4/16/2012

1

HROMATOGRAFIJA

dr Mara Aleksić, vanr. prof.

HROMATOGRAFIJA

Fizičkohemijska metoda koja se bavi:

♣ Razdvajanjem SEPARACIONA METODA

♣ Izolovanjem

♣ Identifikacijom (kvalitativna analiza)

♣ Određivanjem (kvantitativna analiza)

4/16/2012

2

Razdvajanje komponenata smeše izmeĎu dve faze: koje se ne mešaju koje su različitih pokretljivosti koje se nazivaju stacionarna i mobilna

RAZLIČIT AFINITET KOMPONENTE PREMA STACIONARNOJ I MOBILNOJ FAZI !!!

MOBILNA FAZA STACIONARNA FAZA

GAS ČVRSTO TELO (porozno, ili granulisano) TEČNOST SLOJ TEČNOSTI ADSORBOVAN NA ČVRSTOM TELU JONOIZMENJIVAČ

Klasifikacija hromatografskih

metoda

1. Mehanizam razdvajanja

2. Priroda stacionarne i mobilne faze

(agregatno stanje faze)

3. Tehnika izvođenja

4/16/2012

3

adsorpcija – adsorpciona hromatografija

različita rastvorljivost – podeona (particiona) hromatografija

jonska izmena –jonoizmenjivačka hromatografija

Klasifikacija hromatografskih metoda na

osnovu mehanizma razdvajanja

Klasifikacija hromatografskih metoda na

osnovu prirode stacionarne i mobilne faze

Mobilna faza

Naziv hromatografske

metode

Stacionarna faza

Naziv hromatografske

metode

GAS

Gasna hromatografija

(GC)

TEČNOST

Gasno-tečna hromatografija

(GLC)

ČVRSTO

Gasno-čvrsta hromatografija

(GSC)

TEČNOST

Tečna hromatografija

(LC)

TEČNOST

Tečno-tečna hromatografija

(LLC)

ČVRSTO

Tečno-čvrsta hromatografija

(LSC)

4 kombinacije faza

tečno/tečno tečno/čvrsto

gas/tečno gas/čvrsto

4/16/2012

4

Klasifikacija hromatografskih metoda

na osnovu tehnike izvođenja

Planarna hromatografija

Hromatografija u koloni

Klasifikacija hromatografskih metoda

na osnovu tehnike izvođenja

Ispitivana smeša Vrsta hromatografije

Gasovi i isparljive supstance Gasna hromatografija

Supstance sličnog hemijskog tipa Podeona hromatografija

Supstance različitog hemijskog

tipa

Adsorpciona hromatografija

Neorganske i jonske supstance Jonoizmenjivačka hromatografija,

Hromatografija na tankom sloju i

papiru

Jonske od nejonskih supstanci Jonoizmenjivačka hromatografija,

Gel hromatografija

Biološki materijali i jedinjenja

velike molekulske mase

Gel hromatografija

4/16/2012

5

Nernstov zakon raspodele

K – koeficijent raspodele

cs – ravnotežna koncentracija

komponente u stacionarnoj fazi

cm – ravnotežna koncentracija

komponente u mobilnoj fazi

K zavisi od prirode komponente,

prirode jedne i druge faze (afiniteta)

temperature

m

s

c

cK

alnmobiA ⇄ stacionarA

Razdvajanje komponenata smeše

Metoda istiskivanja

Frontalna analiza

Eluiranje

4/16/2012

6

Metoda istiskivanja

Primenjuje se samo kod adsorpcione hromatografije

Komponente se adsorbuju po opadajućem afinitetu prema stacionarnoj fazi

kroz hromatografski sistem propušta se supstancija koja se adsorbuje jače od svih komponente smeše.

istiskuje najjače vezanu komponentu sa stacionarne faze i vezuje se na njeno mesto

istisnuta komponenta istiskuje sledeću, slabije vezanu komponentu, i proces istiskivanja se nastavlja kroz sistem.

komponente nikada nisu sasvim razdvojene, već napuštaju stacionarnu fazu po redosledu opadajućeg koeficijenta raspodele, ali uvek delimično pomešane sa susednom komponentom.

Metoda istiskivanja

Na vrh kolone nanese se mala zapremina smeše A,B,C

KONTINUIRANO SE PROPUŠTA rastvor D koji se

najjače adsorbuje.

