UNIVERSIDAD DE ORIENTENCLEO BOLVAR ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUDDEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLGICASASIGNATURA: BIOQUMICA

PRCTICA N2SALADO" (SALTING OUT) DE PROTENAS, SU APLICACIN EN LA SEPARACIN Y DETERMINACIN DE ALBUMINA Y GLOBULINAS EN SUERO O PLASMA SANGUNEO.

PROFESOR:BACHILLERES:

Rafael Gonzlez.

Grupo Lunes A

CIUDAD BOLVAR, NOVIEMBRE 2012

INTRODUCCINLas protenas son macromolculas fsica y funcionalmente compleja, unas de las molculas mas abundantes en las clulas, constituyen un total de 50% de su peso y se encuentran en todas las partes de esta, tambin participan en procesos catalticos, es decir, aceleran reacciones. (Peter J. Kennelly, phD y Victor W. Rodwell, phD.)

En esta segunda practica utilizaremos la tcnica de SALTING OUT este es el mtodo mas utilizado para la separacin de protenas, se basa principalmente en que las protenas son menos solubles a altas concentraciones de sal, causando la precipitacin de las protenas. (Bioqumica: 3a edicin; Donald Voet, Judith G. Voet,Judith G. Voet).La multiplicacin de grupos acidos y bsicos de una protena hace que su solubilidad dependa de las concentraciones de las sales disueltas, la polaridad del solvente, el pH y la temperatura. Las distintas protenas varan en gran medida en sus solubilidades en un conjunto dado de de condiciones. Algunas protenas precipitan en condiciones en que otras aun estn bastante solubles. (Bioqumica: 3a edicin; Donald Voet, Judith G. Voet,Judith G. Voet)

La albumina es coagulable por el calor, los cidos minerales, el alcohol y el ter y es soluble en agua as como en soluciones diluidas de sal. Esta protena esta presente en tejidos animales como en claras de huevos, leche, el musculo y el plasma sanguneo. Por otra parte las Globulina tambin pertenece a las protenas sanguneas y se encuentra tanto en tejido animal como en el vegetal entre las ms importantes tenemos: la Seroglobulina (sangre), Lactoglobulina (leche), Ovoglobulina (huevos). La globulina es un componente muy importante en la sangre en especial en el plasma sanguneo y existen diferentes grupos de globulina como la globulina alfa 1, la globulina alfa 2, la globulina beta, la globulina gamma. (McKee T. y McKee J. Bioqumica. La base molecular de la vida.)

La presente practica se realiza con el objetivo de aplicar la tcnica Salting Out para separar la albumina del suero sanguneo, luego cuantificar las protenas totales y tambin de la albumina y globulinas en el suero a travs del mtodo colorimtrico de biuret, y la realizacin de una curva de calibracin la cual permitir determinar la concentracin de las protenas totales y albumina en el suero extrapolando los datos de la absorbancia obtenidos en el espectrofotmetro de los valores de la albumina y protenas totales con los valores de protenas a distintas concentraciones conocidas.RESULTADOSDespus de haber realizado todos los pasos y procedimientos indicados en la prctica, los resultados de la absorbancia obtenidos despus de la lectura con el espectrofotmetro a 540mu fueron los siguientes:N de TuboAbsorbancia

PTTubo X10,421

ALBUMINATubo X20,210

Tubo 30,081

Tubo 40,106

Tubo 50,279

Tubo 60,673

Tubo 70,0

Tabla 1. Datos no procesadosSeguidamente se realiz una curva de calibracin utilizando la lectura de los tubos 3, 4, 5 y 6. Dicha grfica se hizo de Absorbancia (eje Y) vs miligramos (mg) de protena (eje x). La absorbancia se obtuvo mediante las lecturas del espectrofotmetro, pero los miligramos se calcularon a partir de una serie de cuentas basadas en reglas de tres, las cuales se colocan y explican a continuacin: Cada tubo (del 3 al 6) contena una cantidad especfica de una solucin de protenas a una concentracin de 8mg/ml, es decir, por cada mililitro de la solucin hay 8mg de protena. Los tubos tenan las siguientes cantidades (en mililitros) de solucin de protenas a 8mg/ml: Tubo 3: 0,25ml de protena. Tubo 4: 0,50ml de protena. Tubo 5: 0,75ml de protena. Tubo 6: 1,00ml de protena.

