Separační metody

Optické a separační metodyObsah přednášky Chromatografie

Plynová Kapalinová Další

Elektromigrační metody Hmotnostní spektrometrie

Separační metody

Separace – dělení Vzorek - směs více látek Získání minimálně 2 podílů o rozdílném

složení Filtrace, krystalizace, centrifugace, destilace Chromatografie, elektromigrační metody, MS

Separační metodyDělení podle principu Fázové rovnováhy

Rozdíly v rovnovážné distribuci složek mezi 2 fáze (g)-(l): destilace, plynová chromatografie (GC) (g)-(s): sublimace, GC, molekulová síta (l)-(l): extrakce, kapalinová chromatografie (LC) (l)-(s): zonální tavení, frakční krystalizace, LC, molekulová síta

Rychlostní procesy Rozdíly v rychlosti pohybu složek Membránové separace: ultrafiltrace, osmóza, (elektro)dialýza Separace polem: elektroforéza, MS

Separační metodyFázové rovnováhy Rozdělení mezi 2 nemísitelné fáze Adsorpce na polárních sorbentech a

chemisorpce Zachycování molekul na povrchu tuhé fáze Adsorpční centra – místa záchytu Van der Waalsovy síly - fyzisorpce Chemické reakce – chemisorpce 2 fáze:

1) vytěsnění adsorbovaných molekul mobilní fáze 2) tvorba monomolekulární vrstvy adsorbovaných molekul

Adsorpční izotermy: Langmiurova, Freundlichova

Separační metodyFázové rovnováhy Iontová výměna

Sorbent, který zachycuje určitý typ iontů, zároveň uvolňuje jiný

Anexy Katexy Pevné látky, příp. gely Použití pro ionty kovů

Sítový efekt Molekulová síta Sorbent s definovanou velikostí pórů Separace plynů podle velikosti molekul nebo atomů

Chromatografie

Chromatus+graphein Historicky – dělení podle barev Michail Cvet – separace rostlinných barviv,

kolona s CaCO3

Založeno na distribuci mezi 2 fáze: pevnou (stacionární) a pohyblivou (mobilní)

Postupné mnohonásobné opakování rovnovážných stavů

ChromatografieSeparační principy Adsorpční chromatografie

Stacionární – (s), mobilní – (l)(g) Rozdělovací chromatografie

Stacionární – (l), mobilní – (l)(g) Chemisorpční chromatografie

Stacionární – (s), mobilní – (l)(g) Iontově-výměnná chromatografie

Stacionární – (s), mobilní – (l)(g) Gelová permeační chromatografie

Stacionární – (s), mobilní – (l)(g)

ChromatografieZákladní dělení

Kapalinová chromatografie Mobilní fáze – kapalina

Plynová chromatografie Mobilní fáze - plyn

Chromatografie

Dynamická teorie chromatograf. procesu Teoretické patro – 1 ustavení rovnováhy HETP – výška ekvivalentní teoretickému patru Van Deemterova rovnice: HETP = A+B/µ + Cµ

µ….rychlost průtoku mobilní fáze A…parametr, turbulentní proudění B…parametr, difúze C…parametr, působení proti dufúzi

ChromatografiePlynová Mobilní fáze – plyn (H2, He) Stacionární fáze

Sorbent – adsorpční ch. Kapalina – rozdělovací ch. Molekulové síto – ch. na molekulových sítech

Dávkování vzorku Plyny Zplyňování roztoku – zplyňovací komůrka zahřívána Injekční port Septum 6 cestný ventil

ChromatografiePlynová Kolona – dělení Kolona i detektor termostatovány – teplotní program Kolony pro GC:

Náplňové Stacionární fáze – pevný sorbent Aktivní uhlí, silikagel, polymery, molekulová síta, velký povrch Průměr kolony 2 – 5 mm, délky 1 – 5 m, nerez ocel, sklo Dělení plynů

Náplňové pro rozdělovací GC Stacionární fáze – kapalina Uhlovodíky, methylsilikonové oleje Potažená stěna kapiláry, inertní nosiče – křemelina, SiO2

ChromatografiePlynová Kolony pro CG:

Kapilární kolony Pro adsorpční GC

Tenká vrstva pevného sorbentu na vnitřní stěně kapiláry PLOT – porous layer open tubular Průměr < 1 mm

Pro rozdělovací GC Film kapalné stacionární fáze na vnitřní stěně kapiláry WCOT – wall coated open tubular

Mnohem menší vnitřní průměr Dávkování vzorků ve velmi malých množstvích Dělení složitých směsí

ChromatografiePlynová Detektory

Tepelně vodivostní detektor (TCD) Univerzální, široký rozsah Nízká citlivost, měření odporu

Plamenově ionizační detektor (FID) Univerzální, citlivější než TCD Pro organické látky Vzduch-vodíkový plamen Nosné plyny: NH3, CS2, CO, O2, CO2, H2

ChromatografiePlynová Detektory GC

Detektor elektronového záchytu (ECD) Jedny z nejčastějších β-zářič (63Ni) Nosný plyn nesmí elektrony zachycovat Organické látky s halogeny, nitroskupinami, bifenyly

