
tN R=
Kvalitativna i kvantitativna analiza
Kvantitativna analiza
Visina/površina pikasrazmerna je koncentraciji
46
Kalibraciona krivaKalibraciona kriva
C1
C4
C3
C2
ConcentrationArea
A1
A2
A3
A4C1 C2 C3 C4
A1
A2
A3
A4
Concentration
Pea
k ar
ea
Calibration curveCalibration curve
Kvalitativna analiza-poređenje sa standardom
standard
Chromatogram of Gasoline1. Isobutane2. n-Butane3. Isopentane4. n-Pentane5. 2,3-Dimethylbutane6. 2-Methylpentane7. 3-Methylpentane8. n-Hexane9. 2,4-Dimethylpentane10. Benzene11. 2-Methylhexane12. 3-Methylhexane13. 2,2,4-Trimethylpentane14. n-Heptane15. 2,5-Dimethylhexane16. 2,4-Dimethylhexane17. 2,3,4-Trimethylpentane18. Toluene19. 2,3-Dimethylhexane20. Ethylbenzene21. m-Xylene22. p-Xylene23. o-Xylene
HPLC hromatogramEkstraktGinko biloba-razdvojeni flavonoidiKolona C-18Mob. faza 60% CH3OH, brzina protoka 1 mL /min
50
Objasniti slikuObjasniti sliku
C18
CH3
StrongStrongWeakWeak
OH
51
Objasniti slikuObjasniti sliku
OH
HO
SiOH
SiOHStrongStrong
WeakWeak
Steric hindrance
Objasniti sliku
x
a
b
c
a b c
c b a
0
0
Time
Time
Normal Phase (SiO2)
Reverse Phase (C18)
Normal Phase (SiO2) TLC