DETERMINACION DE METABOLITOS

- Diagnóstico bioquímico – clínico

- Seguimiento de una reacción enzimática por detección de metabolitos secundarios

Agosto 10, 2006

METABOLITOS A DETERMINAR:

•GLUCOSA

•COLESTEROL

•HDL / LDL

•TRIGLICERIDOS

•UREA

Glucosa

Oxidasa

D-glucosa + O2 ácido D- glucónico + H2O2

H2O2 + p-HBA + 4-AAP compuesto coloreado+ H2O peroxidasa

DETERMINACIÒN DE GLUCOSA POR PRUEBA ENZIMÀTICA

Prueba de Tolerancia a la Glucosa

Se puede evaluar la eficiencia del metabolismo de glucosa cuantificando los niveles de glucosa en sangre luego de una carga de glucosa oral. La tolerancia a la glucosa implica que luego de esta carga no se observe glucosa en la orina (glucosuria) y que la glucosa en sangre siga una curva típica a la largo del tiempo (ver figura).

Curva de Tolerancia Promediodespués de la ingestión de 100 g de glucosa

0

50

100

150

200

250

300

350

0 50 100 150 200

minutos después de la ingestión

glu

cosa

(m

g/d

L)

normal

daño hepático

diabetes ligera

diabetes severa

Las condiciones clínicas que pueden estar asociadas con un resultado anormal de tolerancia a la glucosa (fuera de la diabetes) son las siguientes:

1. Ingestión de carbohidratos disminuida en los días anteriores a la prueba

2. Insuficiencia hepática severa

3. Enfermedades crónicas con desnutrición (alcoholismo, uremia)

4. Inactividad física prolongada (más de 72 horas en cama)

5. Stress agudo (fiebre, trauma, cirugía mayor)

6. Enfermedades endocrinas (acromegalia, síndrome de Cushing, insulinoma, glucagonoma entre otras)

7. Uso de drogas

8. Sobrepeso (más de 20% sobre el peso ideal)

9. Trastornos gastrointestinales

 Blanco Estandar

M 1 M 2 M 3 M 4 M 5

Tiempo luego de ingesta de glucosa

    Basal 30 min 60 min 90 min 120min

Muestra     0.01mL 0.01mL 0.01mL 0.01mL 0.01mL

Estándar Glucosa   0.01mL          

Solución (G) 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL

TOLERANCIA A LA GLUCOSA

1.    Incubar a 37°C por 5 minutos o 10 minutos a Temperatura ambiente.2.    Leer absorbancia de las muestras a 505nm dentro de los primeros 30 minutos3.    Calcular la concentración de la glucosa en las muestras proporcionadas, según la siguiente fórmula: Concentración de Glucosa: Amuestra x Cestándar / Aestándar

 4.    Graficar la curva de tolerancia de glucosa con los datos obtenidos5.    Determinar el diagnóstico del paciente de la muestra según el grafico de la curva de tolerancia a la glucosa6.    Discutir los resultados DATO: El intervalo de referencia normal en suero es 70 mg/dL – 100 mg/dL

Tipos de lipoproteínasTipos de lipoproteínas

QuilomicronesQuilomicrones (Q)(Q)

VLDL (Lipoproteínas de muy baja densidad)VLDL (Lipoproteínas de muy baja densidad)

IDL (Lipoproteínas de densidad intermedia)IDL (Lipoproteínas de densidad intermedia)

LDL (Lipoproteínas de baja densidad)LDL (Lipoproteínas de baja densidad)

HDL (Lipoproteínas de alta densidad)HDL (Lipoproteínas de alta densidad)

Figura No.1 Estructura de una lipoproteína

Colesterol ester Colesterol + Acidos grasos

Colesterol ester

Hidrolasa

Colesterol + O2 colesterol-4-en-3-ona + H2O2

Colesterol

oxidasa

2 H2O2 + 4-AAP + p-HBA compuesto coloreado + 4H2O

peroxidasa

Determinación de Colesterol Total

El método para determinar el Colesterol Total consta de 3 reacciones acopladas:La enzima Colesterol Ester Hidrolasa, libera el colesterol de los esteres de colesterolEL colesterol liberado es oxidado por la Colesterol Oxidasa produciéndose péroxido de hidrógenoEl peroxido de hidrogeno, en presencia de la enzima Peroxidasa reacciona con el sistema cromogénico dando origen a un compuesto coloreado, que es leido en el espectofotómetro a 505nm.

Concentración de colesterol: Amuestra x Cestándar / Aestándar

Determinación de LDL-Colesterol

EL LDL-Colesterol (colesterol asociado a las lipoproteínas de baja densidad, LDL) es obtenido por precipitación selectiva del LDL mediante el uso de una solución de Heparina y Citrato de Sodio, quedando el colesterol asociado al HDL y VLDL en el sobrenadante. Por lo tanto la concentración de LDL-Colesterol precipitado se calcula obteniendo el diferencial entre el valor de Colesterol Total y el valor obtenido en el sobrenadante, el cual corresponde al Colesterol asociado a HDL y VLDL.

Calcular la concentración del colesterol en el sobrenadante: Abs muestra x factor Factor = 240 .

Absorb. Standard

Calcular la concentración del LDL colesterol, según la siguiente fórmula:

LDL colesterol (mg/dL) = Colesterol total - Colesterol en Sobrenadante

Determinación de Triglicéridos

Triglicéridos Glicerol + Acidos grasos Lipasa

Glicerol + ATP Glicerol-1-fosfato + ADP Glicerol kinasa

Glicerol 1-fosfato + O2 Dihidroxiacetonafosfato + H2O2 Glicerol-fosfato Oxidasa

2 H2O2 + 4-AAP + DCBS compuesto coloreado + 4H2O peroxidasa

Determinación de Urea

•

• CONH2CO + 2 H2O 2 NH3 + CO2 + H2O Ureasa

DETECCIÓN DE AMONIO EN LA REACCIÓN DE HIDRÓLISIS DE LA PIRAZINAMIDA (PZA),

POR MEDIO DE LA PRUEBA DE NESSLER.

• La hidrólisis de la Pirazinamida (PZA) por acción de la Pirazinamidasa puede ser observada/monitorizada de modo indirecto mediante la detección de amoniaco (NH3), un metabolito secundario de esta reacción.

• El amoniaco producido reacciona con el reactivo de Nessler, una solución alcalina de mercuri-yoduro de Potasio, K2HgI4, formando un precipitado de color pardo o amarillo. La fórmula de dicho precipitado no está bien definida, ha sido descrita como O:Hg2N.NH2.I por (Arthur I. Vogel, 1974), o también como NH2.Hg2.I3 (Nichols y Willits, 1934).

DETECCIÓN DE AMONIO EN LA REACCIÓN DE HIDRÓLISIS DE LA PIRAZINAMIDA (PZA), POR

MEDIO DE LA PRUEBA DE NESSLER.

Pirazinamida (PZA) 1 Acido Pirazinoico (POA) + 1 Amoniaco(NH3)

1 NH3 + [K2HgI4] + 8 KOH O:Hg2.NH2.I + 7 KI + 2 H20