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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES
DE P (PSM) DE LAS RAICES DE VANILLA SP.
LAURA MARIA BERNAL PESCA
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBÍOLOGA AGRICOLA Y VETERINARIA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA BOGOTA D.C.
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de julio de 1946: La Universidad no se hace responsable por
los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis de grado”
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES
DE P (PSM) DE LAS RAICES DE VANILLA SP.
Laura María Bernal Pesca
APROBADO:
Nelson Walter Osorio Vega Ingeniero Agrónomo Ph.D.
Director Marcela Franco Amanda Varela Microbióloga Msc Bióloga Msc Jurado Jurado
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES
DE P (PSM) DE LAS RAICES DE VANILLA SP.
Laura María Bernal Pesca
APROBADO: ___________________________ _____________________________ Ingrid Schuler Jeaneth Arias Palacios Decana Académica Directora Carreras de Microbiología
Dedicatoria A Dios, A mis padres y hermanos por el apoyo moral, la paciencia y el esfuerzo. A John mi
esposo quien con su amor hizo de este sueño una realidad. A ti Simón por darle un sentido
más amplio a mi vida.
Agradecimientos
Agradezco a todas las personas que durante toda mi vida han colaborado en mi formación
tanto personal como profesional, a la Pontificia Universidad Javeriana porque a través de sus
profesores me dio las bases necesarias para hacer un buen trabajo, a la Universidad Nacional
De Colombia sede Medellín, al Laboratorio de Microbiología Del Suelo en cabeza de su director
el Dr. Walter Osorio por haber confiado desde el principio en mis capacidades y haberme
colaborado hasta el cansancio para que esta tesis de grado fuera una realidad. A mis amigas
en la Universidad y fuera de ella gracias por el apoyo.
Tabla de Contenidos
1. RESUMEN.………………………………………………………………………………………
………..
IINTRODUCCION………………………………………………………………………………..
I
2. MARCO TEORICO Y REVISION DE LITERATURA………………………………………..II
2.1 Vainilla spp……………………………………………………………………………….......... II
2.2 Pi COMO NUTRIENTE ESCENCIAL…………………..……………………………...........III
2.2.1 FIJACION DE Pi EN EL SUELO……………………………………………………......... III
2.3 MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE P (PSM)………………………...........IV
2.3.1 MECANISMOS DE SOLUBILIZACION MICROBIAL DE P……………………………..IV
3. FORMULACION DE PROBLEMA Y JUSTIFICACION……………………………….……….V
3.1 Formulación del problema………………………………………………………………...........V
3.2 Justificación……………………………………………………………………………………….V
3.3 HIPOTESIS………………………………………………………………………………………VI
4. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………….VI
5. MATERIALES Y METODOS……………………………………………………………………VII
5.1 Diseño de la investigación……………………………………………………………………..VII
5.1.1 Población de estudio y muestra…………………………………………………………….VII
5.2 Métodos………………………………………………………………………………………....VII
5.2.1. Aislamiento de microorganismos solubilizadores de Pi…………………………………VII
5.2.2 Prueba In Vitro……………………………………………………………………………….VIII
5.3 Análisis de la información……………………………………………………………………VIII
6. RESULTADOS Y DISCUSION DE RESULTADOS………………………………………… IX
6.1 Aislamiento de microorganismos solubilizadores de Pi ……………………………………IX
6.2 Prueba in vitro……………………………………………………………………………………X
7. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………….….XV
REFERENCIAS………………………………………………………………………………………XVI
Resumen Se realizó un trabajo de investigación que tuvo como objetivo principal aislar microorganismos
solubilizadores de roca fosfórica presentes en la rizosfera y suelo de Vanilla spp. colectadas
de diferentes sitios y evaluar su efectividad para disolver roca fosfórica bajo condiciones in
vitro. Lasolubilización más alta se presentó con tres aislados fúngicos, los cuales se
identificaron como Penicillium sp. y Fusarium sp.
Palabras claves: Roca fosfórica, solubilización, Fusarium sp., Penicillium sp.
1. INTRODUCCIÓN En Colombia el cultivo de la vanilla sp. es muy incipiente, a pesar que se tienen registros de su
presencia en los bosques de la región del Chocó, Costa Atlántica, la región de Urabá, los valles
interandinos, los bosques de la cuenca Amazónica (Bravo, com. pers., Gerente BioAndes
Ltda). Aunque existen algunas plantaciones comerciales todavía no se puede considerar a la
Vanilla spp. como una planta domesticada y aún se desconocen aspectos básicos de este
cultivo.
