Procesamiento y conservación de muestras para Biobancos

El caso de Anatomía Patológica

Archivo de muestras en distintos formatos

1. A temperatura ambiente (varios tipos)

2. En congelación (con distintas opciones)

3. Cultivos celulares y almacenamiento en nitrógeno líquido de las células (-196ºC)

4. Muestras derivadas del Biobanco: obtención y archivo de ADN, ARN y PROTEÍNAS a partir de las muestras de tejidos

Archivo de muestras a temperatura ambiente

• Láminas con improntas (tejidos sólidos) y extensiones (tejidos líquidos)

• Bloques de parafina: una vez cumplidas las funciones diagnósticas, pueden ser usadas en proyectos de investigación (Archivo en Parafina: BIOBANCO)– Como sabéis: fijación adecuada en formalina tamponada,

deshidratación en alcoholes de grado creciente y xilol, e inclusión en moldes con parafina.

– En parafina: patologías inflamatorias y patologías tumorales (APOYO INVESTIGACIÓN EN CÁNCER: BANCO TUMORES)

Archivo de muestras en congelación

El Calar del Mundo (Albacete) diciembre de 2007

Bancos de Tumores

• ¿De qué forma asiste al Patólogo un TEAP del Banco de Tumores, cuando hay que congelar alguna muestra?,

• La congelación de muestras es habitual en los Bancos de Tumores:– ¿Cómo procesa el TEAP la muestra para su

congelación?

Muestras fijadas en formol

• Siempre “muestras excedentes de diagnóstico”

• Se evapora el formol• Se guarda el tejido en tubo y caja a -80ºC• Código del Banco de Tumores y Número de

Biopsia

Muestras “frescas”• Linfoides, actuaciones intraoperatorias (bordes de

resección): congelación• ¿Cuál es la mejor forma?

– En criomoldes, con OCT (medio denso) en presencia de ISOPENTANO muy frío

• Enfríado a su temperatura de congelación (-160ºC) (el mejor método si hay que congelar muchas muestras). Se sumerge el isopentano en nitrógeno líquido.

• Enfríado a –50ºC (baños “Histobath”).• Enfríado a –80ºC (Isopentano en congelador de –80ºC); (el

método más cómodo cuando se congela muestra a muestra). Nieve carbónica (hielo seco) como apoyo (-80ºC)

¿Por qué es el molde con OCT e ISOPENTANO la forma mejor?

• Porque permite hacer buenos cortes en congelación (criostato) y teñir con H-E o hacer estudios de IHC.

• Porque a partir de unos pocos cortes de criostato de 30um se puede obtener ADN, ARN y PROTEÍNAS, optimizando así el uso de las muestras (su duración)

• El ISOPENTANO congela rápido y homogéneamente• El OCT es criosolidificable y protege el tejido

¿Hay otras opciones de congelación en fresco?

• Sí, congelar en nitrógeno líquido, que es más rápido, y se hace, como sabéis los que trabajáis como Técnicos, para las muestras que esperan diagnóstico intraoperatorio.

• Pero el nitrógeno congela muy rápido el exterior y peor el interior del tejido (menos homogéneo que el isopentano)

Cultivos celularesAlmacenamiento en nitrógeno líquido

• Se pueden tomar un fragmento de tejido para luego disgregarlo y establecer un cultivo de células (cultivo primario)

• También se pueden separar células de mieloma y de leucemia de la sangre y almacenarlas en nitrógeno líquido (Tumores hematológicos)

Muestras derivadas del Biobanco

Obtención y archivo de ADN, ARN y Proteínas

• Las muestras fijadas en formol son buenas para ADN, peores para ARN y malas para proteínas

• Las muestras frescas congeladas en OCT e ISOPENTANO son buenas para ADN, ARN y proteínas

• Se puede obtener ADN, ARN Y PROTEÍNAS a partir de cortes de criostato, consiguiendo así:– OPTIMIZAR EL USO DE LOS TEJIDOS entregando a los

investigadores solicitantes de muestras, no el tejido, sino parte del ADN, ARN o PROTEÍNAS obtenidos.

– En el caso del ADN, pueden establecerse sub-bancos derivados, pues se obtiene suficiente cantidad para la investigación en curso y también para futuras investigaciones.

Calidad del ADN y del ARN

• Electroforesis en agarosa

El río que nos lleva

Pedro J. Benito, Angel Arriaga (Técnicos)

Dr. Enrique Poblet (Patólogo y Director Científico del Biobanco CHUA)

Anatomía Patológica Cirujanos Hematología Dermatología Análisis Clínicos

Cueva de los Chorros, Río Mundo