Para el tubo 3:8mg PT _____1ml x= 8mg PT x 0,25ml/ 1ml x ___ 0,25ml x= 2mg Para el tubo 4:8mg PT _____1ml x= 8mg PT x 0,50ml/ 1ml x ___ 0,50ml x= 4mg

Para el tubo 5:8mg PT _____1ml x= 8mg PT x 0,75ml/ 1ml x ___ 0,75ml x= 6mg

Para el tubo 6:

8mg PT _____1ml x= 8mg PT x 1ml/ 1ml x ___ 1ml x= 8mg

Resumen de los puntos a graficar:N de TuboAbsorbanciaProtenas(mg)

Tubo 30,0812mg

Tubo 40,1064mg

Tubo 50,2796mg

Tubo 60,6738mg

Tubo 70,0

Tabla 2. Datos procesados

En la grafica se puede observar que los puntos no hacen una recta, pero se trazo la recta promediando los puntos. Tambin se confirma que la absorbancia es directamente proporcional a la concentracin de protenas, es decir, a mayor concentracin mayor ser la cantidad de luz absorbida por la sustancia. Luego se ubico en la curva de calibracin las respectivas absorbancias de los tubos X1 y X2, extrapolando los datos de dichos tubos para conocer la absorbancia de ellos.Este proceso se realiza para obtener las cantidades de albmina, globulina y protenas totales del suero humano que se est estudiando, entonces se dice que X1 representa las protenas totales y X2 representa la albmina.Los datos obtenidos fueron los siguientes: N de TuboAbsorbanciaProtenas

Tubo X1(protenas totales)0,421?

Tubo X2(Albmina)0,210?

Tabla 3. Datos de tubos X1 y X2 luego de extrapolar la absorbanciaAhora, ya al tener todos los datos, vamos a convertir dichos datos a una unidad distinta,g/dL g%, a travs de una serie de clculos matemticos que se llevarn a cabo a travs de reglas de tres:

Datos: 1. El tubo X1, contiene 0,5ml de suero con 9,5ml de Na2SO4 al 23%, para un total de 10ml de solucin inicial; de los cuales se extrajeron 2ml en un tubo para constituir el Tubo X1, cabe destacar nuevamente que esta muestra representa las protenas totales que hay en el suero.2. De ese tubo de 10ml de solucin inicial se extraen 4ml y se combinan con 2ml de ter, esta mezcla se centrifug a 1.500 r.p.m por 10 minutos, finalmente con una pipeta de volumtrica se extrajeron 2ml de la solucin que estaba al fondo del centrifugado (excluyendo la capa blanca de globulinas), esta ltima extraccin se coloc en tubo, el cual es nuestro tubo X2, esta representa las albminas del suero.De esta forma, se procede a los clculos:Protenas totales (X1):2ml solucin inicial (X1)_____?mg de protenas totales.10ml de solucin inicial_____ XX= (10ml x ?mg)/2mlX= ?mg de protenas totales.0,5ml de suero_____?mg de protenas totales.100ml de suero____ XX= (100ml x ?mg)/0,5mlX= ?mg de protenas totales5g/dL g% de protenas totales.(5000mg/1000mg/g= 5g)

Albmina (X2):2ml_____?mg de albmina10ml____ XX= (10ml x ?mg de albumina)/2mlX= ?mg de albmina en los 10ml de solucin inicial.0,5ml de suero____?mg de albmina100ml de suero____ XX = (100ml x ?mg)/0,5mlX= ?mg de albmina g/dL g% de albmina.(?mg/1000mg/g= 2,5g)