Las características del cultivo y su hábito de crecimiento en condiciones naturales hacen
necesario buscar aproximaciones distintas al manejo convencional de aplicación de fertilizantes
químicos para el manejo de la nutrición de Vanilla spp. Los roles naturales de los
microorganismos de la rizósfera han sido marginados de las prácticas agrícolas convencionales
y se ha puesto mucha atención en la labranza y el uso alto de insumos (fertilizantes
inorgánicos y plaguicidas). Algunos reportes describen que la utilización intensiva de
fertilizantes químicos puede conducir al daño de las raíces de la Vainilla spp. (Fouché et
al,1999). Además existen riesgos de contaminación ambiental por el uso indebido de estos
compuestos y el consecuente incremento en los costos de producción, particularmente con las
aplicaciones frecuentes (Bravo, com. pers., Gerente BioAndes Ltda)
Los microorganismos benéficos de la rizósfera son determinantes en la salud de la planta y la
fertilidad del suelo porque ellos participan en muchos procesos clave del ecosistema
(Kannaiayan 2003). Entre estos se incluyen el control biológico de patógenos de plantas,
ciclado de nutrientes y establecimiento de las plántulas (Kannaiayan 2003). La mayoría de los
suelos tropicales muestran una marcada deficiencia de fosfato inorgánico (Pi) debido a que
este ion puede ser precipitado por el aluminio, hierro y calcio y/o adsorbido por la arcillas y
óxidos e hidróxidos del suelo (Sylvia et al., 2005). Los microorganismos han desarrollado
estrategias que incrementan la adquisición de Pi para las plantas, tales como la liberación de
ácidos orgánicos y fosfatasas ácidas que incrementan la disponibilidad de Pi en la inmediata
cercanía de las raíces y de hifas de hongos micorrízicos (micorrizosfera) de las plantas. Es
posible detectar microorganismos eficientes en la solubilización de P con el fin de producir
biofertilizantes que mejoren la absorción de Pi, el crecimiento vegetal y reduzcan el uso de
fertilizantes fosfóricos.
En el presente proyecto se pretende aislar algunos microorganismos solubilizadores de fósforo
presentes en la rizosfera de vanilla spp de diferentes sitios y evaluar su efectividad para
disolver roca fosfórica bajo condiciones in vitro.
2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Vanilla spp.
Los indígenas mexicanos de la cultura Azteca utilizaban la vainilla para propósitos medicinales
y para preparar la bebida que denominaban chocolate, pero los primeros en establecer cultivos
en sistemas agroforestales fueron los Totonaca que la consideraban una planta ritual y
medicinal (Colunga-García Marín & Zizumbo-Villareal 2004, Del Angel-Pérez & Mendoza 2004).
En el siglo XVI los conquistadores españoles la llevaron a Europa y desde allí se dispersó
posteriormente hacia las colonias francesas en África y Asia (Cornell 1953). Su cultivo se
extendió gracias al desarrollo del método de polinización manual y de propagación vegetativa.
Vanilla planifolia es la especie más cultivada y produce cerca de un 95% de la vainilla
comercial mundial, aunque también se cultivan otras especies como V. tahitensis en algunos
países del Pacífico (Soto-Arenas 2003). En la actualidad se cultiva en Madagascar que es el
mayor productor con un 60% de la producción mundial y también en Uganda, Isla Comoro, Isla
Reunión, Java, Filipinas, Papua Nueva Guinea, Fidji e India. En América existen cultivos en
México, Costa Rica, Puerto Rico y Brasil. Por ser una planta adaptada a las condiciones
microambientales del interior del bosque tropical, su cultivo requiere sombrío. Para esto, en las
diferentes regiones del mundo donde se cultiva se han desarrollado sistemas agroforestales
adaptados a las condiciones locales (Berninger & Salas 2003, Styger et al., 1999).
Vanilla es un género pantropical con unas 107 especies y se distribuye en todos los
continentes, excepto en Australia, entre los 27° de latitud norte y sur (Soto-Arenas 2003). La
mayoría de las especies se encuentran en América tropical, seguido por el sudeste de Asia y
Nueva Guinea, Africa, las islas del Océano Índico y el Pacífico (Minoo et al., 2007, Bory et al.,
2007). No todas las especies son aromáticas, pues sólo se reconocen unas 35 especies con
esta característica, la mayoría de ellas con origen en América (Soto-Arenas 2003). V. planifolia
se distribuye desde México hasta el sur de Suramérica. La importancia económica de este
cultivo ha motivado varios estudios y programas de colección y conservación de recursos
genéticos (Grisoni et al. 2007, Minoo et al., 2007).
La investigación bajo el esquema del manejo integrado de nutrientes consiste en la
combinación de enmiendas orgánicas, fertilizantes químicos e inoculantes microbianos para
conseguir la nutrición adecuada de un cultivo. Este tipo de sistemas se adapta mejor a los
cultivos, como la vainilla, manejados por pequeños propietarios que no pueden mantener los
altos costos de la aplicación exclusiva de fertilizantes químicos, pero que disponen de mano de
obra familiar (Gruhn et al., 2000, Mc Gregor 2006).
Los inoculantes microbianos son un componente importante en el manejo integrado de
nutrientes pues son costo-efectivos y eco-amigables (Gruhn et al., 2000). El papel de los
microorganismos es descomponer residuos de plantas y material orgánico, incrementar la
disponibilidad de nutrientes para la planta, mantener la fertilidad del suelo y el control de
patógenos de las plantas (Kannaiayan 2003). Los microorganismos se pueden clasificar en
grupos funcionales como bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico, microorganismos
solubilizadores de Pi, celulolíticos y proteolíticos, y hongos micorrízicos entre otros (Sylvia et
al., 2005). Igualmente se deben considerar los mecanismos de interacción que existen entre
diferentes grupos y las implicaciones en el manejo de sistemas de agricultura sostenibles
(Johansson et al., 2004).
