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SAMBUCUS NIGRA (Sabugueiro) OPERAÇÕES UNITARIAS EM BIOTECNOLOGIA Alba Escalera Balsera 21799015 David Lemos 20140205 Inés Morales Torrella 217990011

SAMBUCUS NIGRA (Sabugueiro) - SoS Valor · SAMBUCUS NIGRA (Sabugueiro) OPERAÇÕES UNITARIAS EM BIOTECNOLOGIA Alba Escalera Balsera 21799015 David Lemos 20140205 Inés Morales Torrella

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  • SAMBUCUS NIGRA (Sabugueiro)

    OPERAÇÕES UNITARIAS EM BIOTECNOLOGIA

    Alba Escalera Balsera 21799015

    David Lemos 20140205

    Inés Morales Torrella 217990011

  • Índice Introdução .................................................................................................................. 2

    Planta ..................................................................................................................... 2

    Compuestos fenólicos ............................................................................................. 4

    Extracção ................................................................................................................ 7

    Objetivos .................................................................................................................... 8

    Procedimento ............................................................................................................. 9

    Humidade das matrizes vegetais – método gravimétrico ........................................ 9

    Determinação do teor de compostos fenólicos nos extratos ................................. 10

    Determinação da atividade antioxidante ............................................................... 11

    Resultados e discussão .............................................................................................. 11

    Estudo do efeito da composição do solvente de extração ..................................... 12

    Estudo do efeito do tempo de extração ................................................................ 12

    Estudo da razão materia-prima:extrato ................................................................. 13

    Conclusão ................................................................................................................. 14

    Bibliografia ............................................................................................................... 15

    Anexo 1 .................................................................................................................... 17

    Protocolos ............................................................................................................ 17

  • Introdução

    Planta

    Classificação botánica Sambucus nigra, comúnmente conocido por saúco es un

    arbusto muy conocido por los humanos desde hace miles de años. Esta especie es nativa de Europa, noroeste de África y sudoeste de Asia(RÍO, 2012). Antiguamente se usaba para ser consumido como alimento y también para usos medicinales. Hoy en día se sigue consumiendo principalmente sus frutos ya que contienen sustancias bioactivas de un gran interés nutricional como compuestos fenólicos, flavonoides, vitaminas, carotenoides, minerales, etc.

    Su clasificación botánica es la siguiente:

    Reino: Plantae

    División: Magnoliophyta

    Clase: Magnoliopsida

    Orden: Dipsacales

    Familia: Adoxaceae

    Género: Sambucus

    Especie: S. nigra

    Produção Nacional e Mundial Portugal é um dos principais países produtores de

    sabugueiro Sambucus nigra na Europa. A nossa produção centraliza-se principalmente na região do Vale do Varosa e Távora, no concelho de Tarouca (BARBOSA, 2015; CARDOSO, 2008; CERDEIRA, 2010; FARIA, 2015). A produção do fruto tem vindo a aumentar nos últimos anos, visto que em 1998 produziam-se cerca de 640 toneladas (COELHO, 2003), em 2007 atingiu-se valores na ordem das 900 toneladas (CARDOSO, 2008) e em 2014 obteve-se uma produção de 3500 toneladas (BARBOSA, 2015; FARIA, 2015), sendo visível um aumento enorme nos últimos anos.. Uma grande parte da produção é exportada maioritariamente para a Alemanha, onde apreciam bastante este produto, pois as caraterísticas de grau brix e da cor principalmente são superiores comparadas com os produtos de outros países europeus, tais como a Hungria, Polónia, Roménia, Áustria, entre outros (BARBOSA, 2015; FARIA, 2015).

    No resto do mundo não se encontram dados muito concretos dos diferentes países produtores, mas é possível saber que a Áustria é um dos grandes produtores mundiais, com cerca de 8000 toneladas por ano e a aumentar (BADENES e BYRNE, 2012; KILHAM, 2010). Os Estados Unidos também são produtores, mas não há muita informação sobre a produção total, apenas havendo referência à quantidade de fruto utilizado num inquérito realizado em 2001 a fabricantes de geleias e compotas e a produtores de vinho de sabugueiro em diferentes Estados, que foi de 40000 toneladas por ano.