Obtenidos los g% de las protenas totales y de la albmina se pueden calcular los de la globulina, a travs de la siguiente frmula:

[Protenas totales] =[albmina] + [Globulina] [Globulina]= [Protenas totales] [albmina]Globulina= g% - g%

Globulina = g%

Para finalizar, se calcular la relacin entre la albmina y la globulina, a travs de la ecuacin:

Relacin A/G= A/GR A/G=

R A/G =

DISCUSIN DE RESULTADOSLa sangre humana es un tejido fluido que circula en los capilares, arterias y venas de todos lo vertebrados e invertebrados. En humanos esta constituida en un 45% por elementos formes (clulas y derivados de ellas) y el otro 55% por el plasma sanguneo. Entre sus funciones tenemos el transporta eloxgenodesde lospulmonesal resto del organismo, el transporte deanhdrido carbnicodesde todas las clulas del cuerpo hasta los pulmones, el transporte de los nutrientes contenidos en elplasma sanguneo, como glucosa, aminocidos, lpidos y sales minerales desde elhgado, procedentes delaparato digestivoa todas las clulas del cuerpo, transporte de hormonas, defiende el cuerpo, coagulacin de la sangre, homeostasis, respuesta a lesiones que producen inflamacin, entre otras. El plasma sanguneo esta constituido principalmente por suero sanguneo y fibringeno.En el suero sanguneo podemos encontrar protenas, como la albumina y las globulinas. Los valores normales de protenas en suero sanguneo segn la Biblioteca Nacional de Medicina de los EE.UU. MEDLINE PLUS, son los siguientes: Protenas totales: 6.4 a 8.3 g/dL Albmina: 3.5 a 5.0 g/dL Globulinas: 2,0 a 3,5 g/dL Alfa-1 globulina: 0.1 a 0.3 g/dL Alfa-2 globulina: 0.6 a 1.0 g/dL Beta globulina: 0.7 a 1.2 g/dL Gammaglobulina: 0.7 a 1.6 g/dLLos datos obtenidos en la prctica indican que se tienen niveles bajos tanto en los valores de protenas totales como en los valores de albmina. En los casos clnicos mas frecuentes las patologas causan un descenso de los niveles de protenas, albumina o globulinas, mientras que en escasos casos se presenta un aumento de dichos niveles. El valor de las protenas totales en suero sanguneo fue de 5g/dL, mientras que el valor normal es de entre 6,4 8,3 g/dL. Por lo tanto hay una disminucin de protenas totales presentes en la sangre, esto puede presentarse por muchas patologas, es mas frecuenta una disminucin que un aumento de estos valores, adems orinar muchas veces al da, deshidratacin, defecar en exceso, causan generalmente un aumento de los valores de las protenas, ya que disminuyen los niveles acuosos del organismo aumentando las concentraciones de las protenas. Caso contrario, tomar mucha agua, no orinar, no defecar, alimentarse inadecuadamente, puede causar una deficiencia de protenas en la sangre. Entre las principales patologas que causan un descenso de los valores normales de protenas totales tenemos: Desnutricin: Es una afeccin que ocurre cuando su cuerpo no recibe los nutrientes suficientes. Sus posibles causas son: dieta inadecuada o balanceada, problemas con la digestin o la absorcin, o por ciertas afecciones mdicas. Entre los sntomas generales se pueden mencionar fatiga, mareo y prdida de peso. En cuanto al tratamiento, ste consiste en la reposicin de los nutrientes que faltan, tratar los sntomas en la medida de lo necesario y cualquier afeccin subyacente.