Se tiene información que algunos países han desarrollado inoculantes para el cultivo de
vainilla, como es el caso de Costa Rica, pero estos resultados no están publicados porque se
encuentran protegidos por secretos industriales (Santiago Bravo, gerente Bioandes Ltda., com.
pers.).
2.2. Pi COMO NUTRIENTE ESCENCIAL Adicionalmente al nitrógeno, el Pi es uno de los más importantes nutrientes en el crecimiento
de las plantas (Cheng-Hsiung et al, 2009). Este nutriente contribuye a la construcción de
biomasa, obtención de micronutrientes, procesos metabólicos de transferencia de energía,
transducción de señales, biosíntesis de macromoléculas, fotosíntesis, reacciones de
respiración en cadena (Shenoy y Kalagudi 2005). Desafortunadamente este nutriente es uno
de los menos disponibles y móviles en las plantas (Takashi y Anwar 2007). Muchos suelos
tienen una alta reserva de Pi total contando con cerca de un 0,05% en promedio, pero casi
siempre sólo el 0,1% del Pi total está disponible para las plantas (Chen et al, 2006). Una larga
porción de Pi soluble aplicado al suelo como fertilizante químico es inmovilizado rápidamente y
no está disponible para las plantas (Goldstein 1986).
2.2.1. FIJACIÓN DE Pi EN EL SUELO La fijación de Pi es un problema serio en suelos agrícolas, particularmente en los suelos
altamente meteorizados de los trópicos (Sánchez, 1976; Sánchez y Uehara, 1980). Sánchez y
Logan (1992) estimaron que 1018 x 106 ha en los trópicos tienen una alta capacidad de fijación
de P. En América tropical hay 659 x 106 ha afectadas, 210 en África y 199 en Asia. La fijación
de Pi describe las reacciones que remueven iones fosfato biodisponibles desde la solución del
suelo hasta la fase sólida del mismo (Barber, 1995). Hay dos tipos de reacciones: (i) adsorción
de iones Pi sobre la superficie de los minerales arcillosos del suelo y (ii) precipitación de Pi con
cationes de la solución del suelo (Havlin et al., 1999).
La adsorción de Pi es particularmente fuerte sobre óxidos-hidróxidos de hierro y aluminio que
predominan en suelos altamente meteorizados de regiones húmedas y sabanas ácidas
tropicales (Mattlingly, 1975). Los mecanismos de adsorción de Pi son descritos por Bohn et al
(1985): (i) adsorción no específica que consiste en la atracción electroestática que ejercen las
cargas positivas de la superficie de algunos coloides minerales (p.e., óxidos e hidróxidos de
hierro); (ii) adsorción específica que consiste en la sustitución de grupos OH- por grupos H2P04-
en la estructura superficial de algunos coloides minerales.
La precipitación de Pi en los suelos ácidos ocurre cuando los iones Pi reaccionan con las
formas activas de aluminio (AI3+) y de hierro, (Fe3+); mientras que en los suelos neutros y
alcalinos, el Pi se precipita principalmente con calcio (Ca2+) (Bohn et al., 1985). La dominancia
de estos precipitados depende del grado de meteorización y del pH del suelo. El Pi se precipita
inicialmente para formar compuestos amorfos (no cristalinos) los cuales, con el tiempo, llegan a
ser cristalinos, por ende, más insolubles (Brady y Weil, 1999).
2.3. MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE P (PSM)
Muchos microorganismos del suelo pueden solubilizar compuestos fosfatados inorgánicos del
suelo, reversando así los procesos de fijación de Pi (Rao,1992). Bacterias del suelo de los
géneros Pseudomonas, Enterobacter y Bacillus son particularmente activas como
solubilizadores de Pi (Barea et al., 1975; Kim et al., 1998a). Los hongos del suelo,
especialmente aquellos de los géneros Penicillium y Aspergillus, también han demostrado ser
efectivos PSM (Whitelaw, 2000). Aunque las bacterias han recibido gran atención, Kucey
(1983) indicó que los hongos son más efectivos solubilizando compuestos inorgánicos de P.
Mientras que los subcultivos de bacterias pueden perder su habilidad para solubilizar Pi,
subcultivos de hongos pueden mantener esta habilidad. Kucey (1983) encontró en Molisoles de
Canadá que 0,5 % y 0,1 % de la población total de bacterias y hongos, respectivamente,
exhibieron capacidad para solubilizar Pi insolubles.
2.3.1 MECANISMOS DE SOLUBILIZACIÓN MICROBIANA DE P
Varios mecanismos se proponen para explicar la solubilización microbiana de compuestos
inorgánicos de P. Los mecanismos consisten en: (i) producción de ácidos inorgánicos y
orgánicos durante la descomposición de residuos orgánicos (Bar-Yosef et al., 1999); (ii)
excreción de protones debido a la asimilación de NH4+ por los microorganismos (Kucey,1983;
Roos y luckner, 1984; Abd-Alla, 1994; Illmer et al., 1995; Asea et al., 1988; Whitelaw, 2000); (iii)
formación de complejos entre aniones orgánicos (p.e., oxalato y citrato) y cationes en la
solución del suelo que precipitan Pi (AI3+, Fe3+ y Ca2+); y (iv) desorción de iones Pi de los
sitios de adsorción por aniones orgánicos producidos por los PSM (Osorio; 2008).