    Figura 1 -Ilustración de los diferentes componentes de S. nigra.

    Disponible en: http://www.pfaf.org/user/Plant.aspx?LatinName=Sambucus+nigra

  • É um mercado em expansão de um produto cada vez mais utilizado e apreciado especialmente na europa, mas também pelo resto do mundo.

    Principais aplicações A planta denominada sabugueiro (Sambucus nigra) tem diversos usos e aplicações em

    diferentes áreas, indústrias e com fins diferentes, devido à sua composição química e às excelentes caraterísticas que os seus constituintes possuem, permitindo uma grande variedade de aplicações. Quase todas as partes da planta são usadas, incluindo a própria madeira, usada para o fabrico de pequenos objetos como pentes, espetos de madeira, instrumentos matemáticos (Enescu et al., 2016) e também para alguns instrumentos musicais (CARDOSO, 2006). As outras partes da planta usadas são aplicadas em diferentes áreas. Na alimentação tem imensos usos, principalmente o fruto. O fruto é utilizado para aromatizar bebidas ou alguns alimentos (ENESCU et al., 2016; VIAPIANA e WESOLOWSKI, 2017) e também é utilizado como corante (CARDOSO, 2006). É possível também fazer geleias, compotas, licores e vinho(CARDOSO, 2006; ENESCU et al., 2016; RÍO, 2012; SENICA et al., 2017; VIAPIANA e WESOLOWSKI, 2017). O fruto é usado como suplemento dietético (HO et al., 2017; VIAPIANA e WESOLOWSKI, 2017) devido principalmente à atividade antioxidante e diurética quando misturado com outros frutos silvestres (RÍO, 2012).

    Em termos de aplicações farmacêuticas e medicinais (tradicional ou convencional) são principalmente usadas as folhas, flores e os frutos. Todos estes componentes tem constituintes que apresentam excelentes bioatividades tais como anti-inflamatórias, antivirais, antialérgicas, anti carcinogénicas, vaso-protetoras, antioxidantes, antirreumáticas, galactogénias, diuréticas, entre muitas outras (RÍO, 2012; VIAPIANA e WESOLOWSKI, 2017). É usada na prevenção e tratamento de várias doenças como cancro, doenças cardíacas, diabetes, doenças respiratórias, dores neuropáticas, arteriosclerose, gota, conjuntivites, dermatoses, alergias e também simples queimaduras, urticárias e feridas ou cortes(CARDOSO, 2006; ENESCU et al., 2016; HO et al., 2017; RÍO, 2012; SENICA et al., 2017; VIAPIANA e WESOLOWSKI, 2017).

    Na cosmética utilizam-se as flores e as bagas para o fabrico de perfumes. Fazendo infusões das folhas é possível obter loções usadas para cremes contra rugas e amaciadores, e até quando são feitas com vinho ou vinagre é possível usar a solução para escurecer o cabelo (CARDOSO, 2006).

    Por fim a planta pode ser utilizada também como inseticida (RÍO, 2012), para a alimentação animal, para controlar a erosão de solos ou simplesmente como um arbusto ornamental(ENESCU et al., 2016).

    Composiçao química

    Como alimento se consumen principalmente los frutos que tal y como hemos mencionado antes son una reserva de compuestos de gran interés nutricional, aunque las flores también contienen importantes metabolitos secundarios y primarios.

    Como metabolitos primarios en los frutos como

    en las flores de Sambucus nigra podemos encontrar varios azúcares y ácidos orgánicos. Los azúcares más

    Figura 2 - Imagen de las bayas de S. nigra.

    Disponible en: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/3b/Sambucus_nigra_0004.JPG

  • abundantes son la fructosa y la glucosa y en menos cantidades sacarosa(SENICA et al., 2017).

    Los ácidos orgánicos que se encuentran en los frutos de S.nigra son los siguientes: ácido cítrico, málico, fumárico, tartárico e isocítrico.

