21
SPECIFICITA’ E MECCANISMI DI REVISIONE

SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

SPECIFICITA’ EMECCANISMI DI

REVISIONE

Page 2: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversisubstrati in competizione per il sito attivo e soprattutto incompetizione per la catalisi

Esempio: una particolare aminoacil-tRNA sintetasi è specifica perun determinato aminoacido e per un determinato tRNA, ovveroriesce a sintetizzare con un errore molto piccolo un determinatoaminoacil-tRNA, in un miscuglio di tutti gli aminoacidi e gli tRNA presenti nella cellula.

Il problema della specificità enzimatica deve prendere in considerazione le velocità relative delle reazioni di tutti i substratiche competono tra loro. In questo senso la specificità dipende non solo dal legame, ma anche dalla velocità catalitica (KM e kcat), ovvero da kcat/KM).

Page 3: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

I LIMITI DELLA SPECIFICITA’

Un enzima non ha problemi a discriminare tra il “suo” substratoed uno più grande.

Il problema è quello di limitare al massimo la catalisi dellatrasformazione di substrati isosterici o più piccoli.

Il sito attivo dell’enzima può essersi evoluto al fine di escludereefficientemente determinati substrati “pericolosi”, ma solo se questi hanno caratteristiche molto diverse dal substrato naturale (cariche opposte o gruppi polarità/apolari).

Inoltre, le reazioni dei substrati più piccoli comportano rapportikcat/KM molto inferiori.

Page 4: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

I sistemi in cui un’alta specificità è essenziale sono la replicazionedel DNA e la sintesi delle proteine.

Questi processi, a causa della pressione evolutiva sugli enzimi cheli catalizzano, indicano i limiti massimi possibili della specificità.

Page 5: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

Buoni esempi di discriminazione si hanno con le aminoacil-tRNA sintetasi

Legame 150 voltepiù debole

Legame 200 voltepiù debole

Reagisce con unavelocità 2•105

volte inferiore

Page 6: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

La specificità può essere analizzata in base alla teoria dellostato di transizione.

Se il substrato isosterico o più piccolo differisce per un elementoche determina una differenza di energia di legame dello stato ditransizione pari a Gb, allora la massima discriminazionepossibile in base a questa differenza sarà l’esponente (- Gb/RT).

Page 7: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

( / )

( / )

k K

k Kecat M A

cat M B

G

RTb

v

v

A k K

B k KA

B

cat M A

cat M B

( / )

( / )

ln ln ( )k

K

K T

hG Gcat

M

Bb

0X

Page 8: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

La specificità dei substrati in competizione dipende dallegame relativo dei loro stati di transizione con l’enzima.

La complementarietà enzima-stato di transizione massimizzala specificità perché assicura il legame ottimale dello stato ditransizione desiderato.

Questo è anche il criterio per il valore ottimale del rapportokcat/KM. La specificità è infatti determinata proprio da questorapporto.

Page 9: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

MECCANISMI DI REVISIONE O CORREZIONEDELLE BOZZE

L’accuratezza della replicazione del DNA e della sintesi delleproteine è limitata, rispettivamente, dall’accopiamento delle basiazotate complementari e dall’energia di legame delle catene lateralidegli aminoacidi alle proteine, ovvero la selezione dei diversiamminoacidi.

L’appaiamento delle basi è accurato fino a circa una parte su 104 –105.Eppure la frequenza di errore nella replicazione è di 10-8-10-10.

L’accuratezza della selezione degli aminoacidi raggiunge soltantocirca una parte su 102.Eppure la frequenza di errore nella traduzione è di 10-3-10-4.

Questo è possibile per via dell’evoluzione di meccanismi di revisione.

Page 10: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

Alcuni enzimi chiavi della polimerizzazione hanno sviluppato,oltre al sito attivo per la sintesi, un secondo sito attivo idroliticoche è usato per distruggere intermedi o prodotti incorretti manoa mano che si formano. La sintesi è perciò controllata due volte.