Kim et al., (1997) encontraron que la producción de acidez fue el principal mecanismo en la
solubilización de una roca fosfórica (hidroxiapatita) por Enterobacter agglomerans bajo
condiciones in vitro. Para efectos de comparación, Kim et al. (1997) emplearon ácido cítrico,
ácido oxálico, ácido láctico y ácido clorhídrico al mismo pH generado por E. agglomerans en
un medio de cultivo. Ellos hallaron que a pH 4,0 – 4,1 (y agitación por 48 – 50 horas) no hubo
diferencias significativas entre la solubilización de Pi producida por ésta bacteria y la producida
por los ácidos cítrico, oxálico y clorhidrico. Sin embargo el ácido láctico presentó una más baja
capacidad (P< 0,05) para solubilizar la hidroxiapatita.
Algunos de los ácidos orgánicos comúnmente asociados con la solubilización microbiana de Pi
son: glucónico (Di simine et al., 1998, Bar-yosef et al., 1999), oxálico, cítrico (Kim et al, 1997;
Kuccey y Legget, 1998), láctico, tartárico y aspártico (Vankateswardu et al, 1984). Estos ácidos
son producto del metabolismo microbiano, en algunos casos por respiración oxidativa o por
fermentación de sustratos carbonados (p.e., glucosa) (Atlas y Bartha 2005; Prescott et al.,
1999; Mathews et al,1999). Se acepta que las reacciones de solubilización de P ocurren en la
rizosfera donde el compuestos carbonados son liberados y donde el P solubilizado puede ser
tomado por la raíz o por el sistema micorrizal. Lynch y Whipps (1990) encontraron que las
plantas pueden liberar a la rizosfera hasta un 40% del carbono total fijado por fotosíntesis.
Muchos microorganismos de la rizosfera son heterótrofos y podrían usar estos sustratos
carbonados para producir ácidos orgánicos.
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 3.1 Formulación del problema
En Colombia el cultivo de la vanilla sp. es muy incipiente, a pesar que se tienen registros de la
presencia de V. planifolia en los bosques de la región del Chocó (Ledezma et al, 2006, Misas,
2005), y reportes de esta especie en la Costa Atlántica, la región de Urabá, los valles
interandinos, los bosques de la cuenca Amazónica (Bravo, com. pers., Gerente BioAndes
Ltda.). y de algunas plantaciones comerciales, todavía no se puede considerar a la V. planifolia
como una planta domesticada, y aún se desconocen aspectos básicos de este cultivo (Soto-
Arenas 2006).
Las características del cultivo y su hábito de crecimiento en condiciones naturales, hacen
necesario buscar aproximaciones distintas al manejo convencional de aplicación de fertilizantes
químicos para el manejo de la nutrición de V. planifolia. Los roles naturales de los
microorganismos de la rizosfera han sido marginados debido a las prácticas agrícolas
convencionales como la labranza y altos consumos de fertilizantes inorgánicos y plaguicidas
(Kohler et al. 2006). Algunos reportes describen que la utilización exclusiva de fertilizantes
químicos puede conducir al daño de las raíces de esta planta (Damiron 2004, Fouché y Jouve
1999), además de los conocidos peligros de contaminación ambiental por el uso indebido de
estos compuestos (Gruhn et al. 2000) y el incremento en los costos de producción,
particularmente asociado a los frecuentes y elevados incrementos de los fertilizantes (Hylton
2008).
3.2 Justificación La nutrición de las plantas se considera como un aspecto clave para aumentar el rendimiento,
logrando así un incremento del número de flores y porcentaje de transformación a frutos, pues
sólo se alcanza entre 30 y 50% de las flores polinizadas y se postula que puede estar ligado,
entre otros factores, al estrés fisiológico (Fouché y Jouve 1999). Los microorganismos benéficos de la rizósfera son determinantes en la salud de la planta y la
fertilidad del suelo porque ellos participan en muchos procesos clave del ecosistema tales
como los que están involucrados en control biológico de patógenos de plantas, ciclaje de
nutrientes y establecimiento de las plántulas (Kohler et al., 2006). Aunque la cantidad de Pi en
algunos suelos es alta, el Pi disponible para plantas y microorganismos es a menudo bajo
debido a la pobre solubilidad de la mayoría de compuestos fosforados y alta capacidad de
fijación de Pi (Hoberg et al.,2005). La mayoría de los suelos tropicales muestran una marcada
deficiencia de Pi debido a que una fracción de este en el suelo se presenta como aniones de
Pi que son adsorbidos por los minerales del suelo, tales como el hierro (Fe) y óxidos de
aluminio (Al), silicatos de aluminio y carbonatos de calcio (Ca), o dependiendo del pH en el
suelo como precipitados poco solubles de fosfato de calcio (Ca-P) en suelos alcalinos y
fosfatos de hierro y aluminio (Fe-P, Al-P) en suelos ácidos (Hoberg et al., 2005) o adsorbidos
por la arcillas (Sato et al., 2006). Los microorganismos han desarrollado estrategias que
incrementan la adquisición de fósforo inorgánico y por lo tanto mejoran la utilización interna de
este, tales como la liberación de ácidos orgánicos y fosfatasas ácidas que incrementan la
disponibilidad de fósforo inorgánico en la inmediata cercanía de las raíces de las plantas (Smith
et al., 2003).