    También contiene proteínas (glicoproteínas), minerales como calcio, fósforo, hierro, potasio y magnesio y vitaminas, entre las cuales se encuentran: C, B1, B2 y B6 (LOSADA, 1998).

    Como metabolitos secundarios los frutos del saúco son principalmente conocidos por tener altos contenidos de antocianinas, que pertenecen al grupo de los flavonoides. Las principales antocianinas presentes son cinco y son las siguientes (LEE e FINN, 2007):

    1) cianidin-3,5-diglucósido 2) cianidin-3-glucósido 3) cianidin-3-glucosa 4) cianidin-3-sambubiósido 5) cianidin-3-sambubiósido-5-glucósido Como otros compuestos fenólicos más complejos también se encuentran

    hiperósido, isoquercetina y rutósido. Se encuentran también compuestos volátiles más comunes: damascenona,

    fenilaceltaldehido, 2-feniletanol, metil-nundecanoato, etil-5-decanoato, metil-n-dodecanoato, vainillina, hexanal, hexanol y hexenol, y terpenos como linalool y citral (RÍO, 2012).

    Compuestos fenólicos

    Descripción general

    Los compuestos fenólicos o fenoles son compuestos orgánicos que tienen al menos un grupo fenol en sus estructuras moleculares, es decir, un anillo aromático unido como mínimo a un grupo funcional. Generalmente son sintetizados por dos vías: la ruta del ácido shikímico o la vía del ácido malónico.

    Los compuestos fenólicos de las plantas son un grupo muy heterogéneo, existen más de

    10.000. Algunos de ellos son solubles en solventes orgánicos, otros son glucósidos o ácidos

    carboxílicos, por tanto solubles en agua, y otros son polímeros muy grandes e insolubles.

    Proporcionan funciones esenciales en el crecimiento y reproducción de las plantas;

    actúan como mecanismos de defensa contra patógenos, parásitos y depredadores; así como

    contribuyen al color de las plantas. Además, se está investigando que los compuestos fenólicos

    que son abundantes en verduras y frutas juegan un papel importante como agentes

    quimiopreventivos.

    En el caso de Sambucus nigra, sus característicos compuestos fenólicos son los que le otorgan las aplicaciones explicadas anteriormente. Dichos compuestos fenólicos son aceites esenciales, ácidos fáticos libres, flavonoides y sus glicósidos, ácidos fenólicos, carotenoides, vitaminas y minerales. Los principales metabolitos secundarios son los ácidos fenólicos, flavonoides y antocianinas. Estos compuestos fenólicos, no las antocianinas, tienen actividades

  • potencialmente antioxidantes tanto in vivo como in vitro debido a sus propiedades reductoras (VIAPIANA e WESOLOWSKI, 2017).

    Ácidos fenólicos Los ácidos fenólicos son el grupo mayor de compuestos fenólicos, muy presentes en el

    reino vegetal. Como se muestra en la Fig. 1, los ácidos fenólicos predominantes incluyen los ácidos hidroxibenzoicos (por ejemplo, el ácido gálico, el ácido p-hidroxibenzoico, el ácido protocatecuico, el ácido vanílico y el ácido siríngico) y los ácidos hidroxicinámicos (por ejemplo, el ácido caféico, el ácido p-coumárico, el ácido clorogénico y el ácido sinápico). Los ácidos fenólicos naturales, tanto libre como en formas conjugadas, normalmente aparecen como ésteres o amidas. Debido a su estructura similar, muchos otros polifenoles son considerados como ácidos fenólicos análogos; como la capsaicina, ácido rosmarínico, gingerol, paradol, tirosol, hidroxitirosol, ácido elálgico, cirina y ácido salvianólico B (Fig. 1).

    El ácido gálico está ampliamente distribuído en hierbas medicinales. Otro ácidos hidroxibenzóicos también se encuentran en hierbas medicinales y plantas para dieta. Los ácidos ferúlico, cafeico y p-coumárico están presentes en muchas hierbas medicinales y especies dietéticas, frutas, verduras y cereales. El salvado de trigo es una buena fuente de ácidos ferúlicos. Libre, soluble-conjugado y unido a ácidos ferúlicos en cereales están presentes en el ratio de 0,1:1:100. Los frutos rojos son ricos en ácidos hidroxicinámicos (ácido cafeico, ferúlico y p-coumárico) y en p-hidroxibenzóicos, ácido elágico, el cual contribuye a la actividad antioxidante. Los ácidos clorogénicos son el éster del ácido caféico y son el sustrato para la oxidación enzimática llevando al colorante, especialmente en manzanas y patatas.