Il punto cruciale di un meccanismo di revisione è la formazionedi un intermedio ad alta energia che è instabile e, nel caso in cuisia avvenuto un errore, permette l’idrolisi oppure procede nellasintesi. Questo permette un controllo cinetico dell’accuratezza.

Page 11: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

REVISIONE NELLA SINTESI PROTEICA

La componente meno accurata della traduzione, che necessitaun meccanismo di revisione, è la selezione degli aminoacidi nellaformazione degli aminoacil-tRNA.

Il fenomeno della revisione fu scoperto inizialmente in relazionealla isoleucil-tRNA sintetasi. Il gruppo metile in più nellaisoleucina rispetto alla valina favorisce l’attivazione della prima diun fattore 100-200. Ma siccome la valina nella cellula è concentrata5 volte di più, la probabilità di errore aumenta ad uno su 20-40.

Eppure il tasso di errore trovato nella traduzione è solo di uno su 3000.

Page 12: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

In presenza di valina e tRNAIle, la isoleucil-tRNA sintetasiè una ATP pirofosfatasi che catalizza l’idrolisi di ATP e poidi valil-adenilato attraverso la reazione di attivazione.

Ci sono due intermedi ad alta energia che potrebbero subirela correzione tramite idrolisi: l’aminoaciladenilato el’aminoacil-tRNA.

Page 13: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

La valil-tRNA sintetasi ha un sito di idrolisi distinto e separato dal sitodove avviene l’acilazione (sintesi).

Il valore di kcat/KM per l’acilazionedel treoniladenilato è circa 600 volteInferiore di quello per l’attivazionedella valina. Il complesso Thr-tRNASi forma, ma viene rapidamenteidrolizzato con una costante divelocità di 40 s-1. Il complessoVal-tRNA viene idrolizzato 3000volte più lentamente.Le differenze strutturali tra treoninae valina vengono perciò usatedue volte.

Page 14: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

Nella valil-tRNA sintetasi c’è un doppio meccanismo di controlloe correzione, operato sia la livello dell’aminoaciladenilato che dell’aminoacil-tRNA.

Page 15: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

Analogia tra il processo di selezione operato dalle aminoacil-tRNAsintetasi e un meccanismo di selezione a “doppio setaccio”

Page 16: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

REVISIONE NELLA REPLICAZIONE DEL DNA

Differenze fondamentali tra la sintesi delle proteine e lareplicazione del DNA:

1) nella sintesi delle proteine esiste una sintetasi per ogniaminoacil-tRNA. Nella replicazione del DNA c’è un’unicapolimerasi per i quattro appaiamenti corretti.

2) nella sintesi delle proteine la correzione deve avvenire primadella formazione del legame peptidico. Nella replicazione delDNA la correzione può avvenire dopo la polimerizzazione.

Page 17: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

Sintesi delle proteine

Replicazione del DNA

Page 18: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

Le DNA polimerasi procariotiche hanno un’attività esonucleasicain direzione 3’ 5’. Questa attività è maggiore per basi non correttamente appaiate o singoli filamenti di DNA. La frequenza dimutazione nel batteriofago T4 è inversamente proporzionale allaattività esonucleasica della sua DNA polimerasi.

Page 19: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

Meccanismo molecolare della correzione della DNA polimerasi

Nella DNA polimerasi di E. coli il sito di correzione si trova a35 Å dal sito di polimerizzazione. I meccanismi di polimerizzazionee di idrolisi sono simili. Si basano entrambi sulla presenza di dueioni metallici che stabilizzano le cariche nascenti.Il DNA è in equilibrio di legame con entrambi i siti. Il sito dipolimerizazione è normalmente maggiormente occupato (per quasiil 90%). In presenza di appaiamenti non corretti, le percentuali di occupazione si invertono.

Page 20: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

Polimerizzazione

Page 21: SPECIFICITA E MECCANISMI DI REVISIONE. La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto

Idrolisi (attivitàesonucleasica)