3.3 HIPÓTESIS Existen microorganismos asociados a la rizosfera de las plantas de vainilla sp. con la
capacidad de solubilizar roca fosfórica.
4. OBJETIVOS Objetivo General:
Aislar algunos microorganismos solubilizadores de P presentes en la rizosfera de vainilla
colectadas de diferentes sitios y evaluar su efectividad para disolver roca fosfórica in vitro.
Objetivos Específicos:
Aislar microorganismos solubilizadores de fósforo de la rizosfera de vainillas cultivadas y
silvestres.
Evaluar bajo condiciones in vitro, la efectividad de microorganismos de la rizosfera de vainilla
para solubilizar roca fosfórica.
5. MATERIALES Y MÉTODOS: 5.1 Diseño de la investigación
En todas estas pruebas in-vitro se utilizó un diseño experimental completamente al azar con
cuatro repeticiones; el tratamiento consistió en colocar 75 ml de medio de cultivo junto con
0,75g de roca fosfórica y cada uno de los PSM seleccionados en un agitador orbital a 100 rpm
y temperatura ambiente durante siete días, la unidad experimental y la unidad de muestreo
fueron los 18 microorganismos solubilizadores de fósforo aislados de las raíces de las plantas
de Vanillas spp.
5.1.1 Población de estudio y muestra
Se realizó una exploración en algunos de los sitios donde se habia reportado la presencia V.
planifolia, creciendo en forma silvestre en el país. Se buscó tener representatividad de sitios
con condiciones ambientales contrastantes, principalmente en cuanto a la cantidad y patrón de
distribución de la precipitación anual. Se obtuvieron muestras de suelo rizosférico y raíces de
Vanilla sp nativas de Yopal (Departamento del Casanare), y San Luis (Departamento de
Antioquia), San Jerónimo y San Pedro de Urabá (Departamento de Antioquia) en donde se
plantaron esquejes de plantas traídas de Costa Rica. En cada sitio se seleccionaron cinco
plantas de vanilla sp. de buen desarrollo que no exhibían enfermedades o síntomas visuales de
deficiencias nutricionales. En tales plantas se tomaron muestras de raíces y suelo de la
rizosférico. Las muestras se empacaron en bolsas plásticas de cierre hermético debidamente
marcadas y se trasladaron rápidamente al laboratorio en neveras de icopor con hielo azul, para
mantener una temperatura cercana a los 5 °C. Con estas muestras se realizaron siembras en
medio de cultivo, aislamientos de potenciales solubilizadores y pruebas de efectividad de
solubilización de P a través de la medición del P presente en la solución. Todos estos
procedimientos se realizaron en el Laboratorio de Microbiología del Suelo de la Universidad
Nacional de Colombia, Sede Medellín.
5.2 Métodos
5.2.1. Aislamiento de microorganismos solubilizadores de Pi Muestras de suelo rizósferico (200 g) y porciones de raíces finas (3 g) fueron tomados de
plantas de Vanilla sp. nativas creciendo en suelos con características diferentes, en los
suelos pertenecientes al departamento del Casanare el tipo de humus es el mull ácido tropical,
con composiciones promedio de ácidos fúlvicos y ácidos húmicos superiores a 1.2, la
humificación supera el 80% con un clima tropical (26 - 28ºC), el promedios de precipitación es
de 3048 mm, y un pH inferior a 5 (Malangón, 2003). Los suelos en Urabá tienen un bajo
contenido de materia orgánica, su promedio de precipitación es de 1300 mm, pH superior a 5.6,
(Malangón, 2003).
Los microorganismos solubilizadores de fósforo se aislaron en un medio de cultivo que
contenía como única fuente de fósforo inorgánico la roca fosfórica (fosforita Huila 0-28-0)
(Chien y Hammond, 1978). Todos los medios se esterilizaron en un autoclave por 30 min, a
120ºC y 0,1 MPa. El medio usado para los aislamientos fue desarrollado por Osorio y Habte
(2001) para aislar PSM y contiene 1,0 g de NaCl, 0,2g de CaCl2.2H2O, 0,4 g MgSO4.7H2O,1,0 g
de NH4NO3, 10,0 g de glucosa, 7,0 g de agar y 3,5 g de roca fosfórica por litro de medio.
Además se adicionó 22 mg/l de verde de bromocresol como indicador de pH. Los compuestos
fueron suspendidos en agua desionizada.
Para aislar PSM de suelo rizosférico se prepararon tres diluciones seriadas de suelo (10-4, 10-5,
10-6) con solución salina estéril (CaCl2 0.01M). Alícuotas de 0,5 ml de cada una de las
diluciones se transfirieron a tubos de ensayo que contenían 5 ml de el medio de cultivo. Para
aislar PSM de raíces, estas se lavaron seis veces con solución salina estéril, luego se
transfirieron a tubos similares reservados para las muestras de raíces, el medio inoculado con
las diluciones de suelo o con fragmentos de raíces (rizoplano) y fragmentos de raíces partidos
a la mitad (endorizosfera) se agitaron en un vórtex durante 30 segundos y luego se vertieron
separadamente (por triplicado) sobre las cajas de Petri que contenían agar solidificado (15 g l-
1). Las cajas de Petri se incubaron a 27ºC por 10 días.