ChromatografiePlynová - aplikace Analýzy plynů Analýza snadno zplynitelných látek Spojení GC-MS: pomlčkové metody Oblast životního prostředí

Pesticidy Klinická a toxikologická analýza

Drogy, léčiva, alkohol Analýza ropných produktů Analýza potravin, kosmetických přípravků

ChromatografiePlynová

ChromatografieKapalinová Mobilní fáze – kapalina

Elektrolyty, rozpouštědla Stacionární fáze – pevná, kapalná

Plošné uspořádání – tenkovrstvá, papírová ch. Kolonové uspořádání

Tenkovrstvá ch. Silikagel, Al2O3 vrstva na nosiči

Papírová ch. Papír – sorbent – uchycování látek Speciální papíry Sestupné/vzestupné uspořádání Použití pro kvalitu ne kvantitu Uzavřená nádoba – zabránění odpařování rozpouštědla Retardační faktor Rf = b/a a…start-čelo; b…start-skvrna Identifikace aminokyselin, přírodní barviva

ChromatografieKapalinová Kolonové uspořádání

HPLC, UHPLC – vysoká účinnost

Instrumentace Vysokotlaké čerpadlo Dávkovací ventil – vícecestný, dávkovací smyčky Kolona – může a nemusí být termostatovaná Kolony mnohem kratší než u GC Detekce

ChromatografieKapalinová Kolony

Silikagel, Al2O3, aktivní uhlí Polymerní sorbenty Ionexy Hydrofobní gely Methakrylátové kopolymery

Detektory Univerzální detektory – změna fyzikálně chemických

vlastností – refraktometrie, vodivost ad. Selektivní – UV-VIS, voltametrie, MS

ChromatografieKapalinová - aplikace Převážně HPLC Separace a stanovení peptidů, aminokyselin,

organických kyselin Léčiva, barviva, pesticidy, PAU Fenolické látky Klinická biochemie, potravinářství Kontrola ŽP Farmakologické studie

ChromatografieKapalinová

Další typy chromatografií

Iontová chromatografie Podobná HPLC Dělení polárních látek, iontů Stacionární fáze – iontoměnič Mobilní fáze – vodný roztok iontů Užití elektrochemických detekčních metod Vzorky podobné elektromigračním metodám

Size exclusion chromatografie Rozdělování na základě velikosti molekul Stacionární fáze – pórovité látky (molekulová síta) Instrumentace podobná HLPC Nedosahuje účinnosti HPLC

Elektromigrační metody

Princip: rozdíl v rychlosti migrace nabitých částic v elektrickém poli

Základní uspořádáníKatodový prostor – separační prostor – anodový prostor

Kapilární zónová elektroforéza

Kapilární izotachoforéza

Kapilární zónová elektroforéza

Stejný základní (nosný) elektrolyt v celém systému Vysoké napětí (30 – 60 kV) Směs iontů (kationty a anionty) se rozdělují v pořadí

daném různou rychlostí migrace – vytváření zón Instrumentace:

Křemenné kapiláry Dávkování – mikro – nanolitry Detekce: UV-VIS, flourometrická, vodivostní, MS

Výstupní signál – elektroforegram – v závislosti na čase Výška/plocha – úměrná množství Plocha podle času - kvalita

Elektroforéza

Kapilární izotachoforéza

Kapiláry 2 elektrolyty

Vedoucí L – nejvyšší pohyblivost Zakončující T – nejnižší pohyblivost

Látky se dělí do zón pohybujících se stejnou rychlostí

Rozdělování jen látek, které jsou stejně nabité

Detekce stejná jako u elektroforézy

Izotachoforéza

Elektromigrační metodyAplikace Laboratoře klinické biochemie Potravinářství, zemědělství Léčiva ŽP Aminokyseliny, mastné organické kyseliny Anorganické anionty a kationty Fenolické látky Vitamíny Pesticidy

Hmotnostní spektroskopie - MS

Nejedná se o optickou metodu Dělící metoda Dělení podle hmotnosti a náboje I = f(m/z) Princip:

Ionizace látky – přidání velkého množství energie Urychlení iontů v elektrickém poli Separace v magnetickém poli (m/z)

Hmotnostní spektroskopie – MSHmotnostní spektrum Čárové spektrum Závislost iontového proudu dopadajícího na

detektor na poměru m/z

Aplikace: Organická analýza Detekce a identifikace látek ve stopovém množství GC-MS, HPLC-MS

Hmotnostní spektrometrieDělení iontů Magnetické pole Kvadrupólový detektor TOF

Orbitrap Iontová past

Hmotnostní spektrometrieTypy ionizace Vakuové ionizace

Elektronová Těkavé látky

Chemická Reagenční plyn

MALDI (Matrix-assisted laser desorption ionization) Analyt v pevné organické matrici Laser

Hmotnostní spektrometrieTypy ionizace Atmosférické ionizace

Termická ionizace Ar plasma

Spray ionizace Často v kombinaci s HPLC ESI – electrospray ionization APCI – atmospheric pressure chemical ionization

Fotoionizace

Hmotnostní spektroskopie - MS

Pro dnešek vše