Sndrome Nefrtico: Es un grupo de sntomas que abarca protena en la orina (que excede 3.5 gramos por da), bajos niveles de protena en la sangre, niveles altos de colesterol e hinchazn. La orina puede contener tambin grasa que se puede observar bajo el microscopio. El sndrome nefrtico es causado por diversos trastornos que producen dao renal, particularmente la membrana basal del glomrulo, lo cual ocasiona de inmediato excrecin anormal de protena en la orina. Entre los sntomas tenemos: hinchazn (edema) general alrededor de los ojos, en las extremidades, especialmente en los pies y los tobillos, abdomen inflamado, apariencia espumosa en la orina, aumento de peso (involuntario) por retencin de lquidos, poco apetito e hipertensin arterial. Los medicamentos corticosteroides, inmunodepresores, antihipertensivos y diurticos pueden ayudar a controlar los sntomas. Asimismo, se puede necesitar antibiticos para controlar las infecciones. Los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) pueden reducir significativamente el grado de prdida de protena en la orina y, por lo tanto, frecuentemente se prescriben para el tratamiento del sndrome nefrtico.

Enteropata por prdida de protenas gastrointestinal: es una prdida anormal de protenas del tubo digestivo o la incapacidad de ste para absorber las protenas.Los sntomas pueden abarcar diarrea, fiebre y dolor abdominal. El tratamiento consiste en curar la afeccin que ocasion la enteropata perdedora de protenas.

Hemocromatosis: enfermedad asociada con un recuento de la protena de la sangre baja. Segn el Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades renales o NIDDK, hemocromatosis es el tipo ms comn de enfermedad de sobrecarga de hierro. Hemocromatosis hace que el cuerpo absorber y almacenar cantidades excesivas de hierro. Demasiado hierro en los rganos del cuerpo puede causar dao a los rganos importantes. Existen dos tipos principales de hemocromatosis: primaria y secundaria. Hemocromatosis primaria, tambin conocido como la hemocromatosis hereditaria, es un trastorno hereditario, Considerando que la hemocromatosis secundaria es causada por otras condiciones, tales como la anemia y el alcoholismo. Signos y sntomas asociados con hemocromatosis comunes incluyen los niveles de albmina de suero baja, dolor en las articulaciones, dolor abdominal, fatiga, disminucin de la libido, enfermedad heptica, problemas de pncreas, anomalas cardacas, deficiencia de tiroides y trastornos de la glndula suprarrenal.