Al final del periodo de incubación se consideró que aquellas colonias que se desarrollaron
rápida y abundantemente o exhibían zonas de color amarillo a su alrededor, lo hacían porque
exhibían una capacidad para solubilizar la roca fosfórica a través de la producción de acidez
(Toro et al, 1996). Colonias individuales, así seleccionadas, se transfirieron asépticamente a
cajas de Petri con el medio levadura-manitol-agar (YMA) para su multiplicación. El medio YMA
se preparara con 0,5 g de KH2PO4, 0,2 g de MgSO4.7H2O, 0,1g de NaCl, 10,0 g de manitol, 1,0
g de extracto de levadura y 15 g de agar l-1. El pH del medio se ajusto a 6,0 antes de ser
esterilizado en autoclave. Después de 4 días de crecimiento a 27ºC, colonias individuales se
transfirieron a tubos de ensayo que contienen el medio YMA y luego se almacenaron a 4ºC.
5.2.2 Efectividad de solubilización de P
Se desarrollo una prueba de efectividad de solubilización de P para evaluar la capacidad de los
PSM seleccionados de solubilizar roca fosfórica. Se seleccionaron las colonias individuales de
PSM y posteriormente se transfirieron asépticamente con un asa desde los tubos de ensayo
(Medio YMA) a un erlenmeyer de 250 ml que contenía 75 ml del medio de cultivo sin agar y sin
indicador de pH, previamente esterilizado en autoclave. Los erlenmeyers se incubaron a
temperatura ambiente (24ºC) en un agitador orbital a 100 rpm, con 4 repeticiones. Después de
siete días, el pH del medio se midió con un potenciómetro. Luego, se centrifugaron 30 ml de la
solución durante 10 minutos a 4000 rpm el sobrenadante se filtro con papel filtro Whatman No.
42. El Pi en el filtrado se determinó por el método del azul-molibdato (Murphy y Riley 1962), el
cual se basa en la reacción de dos soluciones de trabajo, esta se realiza en medio ácido
como se ilustra en la siguiente reacción:
H3PO4 + 12 H2MoO4 → P(Mo3O14)4H3 + 12 H2O
Se requiere preparar dos soluciones referidas como Solución A y Solución B.
Para la solución A se disuelven 0.35 g de tartrato de antimonio y potasio en 2.7 L de
agua desionizada o destilada, se adicionan 168 mL de ácido sulfúrico concentrado,
14.43 g de molibdato de amonio, 120 mL de agua desionizada o destilada.
Para la solución B se disuelven 0.428 g de L‐ácido ascórbico en 100 mL de la solución A.
La concentración de P en las soluciones filtradas se determina al compararla con la
intensidad de color de soluciones que tienen una concentración de P conocida,
denominadas soluciones estándar.
Para esto se preparan 10 mL de soluciones estándar con las siguientes concentraciones
0.0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg P L‐1, a partir de la solución de 1 mg P/ L con
CaCl2.2H2O 0.01 M, se complementa con 2.5 mL de la solución B y se agita en vortex
por 10 s, El color azul del complejo fosfo‐molibdato se empieza a formar
inmediatamente.se esperan alrededor de 20 minutos para leer la absorbancia en el
espectrofotómetro a 660 nm. El complejo permanece estable durante 24 horas. Luego,
se grafica absorbancia vs. concentración de P, donde se obtiene la ecuación lineal P=
m (Abs) P es la concentración de fósforo en mg L‐1, m es la pendiente de la línea y Abs
es la absorbancia leída a 660 nm. Esta ecuación permite convertir los valores de
absorbancia en concentración de P (Habte y Osorio , 2001)
5.3 Análisis de la información
La evaluación de los resultados se realizó a través de análisis de varianza y se emplearon
pruebas de separación de medias con un nivel de significancia de α 0.05. Para tal fin se
verificaron los supuestos del análisis de varianza.
6. RESULTADOS Y DISCUSION 6.1 Aislamiento de microorganismos solubilizadores de Pi
Se aislaron PSM en el medio de cultivo, a partir de las muestras de rizosfera, endorizosfera y
rizoplano obtenidas de Vanilla sp. Un total de 18 colonias se seleccionaron por presentar halo
alrededor de las mismas. Los diferentes aislamientos se identificaron a través de letras que
indicaban si el sitio de muestreo era suelo rizósferico (s), rizoplano (r), endorizoplano (e), si el
organismo en cuestión era una bacteria (b), un actinomiceto (a), o un hongo (h), y si la
ubicación de muestreo fue Yopal - Casanare (y), San Jerónimo- Antioquia (j), San Luis-
Antioquia (l), San Pedro de Urabá – Antioquia (u).
La dilución seriada más adecuada fue la de 10-6, en la cual fue posible detectar unidades
formadoras de colonias. En las otras diluciones las colonias fueron demasiado numerosas, sin
que estas pudieran identificarse con claridad. La tabla 3 muestra el número de unidades
formadoras de colonia que crecieron en el medio de cultivo.
La modificación realizada al medio de cultivo al adicionarle un indicador de pH (verde de
bromocresol) fue exitosa dado que fue posible identificar con claridad los potenciales
solubilizadores de Pi a través de sus halos de aclaramiento, aislarlos, y posteriormente
utilizarlos en la prueba in vitro.
