GMGM20052005

Kolegij Genetičko inženjerstvo

Transgenične biljkedoc. dr. sc. Gordana Maravić

Zavod za biokemiju i molekularnu biologijuFarmaceutsko-biokemijskog fakulteta

GMGM20052005

Definicija pojmova

Transgenični organizamOrganizam koji nosi slijed DNA koji inače nije prirodno prisutan u njegovom genomu

TransgenCiljni gen uključen u stvaranje transgeničnog organizma

Genetički modificirani organizam (GMO)

Organizam u kojem je učinjena genetička promjena Termin kojim se opisuju transgenične biljke i životinje

OPREZ!Uža definicija

Uključuje isključivo uvođenje stranih gena u organizam genetičkim inženjerstvom

Šira definicijaUključuje i križanje i mutagenezu

GMGM20052005

Važne metode za poboljšanje svojstava biljaka

KrižanjeKrižanjem dviju individua iste ili različitih vrsta nastaje nova, poboljšana varijantaNije biotehnološki postupak

TransformacijaUnošenje gena iz druge vrstetemeljni biotehnološki postupak u proizvodnji transgenične biljke

MutagenezaModifikacija normalnog genaNe uključuje unos transgena

GMGM20052005

Križanje vrstapšenica raž

X

hibrid tritikala

Bolji prinos i sadržaj proteina nego u roditeljskih vrsta

GMGM20052005

Stvaranje transgenične biljke

Koraci:Kreirati rekombinantnu DNA za uvođenje strane DNA

Kao vektori se najčešće koriste virus mozaične bolesti duhana i plazmid Ti (tumor inducing) iz bakterije Agrobacterium tumefaciens

Uvesti stranu DNA u biljku i selektirati transformanteRazviti čitavu biljku u laboratorijuIspitati biljku izvan laboratorija

GMGM20052005

Plazmid Ti

Prirodni plazmid u A. tumefaciensNosi gene za tumorigenezu (biljni hormoni), virulenciju i sintezu i uporabu derivata neobičnih aminokiselina –opinaRegija s genima za tumorigenezu – T-DNAT-DNA je omeđena ponavljajućim sljedovima pomoću kojih se nasumično ugrađuje u genom biljkeT-DNA se može zamijeniti stranom DNA za unos u biljku

GMGM20052005

Trodijelno križanje

prikladni soj A. tumefaciens s rekombinantnom DNA kreira se miješanjem triju bakterijskih sojeva

Jedan soj E. coli nosi vektor s ciljnim genomDrugi soj E. coli nosi vektor koji potiče konjugaciju (vektor pomagač)soj A. tumefaciens nosi derivat plazmida Ti

Vektor poimagač prenosi vektor s ciljnim genom u A. tumefaciens gdje dolazi do rekombinacije s plazmidom Ti

GMGM20052005

2 pristupa dizajnu Ti-plazmida

Sustav binarnih vektoraU A. tumefaciens se istovremeno ubacuju vektor s ciljnim genom i sljedovima za rekombinaciju i vektor s genima za virulencijuKomplementacija in trans

Kointegracija

pBR

pBR

vir

Razoružani kointegrirani Ti plazmid

insert

GMGM20052005

GMGM20052005

Unos strane DNA u biljke

Infekcija bakterijom A. tumefaciensElektroporacija protoplastaBiolistika (“genski pištolj”)

GMGM20052005

Laboratorijski dio

GMGM20052005

Testiranje u polju

Otpornost na herbicide

“obične biljke”

transgenične biljke

GMGM20052005

Završni test – prihvaćanje potrošača

Kukuruz otporan na herbicid Roundup

prije poslije

GMGM20052005

Zašto su važne transgenične biljke?

Možemo razviti organizme s novim svojstvima

Rajčica koja dulje ostaje svježa

Soja otporna na herbicid

GMGM20052005

Ciljevi stvaranja transgeničnih biljaka

Povećati prinos usjevaSmanjiti uporabu pesticida

Povećati otpornost na korovePovećati toleranciju na pesticide Smanjiti ovisnost o pesticidima

Poboljšati hranjivu vrijednost namirnicaOdgoditi propadanje (truljenje) hraneSniziti cijenu hraneProizvesti jestive vakcine

GMGM20052005

Transgenične biljke na tržištu

Pamuk otporan na insekte – Bt (Bacillus thuringiensis) toksin ubija nametnike (Helicoverpa zea)•transgen = Bt protein

Kukuruz otporan na insekte – Bt toksin ubija nametnika Ostrinia nubilalistransgen = Bt protein

Normalan Transgenični

GMGM20052005

Biljke otporne na herbicide

Soja, kukuruz (na tržištu poznati kao “Roundup ready”usjeviUskoro šećerna repa, salata, malina, pšenica...)