    El ácido salvianólico B es el mayor ácido polifenol soluble en agua extraído de Radix salviae miltiorrhizae, la cual es una hierba medicinal clínicamente utilizada como agente antioxidante desde hace cientos de años en China. Hay 9 grupos de hidroxilos fenólicos activados que pueden ser responsables de la liberación del hidrógeno activo para el bloqueo de la reacción de peroxidación lipídica. El ácido rosmarínico es un componente fenólico antioxidante, el cual se encuentra en muchas de las especias dietéticas. El gingerol, es una sustancia fenólica, es responsable del gusto picante del jengibre (HUANG, CAI e ZHANG, 2010).

    En Sambucus nigra, los compuestos fenólicos poseen varias actividades biológicas, como antiinflamatorias, antivirales, antialérgicas, vasoprotectoras y anticancerígenas. Además, estudios recientes han revelado las propiedades beneficiosas del ácido clorogénico (CGA), las cuales son antioxidativas, hepatoprotectoras y hipoglicémicas. Por otra parte, el ácido gálico (GA) promete poder ser en un futuro un buen compuesto en el tratamiento del Alzheimer debido a su actividad antioxidante. También el ácido rosmarínico tiene algunas actividades biológicas, como son la inhibición del HIV-1, la antitumoral y antihepática (VIAPIANA e WESOLOWSKI, 2017).

    Flavonoides Los flavonoides son un grupo de más de 4.000 compuestos fenólicos que se sintetizan

    naturalmente en las plantas. Estos compuestos normalmente tienen como esqueleto básico la estrucutura del fenilbenzopirona (C6-C3-C6), la cual consiste en 2 anillos aromáticos (anillos A y B) unidos por 3 carbonos, los cuales normalmente se encuentran en un anillo pirano central oxigenado. Se pueden clasificar como flavones (estructura básica, anillo B unido a la posición 2), flavonoles (tienen un grupo hidroxilo en la posición 3), flavanones (dihidroflavones) y flavanolones (dihidroflavonoles; la unión 2-3 es saturada), flavanoles (flavon-ols y flavon-3,4-dioles; el anillo de C es un 1-pirano), antocianinas (antocianidinas; el anillo de C es un 1-pirano, y las uniones 1-2 y 3-4 son insaturadas), chalcones (el anillo de C es abierto), isoflavonoides (la

  • mayoría isoflavones; el anillo B está unido a la posición 3), neoflavonoides (el anillo B está unido a la posición 4), y biflavonoides (dímeros de flavones, flavonoles y flavanones) (se puede observar la estructura de dichos grupos o subgrupos en la Fig. 2). En la naturaleza, los flavonoides pueden estar juntos ambos en libertad o en formas conjugadas y, a veces, en plantas son mayormente presentados como glicósidos con un molécula de azúcar o más de una molécula de azúcar unidas por un grupo OH (O-glicósidos) o a través de uniones carbono-carbono (C-glicósidos); pero muchos flavonoides son presentes como agliconas. Más de 80 azúcares diferentes han sido descubiertos unidos a flavonoides, la mayoría están unidos a los glucósidos comunes como son la glucósida, glucorónido, galactósido, arabinósido, rhamnósido, apiosilglucósido y malonil (Fig. 2).