La frecuencia de bacterias, actinomicetos y hongos varió de muestra a muestra, los hongos
fueron los más abundantes, seguidos por las bacterias (Figura 1). En general el suelo
rizosférico presentó menor número de microorganismos que el endorizoplano y los
microorganismos aislados del endorizoplano crecieron muy rápidamente sugiriendo una alta
tasa de solubilización de Pi. El aislamiento de hongos está estrechamente asociado a la
superficie de la raíz (epífitos) o dentro de la raíz (endófitos) (Garret 1970) por las siguientes
razones: (1) los minerales del ciclo del P en estas regiones muestran una mayor influencia en
la nutrición de las plantas; (2) la accesibilidad a los exudados de las raíces que son requeridos
para conducir la producción de metabolitos, tales como ácidos orgánicos, involucrados en la
solubilizacion de Pi; y (3) potencial para influir en la sanidad vegetal a través de otros medios,
como el aumento de la base de la capacidad de absorción de minerales o nutrientes ( mediante
asociaciones micorrizas), alteración de la arquitectura de la raíz (Gulden y Vessey 2000),
mediante el control de patógenos de plantas o estimulando directamente los mecanismos de
defensa de la planta (Whipps 1997) .
Tabla 3. Número de unidades formadoras de colonia de PSM por gramo de suelo rizosférico
(s), rizoplano (r), o endorizoplano (e).
Sitio Muestra Bacterias Hongos Actinomicetos
Yopal (y) s
r
e
2x104
1x105
1x103
3x105
1x104
4x104
10 X 102
15 X 102
14 X 102
San Jerónimo (j) s
r
e
1x102
1x102
1x102
1x102
1x102
1x102
5 X 102
7 X 102
9 X 102
San Luis (l) s
r
e
1x102
1x102
1x102
2x102
2x102
3x102
10 X 102
11 X 102
9 X 102
San Pedro de Uraba (u) s
r
e
75x103
5x104
6x105
15x104
2x104
3x105
8 X 102
7 X 102
5 X 102
Figura 1. Cajas de petri conteniendo el medio de cultivo inoculado con raíces de Vanilla sp.
tomadas de suelos de Yopal (Casanare), Nótese los halos de color amarillo y el crecimiento de
algunos PSM alrededor de las raíces.
6.2 Prueba in vitro
Diez y ocho aslamientos se seleccionaron y se evaluaron in vitro. Los resultados muestran que
la habilidad de los aislamientos para solubilizar roca fosfórica varió ampliamente (Figura 2),
como fue reportado por Wakelin et al. (2004). A través de esta prueba se puso en evidencia la
habilidad de los diferentes microorganismos de solubilizar roca fosfórica, ya que este método
permite medir la concentración de Pi en una solución, fundamentado en la formación de un
complejo fosfo-molíbdico, el cual exhibe una coloración azul, que se hace más intensa de
acuerdo a la concentración de Pi; esto permite que una vez establecido un modelo de regresión
entre la intensidad del color y la concentración de Pi, se pueda determinar con exactitud la
concentración de Pi en una muestra.
En algunos erlenmeyers los hongos produjeron grandes cantidades de mucílago. En estos
casos, el Pi en solución era típicamente bajo, lo que sugiere que los hongos se encontraban en
diferentes estados fisiológicos o que el Pi se habría incorporado en esta matriz orgánica. En
otros erlenmeyers la producción del mucílago fue mínima y el Pi en solución fue mucho mayor
(Figura 3).
Los aislamientos shj2, ehy1, ehy 4 (Figura 4) mostraron una diferencia estadísticamente
significativa con respecto a la variable concentración de P en solución (P < 0,05) y
sobresalieron en la prueba in vitro por generar una mayor acidez y una mayor concentración
de P en el medio de cultivo líquido (Tabla 4). Esto podría deberse a que muchos
microorganismos pueden movilizar a partir de compuestos inorgánicos Pi simplemente bajando
el pH que se produce como resultado de la actividad metabólica general (Asea et al., 1998). La
exudación celular de H+ para balancear la toma de NH4+ también puede bajar el pH de la
solución e incrementar la solubilización de algunas formas de fosfatos de calcio (Asea et al.,
1998).
Figura 2. Relación entre el pH y la concentración de P en el medio líquido inoculado o no con
microorganismos solubilizadores de P.
Tabla 4. pH y concentración de P en el medio líquido inoculado con selectos PSM
Aislado pH de la solución Concentración de P en la solución (mg L-1)
Rby 7,8 0,43 ehy1 3,8 33,39 ehy2 7,5 0,47 ehy3 7,2 0,25 ehy4 3,7 22,30 shy1 8,0 0,36 rhu1 8,0 0,30 rhu2 7,9 0,60 rhu3 7,6 0,12 shy2 6,4 0,01 shy3 7,7 0,31 ehu2 7,6 0,08 ehu3 7,8 0,09 ehu4 7,7 0,09 ehu5 7,5 0,03
Con
cent
raci
ón
de
P m
g L-1
shj1 7,7 0,36 shj2 4,7 1,15 shj3 7,5 0,01 control 7,8 0,41
(a)
(b)
Figura 3. (a) Aspecto de un erlenmeyer con gran cantidad de mucílago en su interior. (b)
Erlenmeyer con poca cantidad de mucílago en su interior.