Gliofozat i glufozinat – najčešće klase herbicida u uporabi (komercijalno ime “Roundup”)Transgen - modificirana EPSP sintaza ili fosfinotricin-N-acetiltransferaza

GMGM20052005

Usjevi osjetljivi na glifozat ne mogu sintetizirati aromatske ak

X

X

Glifozat –inhibitor biljne EPSP sintaze

šikimska kiselina+ fosfoenolpiruvat

5-Enolpiruvil šikimat-3-fosfat(EPSP)

Aromatske aminokiseline

Bez aminokiselina biljka umire

X

GMGM20052005

Usjevi otporni na glifozat sadrže bakterijsku EPSP sintazu

Glifozatne inhibira bakterijsku EPSP sintazu

šikimska kiselina+ fosfoenolpiruvat

5-Enolpiruvil šikimat-3-fosfat(EPSP)

Aromatske aminokiseline

Biljka se normalno razvija

GMGM20052005

Biljke otporne na viruse

Potivirusi uzrokuju štetu na usjevima papaja, lubenica, tikvica...PRSV - papaya ringspot virusWMV2 - watermelon mosaic virus-2 ZYMV - zucchini yellows mosaic virus

Protein virusnog omotača unosi se kao transgen u biljkuprotein se proizvodi u biljci, ona aktivira zaštitne mehanizme i postaje otporna na virus

GMGM20052005

Nova generacija transgeničnih biljaka

Zlatna riža – povećana količina vitamina Atransgen = tri enzima u biosintetskom putu vitamina A

suncokret– otpornost na bijelu plijesanBijela plijesan proizvodi toksične oksalatetransgen = oksalat oksidaza iz pšenice

GMGM20052005

Nova generacija transgeničnih biljaka

Nova varijanta transgenične traveTurfgrass:otpornost na herbicidepolakši rast (manje učestala košnja)

GMGM20052005

Biljke kao jestive vakcine

Biljke su jeftini, sigurni i učinkoviti sustavi za proizvodnju i uzimanje vakcinavakcina dolazi u krvotok razgradnjom biljke u probavnom traktu – eliminacija industrijskog procesiranja i pročišćavanja

Rani pokusi – ekspresija površinskog antigena bakterije Streptococcus mutans u duhanu

S. mutans proizvodi kiselinu koja uzrokuje karijesStimulacija imunog odgovora u mukozi usne šupljine spriječila bi nastanjivanje bakterija

GMGM20052005

Biljke kao jestive vakcineBiljke kao jestive vakcine

Antigen Domaćin Referenca

Površinski antigen herpes virusa B

duhan Mason et al. 1992.

Glikoprotein virusa bjesnoće

rajčica Mcgarvey et al. 1995.

Antigen hepatitisa B salata Ehsani et al. 1997.

Podjedinica kolera toksina

krumpir Arakawa et al. 1998.

GMGM20052005

Zlatna riža

Nedostatak vitamina A je veliki zdravstveni problem

Uzrokuje sljepoćuPogoršava druge bolesti (diareja...)

Procjenjuje se da oko milijun djece umire prerano a dodatnih 350 000 oslijepiU brojnim zemljama ne postoji mogućnost unosa vitamina A putem tabletaPovećan sadržaj vitamina A u osnovnim hranjivim namirnica je privlačna alternativa

Proizvodnja transgenične riže

GMGM20052005

Sintetski put β-karotena ne postoji u biljaka

IPP (izopentil-difosfat)

Geranilgeranil difosfat

Fitoen

Likopen

β -karoten(prekursor vitramina A)

fitoen sinthaza

fitoen desaturaza

Likopen-beta-ciklaza

ξ-karoten desaturaza

Problem:Riži nedostaju

ovi enzimi

Normalna riža bez

vitamina A

GMGM20052005

Zlatna riža sadrži gene za biosintetski put vitamina A

Gen iz sunovrata

Jedinstveni bakterijski gen obnaša obje

funkcije

Biosinteski put vitamina A je

potpun i funkcionalan

Zlatna riža

IPP (izopentil-difosfat)

Geranilgeranil difosfat

Fitoen

Likopen

β -karoten(prekursor vitramina A)

fitoen sintaza

fitoen desaturaza

Likopen-beta-ciklaza

ξ-karoten desaturaza

Gen iz sunovrata

GMGM20052005

Zlatna riža 2 – veći sadržaj β-karotena

Premda zlatna riža sadrži β-karoten, njegova količina nije dovoljna da bi se normalnim unosom zadovoljile potrebe za vitaminom AZbog premalog sadržaja β-karotena, enzim fitoen-sintaza iz sunovrata zamijenjen je enzimom iz kukuruza koji značajno povećava sintezu β-karotena

(Nature Biotechnology, May 2005)

GMGM20052005

GMO u SAD

u SAD se nalazi 66% svjetskih GMO usjevaOd toga:

75% pamuk71% soja34% kukuruzOstali usjevi: rajčica (cherry tomato), krumpir, šećerna repa...

GMGM20052005

Prednosti i nedostaci GMO

NEDOSTACIPREDNOSTIMogući nepredvidivi zdravstveni problemiAlergijeNarušavanje ekološke ravnoteže

BioraznolikostRazvitak rezistencije

Redukcija uporabe pesticida za tretiranje usjevaPoboljšana hranjiva vrijednost Odgođeno vrijeme truljenja Niža cijenaProizvodnja usjeva koji bi rasli u nepovoljnim uvjetima

Trenutno ne postoje jednoznačni rezultati znanstvenih istraživanja!

GMGM20052005

Potrebno je biti oprezan...

“As we know, there are known knowns.There are things we know we know.

We also knowthere are known unknowns.That is to say,we know there are some thingswe do not know.

But there are also unknownunknowns,

the ones we don't knowwe don't know.”

Donald Rumsfeld, ministar obrane SAD na konferenciji za

tisak o pitanju iračkog oružja za masovno

uništenje

GMGM20052005

...ali i strpljiv i optimističan

“There is a great day dawning if only we can get through the night.”