A,B,C KD > KA > KB > KC

D potiskuje A, B, C, D

pa iz kolone prvo A

izlazi C, zatim B i na kraju A B C

Zone se ne mogu potpuno razdvojiti – samo kvalitativna analiza

4/16/2012

7

Frontalna analiza kontinualno propuštanje smeše kroz stacionarnu fazu

može se odvojiti samo prva komponenta (sa najmanjim koeficijentom raspodele) u relativno čistom stanju, dok se sve ostale komponente delimično mešaju sa susednim

Veoma retko se koristi

A,B,C KA > KB > KC

Iz kolone prvo izlazi čista komponenta C,

zatim smeša B i C

i na kraju smeša A, B i C

Eluiranje mala količina smeše se unese u kolonu, a zatim

se vrši kontinualno propuštanje mobilne faze

4/16/2012

8

Eluiranje

Na vrh kolone nanese se mala zapremina smeše A,B,C

KONTINUIRANO SE PROPUŠTA ČIST RASTVARAČ !!!

A,B,C KA > KB > KC

Iz kolone prvo izlazi C,

zatim B i na kraju A A

B

C

Zone se mogu potpuno razdvojiti – kvalitativna i kvantitativna

Najvažnija metoda koja se koristi u analitičke svrhe

TEORIJA HROMATOGRAFIJE

Komponenta A se raspodeljuje na deo koji se nalazi u stacionarnoj fazi cS i deo koji se nalazi u mobilnoj fazi cm.

Usled pomeranja mobilne faze deo komponente A migrira u smeru kretanja mobilne faze i narušava se uspostavljena ravnoteža.

4/16/2012

9

1. Teorija platoa

2. Teorija brzina

TEORIJA HROMATOGRAFIJE

32 16 16

16

16

8 8

8 8

8

8 8

8

4 4

8 8

4 4

4

4 8

8 4

4

2 2

6 6

6 6

2 2

2 6

6 6

6 2

2

2

4 4

6 6

4 4

1 1

1 1

4 6

6 4

4 1

1

1

1 4

a a’ b b’ c’

d’ e’

c

d e f

7

6

5

4

3

2

1

7

6

5

4

3

2

1

Teorija platoa

ms

m

s

cc

1c

cK

Mobilna

faza

Stacionarna

faza

*

*

4/16/2012

10

Teorijski plato se može definisati kao mali deo kolone u kome se

uspostavlja ravnoteža komponente izmeĎu stacionarne i mobilne faze,

pre nego što mala zapremina mobilne faze sa svojim delom rastvorene

komponente preĎe u susedni deo kolone, gde se proces ponavlja.

Posle 5 uravnoteživanja molekuli se tako raspodeljuju po platoima

da se dobija raspodela koja odgovara Gausovoj krivoj

4 4

8 8

4 4

c’

4 4

6 6

4 4

1 1

1 1

e’

Efikasnost kolone

sposobnost kolone da potpuno razdvoji komponente koje se

teško razdvajaju i srazmerna je broju teorijskih platoa u koloni

Visina ekvivalentna teorijskom platou – HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate )

N

LHETP

L – dužina hromatografske kolone

N – broj teorijskih platoa

Efikasnost kolone biće veća što je vrednost HETP manja.

4/16/2012

11

Teorija brzina

oblik krive raspodele zavisi od brzine eluiranja.

vCv

BAHETP

Van Deemter –ova jednačina v

- brzina mobilne faze

A, B i C faktori koji

doprinose širenju trake

Hromatografske metode

Apsorpciona hromatografija

Podeona (particiona)

hromatografija

Jonoizmenjivačka hromatografija

4/16/2012

12

Adsorpciona hromatografija

bP1

bPVV max

n

1

kPm

x

Zasniva se na adsorpciji komponenata smeše na čvrstom

adsorbensu

Mehanizam adsorpcije: Langmuirova (fizisorpcija)

Freundlichova (hemisorpcija)

adsorpciona izoterma

U zavisnosti od agregatnog stanja: G-Č i T-Č

1903 ruski botaničar Cvet je na koloni razdvojio sastojke

zelenog lišća (razdvojio je hlorofil od drugih pigmenata iz biljnog

ekstrakta uz CaCO3 kao adsorbens i petrol-etar/etanol kao mobilnu

fazu)

n

1

kcm

x

Adsorpciona hromatografija

Adsorbat adsorbovan

na površini

stacionarne faze - adsorbensa

4/16/2012

13

Adsorbesi i grupe koje se razdvajaju

Nepolarni Polarni

aktivni ugalj

organske soli

peptidi,

ugljeni hidrati

aminokiseline

Al-oksid

Mg–oksid

Mg-silikat

silika-gel

CaCO3

skrob

neorganska

jedinjenja, boje

steroli, estri,

gliceridi, alkaloidi

steroli,

aminokiseline

karotenoidi,

ksantofili

enzimi

Adsorpciona hromatografija

Adsorpciona hromatografija se izvodi u koloni koja je ispunjena adsorbensom.