Enfermedad de Wilson: trastorno hereditario asociado con un recuento de la protena de la sangre baja. Tambin conocido como la degeneracin hepatolenticular, implica la acumulacin de cantidades excesivas de cobre en el hgado, el cerebro y otros rganos. El cobre es importante para el desarrollo de los nervios, huesos, colgeno y melanina o el pigmento en la piel. En la mayora de las personas, cualquier exceso absorbido por el cuerpo de cobre se excreta a travs de la bilis, una sustancia generada en el hgado y se almacena en la vescula. Segn MayoClinic.com, si no se trata, la enfermedad de Wilson puede ser fatal. Signos y sntomas asociados con la enfermedad de Wilson comunes incluyen disminucin de albmina, torpeza, depresin, dificultad para hablar, caminar o ingestin, babeo, fatiga, dolor en las articulaciones, prdida de apetito, erupciones, hinchazn de los brazos o las piernas y la ictericia.La albmina es la protena ms abundante en el plasma. La albmina es la protena ms abundante del plasma y es producida exclusivamente por el hgado. En el organismo hay aproximadamente 500 g de albmina, con una produccin diaria de 15 g, que puede aumentar al doble cuando hay prdidas y el hgado funciona normalmente.La hipoalbuminemia (disminucin de los niveles plasmticos de albmina) puede ser signo de un dao heptico crnico. Sin embargo, la disminucin de la albmina no es especfica de las enfermedades hepticas.Los valores resultantes de la Albumina en la prctica fueron de 2,5g/dL, siendo los valores normales de entre 3,5 5,0 g/dL, se tiene una disminucin de albumina en el suero sanguneo, una hipoalbuminemia. Algunos de los sntomas y efectos secundarios de la hipoalbuminemia son los siguientes: Es posible que no tenga ningn sntoma, a menos que los niveles de albmina en sangre sean muy bajos. En este caso, es posible que no est comiendo bien. Puede tener inflamacin de todo el cuerpo o una parte del mismo (como las piernas) Puede tener debilidad muscular, fatiga o calambres Es posible que tenga poco apetito y no est comiendo bien. An personas que ingieren muchas protenas en su dieta pueden tener niveles bajos de albmina en la sangre. Si tiene problemas en el hgado que pueden haber causado su hipoalbuminemia, notar su abdomen distendido con fluidos (llamado ascites).La hipoalbuminemia puede ser causada por diversos factores o patologas, las principales son las siguientes: Despus de una ciruga para bajar de peso. Dietas bajas en protenas. Quemaduras (extensas). Enfermedad de Crohn: Es una forma de enfermedad intestinal inflamatoria (EII) que afecta por lo regular a los intestinos, pero puede ocurrir en cualquier parte desde la boca hasta el extremo del recto (ano).Los principales sntomas de la enfermedad de Crohn son dolor abdominal (rea del vientre) con clicos, fiebre, fatiga, inapetencia, dolor con las deposiciones (tenesmo), diarrea acuosa y persistente.Actualmente la enfermedad de Crohn no es curable, pero s controlable, y la mayora de las personas pueden hacer una vida normal. Espre (celiaqua): Es una enfermedad que daa el revestimiento del intestino delgado e impide la absorcin de partes de los alimentos que son importantes para permanecer saludables. El dao se debe a una reaccin por ingerir gluten, el cual se encuentra en el trigo, la cebada, el centeno y posiblemente la avena. Los sntomas gastrointestinales abarcan dolor abdominal, distensin, gases o indigestin, estreimiento, disminucin del apetito (tambin puede aumentar o permanecer inalterable), diarrea, sea constante o intermitente, intolerancia a la lactosa, nuseas y vmitos. La celiaqua no se puede curar. Sin embargo, los sntomas desaparecern y las vellosidades en el revestimiento de los intestinos sanarn si usted sigue unadieta libre de glutende por vida. No consuma alimentos, bebidas ni medicamentos que contengan trigo, centeno, cebada o posiblemente avena. Enfermedad de Whipple: Es una rara afeccin que le impide al intestino delgado absorber los nutrientes en forma apropiada. Esto se denomina malabsorcin. Los sntomas generalmente comienzan de manera lenta. El dolor articular es el sntoma inicial ms comn. Luego empieza el dolor abdominal, diarrea, fiebre, coloracin de la piel marrn griscea, prdida de la memoria, prdida de peso, etc. Las personas con la enfermedad de Whipple necesitan tomar antibiticos por tiempo prolongado para curar cualquier infeccin del sistema nervioso central y del cerebro. Se administra un antibitico llamado ceftriaxona a travs una vena, seguido de otro antibitico, como trimetoprima con sulfametoxazol, que se toma por va oral hasta por un ao. Enfermedad de Wilson (descrita anteriormente) Cirrosis heptica: Es la cicatrizacin y el funcionamiento deficiente del hgado: la fase final de la enfermedad heptica crnica.Los sntomas pueden presentarse gradualmente y tambin es posible que no se presenten, entre ellos tenemos, confusin o problemas para pensar, impotencia, prdida del inters sexual y desarrollo de mamas en los hombres (ginecomastia), inapetencia, nuseas y vmitos, hemorragia nasal o encas sangrantes, heces de color plido o color arcilla, entre otros. Todos los pacientes con cirrosis se pueden beneficiar de ciertos cambios en el estilo de vida, incluyendo la suspensindel consumo de alcohol., limitar la sal en la dieta, consumir una alimentacin nutritiva, hacerse vacunar contra la influenza, la hepatitis A y B, y la neumona por neumococo (si el mdico la recomienda).

Sndrome nefrsico (nefrtico): Se refiere a la prdida de albmina por el rin, frecuentemente secundario a diabetes mellitus. El sndrome nefrtico habitualmente se acompaa de elevaciones marcadas de los lpidos sanguneos y niveles variables de insuficiencia renal.