    Los diferentestipos de flavoides están presentes en prácticamente todas las plantas dietéticas, como frutas y verduras, y también se encuentran en la mayoría de hierbas medicinales. Los flavones más comunes son la luteolina, apigenina, baicaleina y sus glucósidos. Las principales fuentes, en el caso de plantas comestibles, son perejil, tomillo, cerezas, té, aceitunas, brócoli y legumbres. La quercitina, kaempferol, miricetina, morina, galangina y sus glicósidos son los principales flavonoles. En el caso de las comidas, las fuentes de flavonoles son cebollas, cerezas, manzanas, brócoli, tomate, bayas, té, vino tinto, alcaravea, comino y alforfón; también se encuentrar en muchas hierbas medicinales asociadas a anticancerígenos, por ejemplo, las flores de Sophora japónica y Rosa chinensis, las partes aéreas de A. anuua, los rizomas de Alpinia officinarum y las frutas de Crataegus pinnatifida. Dentro de estos flavonoles más comunes, la queracitina es uno de los flavonoides mayoritarios. Algunos ejemplos de flavanones son naringenina, hesperidina y eriodictiol y sus glicósidos. Los flavanoles son catequina, epicatequina, epigalocatequina, galato epicatequina (ECG) y galato epigalocatequina (EGCG). Dentro de antocianinas se incluyen antocianidinas y sus glicósidos. Algunos de los chalcones son buteína, phloretina o carthamina. Los isoflavones son daidzeina, genisteína, gliciteína, formonentino y sus glicósidos. Por último, los biflavonoides son dímero de flavonoides conectados por C-C o C-O-C (HUANG, CAI e ZHANG, 2010).

    Concretamente en Sambucus nigra, el hiperósido le otorga propiedades diuréticas y antibacterianas. La isoquercetina es utilizada en tratamientos para el cáncer de riñón y el carcinoma renal, entre otros. Por último, el rutósido es un antioxidante y potente inhibidor de la angigénesis, así como inhibidor de algunos tipos de cáncer; su modo de actuación es con la ligación del ión Fe2+, previniendo su enlace al peróxido de hidrógeno, lo que formaría un radial libre muy reactivo que podría dañar las células (VIAPIANA e WESOLOWSKI, 2017).

  • Figura 3 - Estruturas dos grupos/subgrupos de flavonoides.

    Extracção El proceso de extracción sirve para separar uno o más componentes contenidos

    en una fase sólida a través de una fase líquida o disolvente. En una extracción sólido – líquido convencional participan 3 componentes:

    1) Soluto: Es el componente que se transfiere de la fase sólida a la líquida y suele ser el componente de interés.

    2) Sólido inerte: parte del sistema que es insoluble en el solvente. 3) Solvente: Es el componente líquido que entra en contacto con la fase sólida y

    de esta manera extrae la parte soluble de esta fase.

    El rendimiento de la extracción mejora a medida que se aumenta la superficie de contacto entre el componente sólido y el líquido que le atraviesa.

  • Figura 4 - Esquema del proceso de extracción.

    Objetivos El objetivo de este experimento es, en primer lugar, la extracción de compuestos

    fenólicos de los frutos de Sambucus nigra. Esto se hace para la posterior cuantificación del rendimiento de la extracción, del contenido de compuestos fenólicos y de la actividad antioxidante de lo extraído. Las tres características de la extracción se miden en función de diferentes parámetros, con el objetivo final de encontrar las mejores condiciones de extracción de compuestos fenólicos en dicha materia prima, así como para obtener la máxima actividad antioxidante posible.

  • Procedimento A realização da parte experimental deste trabalho foi baseada em três protocolos

    laboratoriais cedidos pela docente (Anexo 1).

    Humidade das matrizes vegetais – método gravimétrico Os materiais, equipamento e procedimento utilizados podem ser consultados no Anexo

    1- Protocolo 1.

    Extração sólido-líquido

    Plano de extração

    De modo a avaliar diferentes condições experimentais, elaborou-se o seguinte plano para a extração (Tabela 1).

    Tabela 1 - Plano de extração do fruto do sabugueiro (Sambucus nigra).

    Extração Materiais e equipamento: Do material mencionado no Anexo 1-Protocolo 2 só foi

    utilizado 1 g de matéria-prima para cada ensaio, cronómetro, copo de vidro para pesagem, espátula, proveta para medição do solvente, frasco para armazenamento do extrato previamente etiquetado, eppendorfs e suporte para eppendorfs, caneta de acetato e balança analítica. Adicionalmente foi necessário micropipeta, tanque para banho termoestatizado. Como solvente, foi utilizado etanol absoluto e água destilada.