Na vrh kolone nanosi se mala količina analizirane smeše, zatim se kroz kolonu vrši eluiranje čime se postiže razdvajanje komponenata.

Komponente smeše se selektivno adsorbuju na adsorbensu u zavisnosti

od koeficijenta raspodele.

4/16/2012

14

Tehnika izvoĎenja adsorpcione hromatografije

HROMATOGRAFIJA U KOLONI

Komponente A i B i C su razdvojene adsorpcionom hromatografijom.

Komponenta A ima manji koeficijent raspodele od komponente B,

a veći koeficijent raspodele od komponente C.

Koristeći sliku kolone ucrtati zone sa razdvojenim komponentama.

BmAmBsAsBA ccccKK

AmCmAsCsAC ccccKK

C

A B

4/16/2012

15

Particiona - podeona hromatografija G-T, T-T

Komponenta rastvorena

u tečnoj fazi koja je

vezana za čvrst nosač

PRINCIP

Različita rastvorljivost

komponenata smeše

izmeĎu dve tečne faze

( dva rastvarača

koji se ne mešaju)

I stacionarna faza

II mobilna faza

Koeficijent raspodele u podeonoj hromatografiji naziva se

PODEONI KOEFICIJENT K m

s

c

cK

UZLAZNA TEHNIKA

Rastvarač se kreće pod dejstvom kapilarnih sila;

zbog suprotnog dejstva gravitacije dolazi do zaustavljanja protoka rastvarača na određenoj visini

Za razdvajanje komponenata sa relativno velikim razlikama Rf vrednosti

SILAZNA TEHNIKA

Za razdvajanje komponenata koje imaju male, ili bliske Rf vrednosti

Rastojanje koje prelazi front rastvarača reguliše se dužinom podloge i visinom posude

HORIZONTALNA

(KRUŽNA) TEHNIKA

Tehnike izvođenja hromatografije na papiru ili tankom sloju

4/16/2012

16

Važne veličine u PODEONOJ HROMATOGRAFIJI

Pri HORIZONTALNOM PROTOKU

mobilne faze (rastvarača) (horizontalna tehnika) na molekule

rastvarača deluju samo kapilarne sile

k konstanta (zavisi od prirode sistema

( , i ) i T

t vreme za koje rastvarač pređe put z

RETENCIONI FAKTOR

(faktor zadržavanja),

Rf vrednost

IDENTIFIKACIJA KOMPONENTE

a pređeni put komponente

r pređeni put rastvarača

Rf veća, ako se komponenta

bolje rastvara u mobilnoj fazi

Dobro razdvajanje: Rf 0,05

2/1)(ktz

Kod uzlazne i silazne tehnike na

molekule mobilne faze pored kapilarnih

deluje i sila gravitacije koja smanjuje

ili povećava njihovu brzinu

Pređeni put rastvarača r

r

aR f

acavarrastputpredjeni

komponenteputpredjeniRf

– podeoni koeficijent

m

s

c

cK

)()()( CfBfAf RRR

CBA KKK

4/16/2012

17

Papirna hromatografija

Hromatografija na tankom sloju

Tehnike izvoĎenja particione

hromatografije

Izvođenje particione hromatografije

Mobilna faza – Rastvarač II i njegove zasićene pare

---------------------------------------------- Mala količina smeše (MRLJA)

----------------------------------------------

Stacionarna faza - Rastvarač I vezan za tanak sloj ili papir

Tanak sloj nema ulogu adsorbensa iako se koriste isti materijali kao kod adsorpcione hromatografije zbog porozne strukture i velike protočne moći (kapilarno prodiranje rastvarača).

Tanak sloj čvrstog adsorbenta ili papir nosač stacionarne faze

----------------------------------------------

Čvrst nosač – staklena ploča

4/16/2012

18

Komponente smeše, A i B, razdvojene su particionom hromatografijom

na tankom sloju u sistemu u kome stacionarnu fazu predstavlja voda (ε = 78,55),

a mobilnu fazu smeša etanola (ε = 24,35) i benzena (ε = 2,30).