Enfermedades crnicas: Cualquier enfermedad crnica con compromiso nutricional puede asociarse a hipoalbuminemia, por ejemplo neoplasias, insuficiencia cardiaca y enfermedades intestinales entre otras.En cuanto a un aumento en la concentracin de albumina en la sangre, no se han descrito enfermedades especficas que se asocien a niveles elevados de albmina, por lo que su hallazgo en exmenes de rutina no es indicador de anormalidad, sino ms bien es un hallazgo relativamente frecuente en personas jvenes bien nutridas.

A continuacin se presenta una lista de las principales patologas que causan una disminucin o aumento de los distintos tipos de globulinas:

El aumento de las protenas alpha-1 globulina puede indicar:

Enfermedad inflamatoria crnica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES) Enfermedad inflamatoria aguda Malignidad

La disminucin de las protenas alfa-1 globulinas pueden indicar:

Deficiencia de alfa-1 antitripsina

El aumento de las protenas alfa-2 globulinas puede indicar:

Inflamacin aguda Inflamacin crnica

La disminucin de las protenas alfa-2 globulinas puede indicar:

Hemlisis

El aumento de las protenas beta globulinas puede indicar:

Hiperlipoproteinemia (por ejemplo, hipercolesterolemia familiar) Terapia de estrgenos

La disminucin de las protenas beta globulinas puede indicar:

Trastorno de coagulacin congnito Coagulopata de consumo Coagulacin intravascular diseminada

El aumento de las protenas gama globulinas puede indicar:

Mieloma mltiple Enfermedad inflamatoria crnica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES) Hiperinmunizacin Infeccin aguda Macroglobulinemia de Waldenstrom Enfermedad heptica crnica

CONCLUSIONEl suero humano es la parte liquida de la sangre, es de color amarillo claro que se obtiene despus de la eliminacin del coagulo de fibrina y otros elementos celulares. Es muy importante al momento de estudiar las concentraciones totales de protenas, y de albuminas y globulinas presentes en ella. Durante su estudio en la prctica de laboratorio a travs de su anlisis se obtuvieron valores inferiores en las concentraciones de protenas totales de (5g/dL) siendo su rango normal de (6.4 a 8.3 g/dL). Los niveles inferiores a los normales pueden deberse a: Enfermedad heptica, Desnutricin, Enteropata por prdida de protenas.Mientras que las concentraciones de albumina obtenidas, fueron muy bajas de (2,5 g/dL). Es decir que este valor esta por debajo de su valor normal de (3,5 a 5,0 g/dL). La albumina es sintetizada en el hgado as que una disminucin de ella puede ser producto de: Cirrosis heptica, o Enfermedades genticas, Trastornos intestinales. A diferencia de las globulinas sus concentraciones encontradas fueron normales de (2,5 g/dL). El estudio del suero humano es de gran importancia por que no solo contiene anticuerpos que combaten a los organismos que producen enfermedad, si no que tambin permite que las protenas totales presentes en ella puedan separarse en dos grandes grupos las albuminas y globulinas. La albmina es la protena de mayor concentracin en la sangre, transporta muchas molculas pequeas (bilirrubina, progesterona, y medicamentos), y tiene tambin la funcin de mantener la presin sangunea ya que favorece la presin osmtica coloidal para mantener lquidos en el torrente sanguneo y que no pasen a lostejidos, manteniendo un equilibrio. Por su parte las globulinas son un importante componente de la sangre, especficamente del plasma, se dividen en varios grupos: globulinas alfa 1 y 2, globulinas beta,globulinas gamma. La determinacin de protenas totalesserealizaparaevaluarlaposible presenciadeenfermedades nutricionales, estado nutricional tras intervenciones de ciruga, o enfermedades del rin o del hgado, o bien que el cuerpo no absorba bien suficientes protenas.

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