    Sambucus nigra

    Matéria-prima Solvente Tempo (min) Razão sólido:solvente (m/v)

    30

    30

    30

    15

    45

    30

    1:20

    EtOH:H2O (75:25)

    EtOH:H2O (50:50)

    EtOH:H2O (50:50)

    EtOH:H2O (50:50)

    1:20

    1:30

    EtOH:H2O (25:75)

    EtOH:H2O (50:50)

    1:20

    1:20

    1:20

  • Procedimento: Em primeiro lugar, foi montado o equipamento de extração, tanque para banho termoestatizado para aquecer até a temperatura pretendida (40ºC). Em seguida, identificaram-se os copos segundo o plano de extração (Tabela 1) e colocou-se em cada um, 1 g de matéria-prima e 20 ml ou 30 ml de solvente de acordo com as razões sólido: solventes definidas no plano de extração (Tabela 1).

    Iniciou-se as seis extrações, colocando o copo respetivo a cada extração no tanque para banho termoestatizado a 40 ºC e iniciou-se a contagem do tempo. Ao fim do tempo previamente estabelecido no plano de extração (Tabela 1), retiraram-se os seis gobelés. Os extratos obtidos foram, então, filtrados e armazenados em frascos devidamente rotulados.

    Determinação do rendimento da extração Determinou-se, em primeiro lugar, o volume de extrato obtido na extração. Em seguida,

    pesaram-se 18 eppendorfs na balança analítica e pipetaram-se para os mesmos, amostras de 0,5 ml de cada extrato, em triplicado. As amostras nos eppendorfs foram colocadas na estufa com a tampa aberta, a 40ºC, durante alguns dias, até que o solvente evaporasse por completo. Por fim, foram pesados os eppendorfs com o extrato, em princípio, já sem nenhum vestígio de solvente.

    Calcularam-se então as massas de extrato correspondentes ao volume de extrato do eppendorfs e ao volume total de extrato obtido. Com estes valores, foi possível calcular o rendimento das extrações em base seca.

    Determinação do teor de compostos fenólicos nos extratos Materiais e equipamento: para além do material mencionado no Anexo 1-Protocolo 3,

    foi necessário um tanque para banho termoestatizado, ultrassons e uma pipeta de 20 μL.

    Preparação de soluções padrão Foram preparadas previamente, uma solução de carbonato de sódio a 17% (m/v) e uma

    solução padrão de ácido gálico (3,7 mg de ácido gálico/3 ml de etanol), sendo esta a solução-mãe de ácido gálico.

    Preparação dos extratos para análise espectrofotométrica Das 18 amostras secas preparadas em 3.2.2., selecionaram-se 6, garantindo que

    correspondiam às 6 diferentes extrações efetuadas, sendo as restantes armazenadas para uma eventual necessidade de repetir o ensaio. As amostras selecionadas foram diluídas em etanol, recorrendo ao vortex e ultrassons para garantir a solubilização total dos extratos.

  • Análise da solução padrão – Curva de calibração Foram utilizados 11 tubos de ensaio, sendo um deles o "branco", e os restantes

    referentes à curva de calibração. De seguida foram colocadas, nos tubos de ensaio, entre 0 a 20 μL (0,4,8,12,16,20) alíquotas de solução mãe e adicionou-se etanol até perfazer um volume de 20 μL. O tubo de ensaio sem solução-mãe representou o "branco". De seguida, adicionaram-se 1580 μL de água destilada a todos os tubos de ensaio e mais 20 μL de água no "branco" para o volume final ser igual aos restantes tubos de ensaio.

    Iniciou-se a contagem do tempo (com um cronómetro), no momento que se adicionou 100 μL de reagente de Folin-Ciocalteu ao primeiro tubo, o "branco". Passado 30 segundos, adicionaram-se 300 μL da solução de carbonato de sódio e, após agitação, colocou-se o tubo em banho termoestatizado a 40ºC, onde permaneceu durante 30 minutos. Este procedimento foi repetido, sequencialmente para os restantes tubos.