Mobilna

faza

PreĎeni put

A

a (cm)

PreĎeni put

B

b (cm)

PreĎeni put

mobilne faze

r (cm)

etanol 5,5 3,5 6

benzen 4,2 0,2 6

Razdvajanje komponenata ponovljeno je dva puta sa

različitim sastavom mobilne faze:

benzen: etanol = 2 : 1

benzen : etanol = 1 : 2

Mobilna

faza

Pređeni put

A

a (cm)

Pređeni put B

b (cm)

Pređeni put

mobilne

faze

r (cm)

RfA RfB

1 5 3 6 0,833 0,500

2 5,2 4 6 0,866 0,667

Dobijene vrednosti dužina preĎenih puteva komponenti A I B i mobilne faze, i Rf vrednosti

1

2

4/16/2012

19

Mobilna

faza

Pređeni put A

a (cm)

Pređeni put B

b (cm)

Pređeni put

mobilne faze

r (cm)

RfA RfB

1 5 3 6 0,833 0,500

2 5,2 4 6 0,866 0,667

Sa promenom sastava mobilne faze Rf vrednost B se menja, jer je delimično rastvoran u

etanolu, pa kada je etanol dominantan rastvarač u mobilnoj fazi (2) i Rf vrednost je veća.

Voda je polarnija supstancija od benzena i etanola (ima veću vrednost

dielektrične propustljivosti, ) B se bolje rastvara u vodi, tj, u stacionarnoj fazi

i pokazuje manju Rf vrednost. B je polarnija supstanca od A

A se bolje rastvara se u rastvaračima sa manjom dielektričnom propustljivošću,

- u mobilnoj fazi

odnos benzena i etanola u mobilnoj fazi ne utiče znatno na njegovu Rf vrednost,

333,0500,0833,0)1(Rf

199,0667,0866,0)2(Rf

Povoljiniji sastav mobilne faze je sastava benzen : etanol = 2 : 1:

Komponente ispitivane smeše su dobro razdvojene u oba slučaja,

jer je razlika retencionih faktora, Rf uvek veća od 0,05.

Jonoizmenjivačka

hromatografija

Razdvajanje jonskih vrsta na

osnovu njihovog afiniteta ka

izmeni sa jonima funkcionalnih

grupa.

4/16/2012

20

Podela jonoizmenjivača

Neorganski

Organski

Umrežavanjem dobija se

smola koja na površini

mora imati funkcionalne

grupe.

prirodni sintetički

•zeoliti

•gline

•minerali

•oksidi

•kisele soli

viševalentnih

metala

•heteropoli

kiseline

prirodni sintetički

/ •polistiren

Podela jonoizmenjivača

katjonski anjonski amfoterni

-SO3H

-COOH

-SH

-OH

-NH2

-NHR

-NR2

sadrže i katjonske

i anjonske

funkcionalne grupe

Funkcionalna grupa se sastoji iz dva dela:

1. Fiksirani jon –kovalentno vezan za matricu smole R

2. Kontrajon – izmenjuje se sa jonima iz rastvora

R-SO3H + NaCl R-SO3Na + HCl

R-OH + NaCl RCl + NaOH

4/16/2012

21

Tehnika izvođenja jonoizmenjivačke

hromatografije

Suspenzija izmenjivača u vodi sipa

se u kolonu koja je delimično

napunjenu vodom (da ne uđe

vazduh)

višak vode se ispusti ali iznad smole

uvek mora postojati sloj tečnosti

Prečišćavanje izmenjivača

Prevođenje jonoizmenjivača u

željeni jonski oblik

Kapacitet jonoizmenjivača

Definicija:

- Broj funkcionalnih grupa po jedinici mase suvog

jonoizmenjivača

- Količina jednovalentnog jona u mmol koju može

da razmeni 1g suvog izmenjivača

4 mmolg-1 H+ jona - katjonski

4 mmolg-1 OH- jona - anjonski

m

cVC

V zapremina utrošenog titranta

c molarna koncentracija titranta

m odmerena masa smole

4/16/2012

22

LITERATURA

1. M. Aleksić, Teorija hromatografije skripta

2. V. Kuntić, M. Aleksić, N. Pejić, S. Blagojević, Praktikum iz fizičke hemije, Farmaceutski fakultet, Beograd 2010.