SPECIFICITA’ EMECCANISMI DI

REVISIONE

La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversisubstrati in competizione per il sito attivo e soprattutto incompetizione per la catalisi

Esempio: una particolare aminoacil-tRNA sintetasi è specifica perun determinato aminoacido e per un determinato tRNA, ovveroriesce a sintetizzare con un errore molto piccolo un determinatoaminoacil-tRNA, in un miscuglio di tutti gli aminoacidi e gli tRNA presenti nella cellula.

Il problema della specificità enzimatica deve prendere in considerazione le velocità relative delle reazioni di tutti i substratiche competono tra loro. In questo senso la specificità dipende non solo dal legame, ma anche dalla velocità catalitica (KM e kcat), ovvero da kcat/KM).

I LIMITI DELLA SPECIFICITA’

Un enzima non ha problemi a discriminare tra il “suo” substratoed uno più grande.

Il problema è quello di limitare al massimo la catalisi dellatrasformazione di substrati isosterici o più piccoli.

Il sito attivo dell’enzima può essersi evoluto al fine di escludereefficientemente determinati substrati “pericolosi”, ma solo se questi hanno caratteristiche molto diverse dal substrato naturale (cariche opposte o gruppi polarità/apolari).

Inoltre, le reazioni dei substrati più piccoli comportano rapportikcat/KM molto inferiori.

I sistemi in cui un’alta specificità è essenziale sono la replicazionedel DNA e la sintesi delle proteine.

Questi processi, a causa della pressione evolutiva sugli enzimi cheli catalizzano, indicano i limiti massimi possibili della specificità.

Buoni esempi di discriminazione si hanno con le aminoacil-tRNA sintetasi

Legame 150 voltepiù debole

Legame 200 voltepiù debole

Reagisce con unavelocità 2•105

volte inferiore

La specificità può essere analizzata in base alla teoria dellostato di transizione.

Se il substrato isosterico o più piccolo differisce per un elementoche determina una differenza di energia di legame dello stato ditransizione pari a Gb, allora la massima discriminazionepossibile in base a questa differenza sarà l’esponente (- Gb/RT).

( / )

( / )

k K

k Kecat M A

cat M B

G

RTb

v

v

A k K

B k KA

B

cat M A

cat M B

( / )

( / )

ln ln ( )k

K

K T

hG Gcat

M

Bb

0X

La specificità dei substrati in competizione dipende dallegame relativo dei loro stati di transizione con l’enzima.

La complementarietà enzima-stato di transizione massimizzala specificità perché assicura il legame ottimale dello stato ditransizione desiderato.

Questo è anche il criterio per il valore ottimale del rapportokcat/KM. La specificità è infatti determinata proprio da questorapporto.

MECCANISMI DI REVISIONE O CORREZIONEDELLE BOZZE

L’accuratezza della replicazione del DNA e della sintesi delleproteine è limitata, rispettivamente, dall’accopiamento delle basiazotate complementari e dall’energia di legame delle catene lateralidegli aminoacidi alle proteine, ovvero la selezione dei diversiamminoacidi.

L’appaiamento delle basi è accurato fino a circa una parte su 104 –105.Eppure la frequenza di errore nella replicazione è di 10-8-10-10.

L’accuratezza della selezione degli aminoacidi raggiunge soltantocirca una parte su 102.Eppure la frequenza di errore nella traduzione è di 10-3-10-4.

Questo è possibile per via dell’evoluzione di meccanismi di revisione.

Alcuni enzimi chiavi della polimerizzazione hanno sviluppato,oltre al sito attivo per la sintesi, un secondo sito attivo idroliticoche è usato per distruggere intermedi o prodotti incorretti manoa mano che si formano. La sintesi è perciò controllata due volte.

Il punto cruciale di un meccanismo di revisione è la formazionedi un intermedio ad alta energia che è instabile e, nel caso in cuisia avvenuto un errore, permette l’idrolisi oppure procede nellasintesi. Questo permette un controllo cinetico dell’accuratezza.

REVISIONE NELLA SINTESI PROTEICA

La componente meno accurata della traduzione, che necessitaun meccanismo di revisione, è la selezione degli aminoacidi nellaformazione degli aminoacil-tRNA.

Il fenomeno della revisione fu scoperto inizialmente in relazionealla isoleucil-tRNA sintetasi. Il gruppo metile in più nellaisoleucina rispetto alla valina favorisce l’attivazione della prima diun fattore 100-200. Ma siccome la valina nella cellula è concentrata5 volte di più, la probabilità di errore aumenta ad uno su 20-40.

Eppure il tasso di errore trovato nella traduzione è solo di uno su 3000.

In presenza di valina e tRNAIle, la isoleucil-tRNA sintetasiè una ATP pirofosfatasi che catalizza l’idrolisi di ATP e poidi valil-adenilato attraverso la reazione di attivazione.

Ci sono due intermedi ad alta energia che potrebbero subirela correzione tramite idrolisi: l’aminoaciladenilato el’aminoacil-tRNA.

La valil-tRNA sintetasi ha un sito di idrolisi distinto e separato dal sitodove avviene l’acilazione (sintesi).

Il valore di kcat/KM per l’acilazionedel treoniladenilato è circa 600 volteInferiore di quello per l’attivazionedella valina. Il complesso Thr-tRNASi forma, ma viene rapidamenteidrolizzato con una costante divelocità di 40 s-1. Il complessoVal-tRNA viene idrolizzato 3000volte più lentamente.Le differenze strutturali tra treoninae valina vengono perciò usatedue volte.

Nella valil-tRNA sintetasi c’è un doppio meccanismo di controlloe correzione, operato sia la livello dell’aminoaciladenilato che dell’aminoacil-tRNA.

Analogia tra il processo di selezione operato dalle aminoacil-tRNAsintetasi e un meccanismo di selezione a “doppio setaccio”

REVISIONE NELLA REPLICAZIONE DEL DNA

Differenze fondamentali tra la sintesi delle proteine e lareplicazione del DNA:

1) nella sintesi delle proteine esiste una sintetasi per ogniaminoacil-tRNA. Nella replicazione del DNA c’è un’unicapolimerasi per i quattro appaiamenti corretti.

2) nella sintesi delle proteine la correzione deve avvenire primadella formazione del legame peptidico. Nella replicazione delDNA la correzione può avvenire dopo la polimerizzazione.

Sintesi delle proteine

Replicazione del DNA

Le DNA polimerasi procariotiche hanno un’attività esonucleasicain direzione 3’ 5’. Questa attività è maggiore per basi non correttamente appaiate o singoli filamenti di DNA. La frequenza dimutazione nel batteriofago T4 è inversamente proporzionale allaattività esonucleasica della sua DNA polimerasi.

Meccanismo molecolare della correzione della DNA polimerasi

Nella DNA polimerasi di E. coli il sito di correzione si trova a35 Å dal sito di polimerizzazione. I meccanismi di polimerizzazionee di idrolisi sono simili. Si basano entrambi sulla presenza di dueioni metallici che stabilizzano le cariche nascenti.Il DNA è in equilibrio di legame con entrambi i siti. Il sito dipolimerizazione è normalmente maggiormente occupato (per quasiil 90%). In presenza di appaiamenti non corretti, le percentuali di occupazione si invertono.

Polimerizzazione

Idrolisi (attivitàesonucleasica)