    Foram, então, medidos os valores de absorvância de cada amostra no espectrofotómetro a 765 nm em cuvetes de plástico. Para tal, calibrou-se o espectrofotómetro com a leitura do "branco", fazendo-se em seguida a leitura das restantes amostras.

    Análise das amostras de extrato A análise das amostras foi feita em triplicado, pelo que foram transferidas três alíquotas

    (50 μL) de cada amostra previamente diluídas (assim como as amostras em 3.3.3) para tubos de ensaio, perfazendo um total de 18 tubos. De seguida, adicionaram-se 1580 μL de água destilada a todos os tubos de ensaio. Procedeu-se então da maneira referida em 3.3.3.

    Por fim, foi determinado o teor de compostos fenólicos de cada amostra, o que permitiu obter o teor de fenólicos expresso em mg EAG5/mL de solução. O teor de fenólicos foi expresso em % EAG (m/m).

    Determinação da atividade antioxidante Para a determinação da atividade antioxidante usando o radical DPPH foram utilizados

    os seguintes materiais: Balança analítica; tubos de ensaio; suporte para tubos de ensaio; micropipetas; espectrofotómetro e cuvetes de plástico; vórtex; cronómetro. Foram também utilziados os seguintes solventes e reagentes: Radical DPPH; etanol; água destilada.

    Diluiram-se os extratos, estes obtidos através de uma solução de 50µ das amostras iniciais e 15 ml de etanol a 75 %. Depois adicionou-se 2,5 mL da solução de cada extrato em 3 tubos de ensaio. Noutros 3 tubos de ensaio foram adicionados 2,5mL de etanol a 75 % e estes foram o controlo. Foi ligado o cronómetro e adicionado 1 mL da solução DPPH de 15 em 15 segundos. Após isto, os tubos foram guardados na ausência de luz. Foi feito também um “branco” para cada extrato que consistiu na adição de 2,5 mL de extrato com 1 mL de etanol num novo tubo de ensaio. Foram lidas as absorvâncias no espectrofotómetro. Com estas absorvâncias foi possível calcular a percentagem de atividade antioxidante.

    Resultados e discussão

    Para avaliar e quantificar os compostos fenólicos presentes nas bagas do sabugueiro, foram estudados o rendimento da extração e o teor de compostos fenólicos dos extratos. Para avaliar a atividade antioxidante dos extratos foi calculada a percentagem de DPPH que reagiu durante a reação.

  • Estudo do efeito da composição do solvente de extração No gráfico da figura 5 observam-se os valores de rendimento das extrações, do teor de

    fenólicos e da atividade antioxidante obtidos consoante a composição de solvente para as bagas do sabugueiro.

    Figura 5 - Efeito da composição do solvente no rendimento da extração, no teor de compostos fenólicos e

    na atividade antioxidante total

    No rendimento da extração vemos que o etanol a 50 % apresenta os melhores resultados com 15,1 %, com as concentrações de 25 % e 75 % a registarem valores iguais. Quando falamos do teor de fenólicos observamos que quando a concentração de etanol do solvente é menor a quantidade de compostos fenólicos extraidos é superior, isto faz sentido pois os compostos fenólicos do sabugueiro são maioritariamente antiocininas, que são bastante hidrosolúveis. Relativamente à atividade antioxidante, esta é superior quando o solvente tem a concentração de 75 %, contudo a diferença para a concentração de 50 % é minima (apenas 0,3 %), pelo que podemos considerar esta diferença desprezável e optar pelo uso de etanol na concentração de 50 % neste método de extração, pois, pela análise dos resultados obtidos, apresenta-se como a mais eficiente.

    Estudo do efeito do tempo de extração No gráfico da figura 6 observam.se os valores de rendimento das extrações, do teor de

    fenólicos e da atividade antioxidante obtidos consoante o tempo de extração.

    9,815,1

    9,816,3 12,6 11,3

    86,495,4 95,7

    0

    20

    40

    60

    80

    100

    25:75 50:50 75:25

    (%)

    Solvente de extração (EtOH:H2O, v/v)

    Rendimento extração Teor fenólicos Atividade antioxidante

  • Figura 6 - Efeito do tempo de extração no rendimento da extração, no teor de compostos fenólicos e na atividade antioxidante total.

    Relativamente à extração podemos observar que a diferença dos 15 minutos de extração para os 30 minutos é mínima, aumentando ligeiramente o rendimento e o teor de fenólicos. No tempo de 45 minutos os valores não fazem sentido pois o rendimento nunca poderia ser menor aos tempos de 15 e 30 minutos. Relativamente à atividade antioxidante vemos que é no tempo de 15 minutos que se regista os melhores resultados, contudo no tempo de 45 minutos não podemos tirar conclusões pois o desvio padrão é elevado. A partir destes resultados verificamos que uma extração de 15 minutos é suficientemente eficiente para obter o objetivo pretendido.

    Estudo da razão materia-prima:extrato No gráfico da figura 7 observam-se os valores de rendimento das extrações, do teor de

    fenólicos e da atividade antioxidante obtidos consoante a razão de materia-prima:extrato utilizada na extração.

    14,2 15,1 10,511,3 12,6 11,6

    97,2 95,4

    74,7

    0

    20

    40

    60

    80

    100

    120

    15 30 45

    Re

    nd

    ime

    nto

    (%

    )

    Tempo (min)

    Rendimento extração Teor fenólicos Atividade antioxidante

  • Figura 7 - Efeito da razão de matéria-prima:solvente no rendimento da extração, no teor de compostos fenólicos e na atividade antioxidante total.

    Podemos observar que o rendimento da extração diminui com uma quantidade de solvente superior utilizada, ao contrário do teor de compostos fenólicos, que aumentou. Com isto percebemos que os compostos fenólicos presentes no fruto do sabugueiro são bastante solúveis no solvente utilizado (etanol a 50 %). Relativamente à atividade antioxidante não podemos tirar conclusões pois com a razão de 1:30 os resultados não foram consistentes pois o desvio padrão das amostras é bastante grande, sendo este valor pouco credível. Com estes resultados podemos afirmar que a razão de materia-prima:solvente a utilizar dependerá do objetivo da extração, pois os diferentes fatores estudados demostraram resultados opostos na mesma razão utilizada.

    Verificamos que em todos os testes a atividade antioxidante foi o fator mais inconsistente, isto pode ser explicado pelo facto de que no método DPPH a cor do extrato poderá influenciar muito os resultados, podendo até por vezes torna-los falsos, não traduzindo a verdadeira atividade antioxidante do extrato, principalmente se a cor do extrato estiver dentro da mesma gama do que o composto DPPH (OLSZOWY e DAWIDOWICZ, 2017), sendo este o nosso caso.

    Conclusão Após este trabalho podemos concluir que os objetivos foram maioritariamente

    concluidos. Foram obtidos bons resultados no rendimento da extração e no teor de compostos fenólicos com as diferentes variáveis estudadas, contudo os valores da atividade antioxidante podiam ter sido melhores, sendo bastante inconsistentes. Concluimos que uma extração utilizando etanol a 50 % como solvente é a melhor opção das estudadas neste trabalho, apesar do teor de compostos fenólicos diminuir ligeiramente, pois estes são hidrosolúveis.

    Na extração são necessários apenas 15 minutos para se atingir os objetivos pretendidos, sendo este resultado bastante optimista no ámbito monetário, pois poupa-se tempo resultando em processos mais rápidos e menos dispendiosos.

    15,1 9,512,615,7

    95,4

    81,5

    0

    20

    40

    60

    80

    100

    120

    1:20 1:30

    Re

    nd

    ime

    nto

    (%

    )

    Razão matéria-prima:solvente (m/V)

    Rendimento extração Teor fenólicos Atividade antioxidante

  • No caso do estudo da razão materia-prima:solvente, concluimos que a razão de 1:30 obtêm melhores resultados, o que significa que o extrato e os compostos presentes são bastante solúveis no solvente utilizado (etanol a 50 %).

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  • Anexo 1

    Protocolos