Figura 4. Aislamientos shg2, ehy4, ehy1 en el medio de cultivo 1, a los cuatro días de
incubación y 24ºC de temperatura.
Basándose en observaciones morfológicas macroscópicas y microscópicas y claves de
identificación de hongos (Samson et al 1981), los aislamientos shg2 y ehy4 pertenecen al
género Penicillium mientras que el aislamiento ehy1 pertenece al género Fusarium.
Los hongos del género Penicillium (incluyendo el estado telemorfo Talaromyces y
Eupenicillium) son considerados claves en la microbiota del suelo, ya que son importantes en el
ciclaje del Pi y han sido frecuentemente aislados de superficies lavadas y desinfectadas de las
raíces de trigo creciendo en suelos de cultivo (Whitelaw 2000, Wakelin 2004). Su actividad
como solubilizador de Pi es atribuida a la producción de ácidos orgánicos que pueden
directamente disolver precipitados de Pi, y quelatando Ca, Fe, y Al de compuestos (Kucey et
al. 1989, Gadd 1999). Riew (1996) aisló tres especies de Gliocladium los cuales son similares a
Penicillium en su morfología y la producción de algunos antibióticos como gliotoxina o viridina
(Domsch et al. 1980). Algunas especies de Gliocladium actúan como débiles patógenos de
orquídeas, y producen algunos antibióticos influenciando otra microbiota en el suelo (Domsch
et al., 1980). Wakelin et al. (2004) demostraron que Penicillium spp. suele exhibir capacidades
especiales tales como la solubilización de minerales, control biológico y producción de un
amplio rango de metabolitos secundarios.
Hongos fitopatogénos de los géneros Fusarium, Ascorhizoctonia y Rhizoctonia fueron aislados
de las raíces de las orquídeas que crecen en invernadero. Fusarium y Ascorhizoctonia
producen una pudrición suave y seca de raíz en grandes cultivos de invernadero (Nelson et al.,
1983, Kommedahl et al., 1988; Choi et al., 1997., Peterson 1991). Fusarium graminearum, F.
oxysporum, F subglutinans, y dos especies desconocidas se han encontrado asociadas a las
raíces de orquídeas.
Diferentes usos de Fusarium en biocontrol comprueban la utilidad de este género, las
interacciones de F. verticillioides con plantas de maíz registraron durante varios años el
aumento de enraizamiento (Bacon y Williamson 1992) y la lignificación de las raíces de las
plántulas (Yates et al, 1997); además sugieren posibles interacciones mutualistas derivadas de
estas asociaciones, incluyendo insecticidas (Abado-Becognee et al, 1998), nematicidas
(Hallmann y Sikora 1994a, 1994b ) y actividades fungicidas (Damicone and Manning
1982;Lemanceau et al., 1993).
Se ha establecido que todas las cepas de F. verticillioides pueden desintoxicar el anfitrión
nativo de maíz de los compuestos antimicrobianos, las benzoxazinas (Glenn y Bacon 1998;
Glenn et al., 2001, 2002). La capacidad para detoxificar estos compuestos, de los cuales puede
haber concentraciones elevadas en las raíces (Xie et al., 1991), ha sido interpretada como un
mecanismo por el cual no es impedida la colonización de endófitos, ya que las benzoxazinas
son especialmente tóxicas para los hongos (Xie et al., 1991; Schulz y Wieland 1999; Sicker et
al., 2000; Glenn et al., 2001, 2002).
La mayoría de especies de Fusarium examinadas producen ácido fusárico (Bacon et al., 1996),
el cual inhibe el crecimiento de la mayoría de las cepas de bacterias endófitas y rizosféricas
(Notz et al., 2002; Bacon et al., 2004), con una amplia actividad.
El ácido fusárico es un antibiótico que muestra actividad contra bacterias Gram-positivas y
Gram negativas, especialmente las utilizadas para control biológico. Este ha demostrado
interactuar con los genes utilizados específicamente por la bacteria biocontroladora
Pseudomonas fluorescens mediante la prevención de la expresión de genes que codifican
como inhibidores específicos de hongos (Notz et al., 2002). Un modo de acción similar se ha
establecido para la expresión del gen DON, que impide la producción de la quitinasa por el
agente de biocontrol Trichoderma atroviride (Lutz et al., 2003).
La beauericina muestra fuertes propiedades selectivas insecticidas (Vesonder y Hesseltine
1981; Plattner y Nelson 1994; Logrieco et al., 1998) y es producida por al menos doce especies
del genero Fusarium (Logrieco et al., 1998). Mas sin embargo el conocimiento del espectro de
la actividad de los metabolitos secundarios para la mayoría de Fusarium es incompleta.
Los hongos aislados dentro de este proyecto se utilizarán en otros proyectos de investigación
dentro de los cuales se realizaran pruebas moleculares para hallar su especie.
7. CONCLUSIONES
Se aislaron microorganismos solubilizadores de P de suelo rizosférico y raíces de Vanilla sp
creciendo naturalmente en diferentes sitios y en cultivos, encontrándose mayor cantidad de
microorganismos con esta capacidad en las plantas silvestres.
La adición de indicador de pH al medio de cultivo permitió una clara diferenciación de los
microorganismos con potencial solubilizador.
La prueba de efectividad de solubilización de P permitió medir la capacidad solubilizadora de
roca fósforica de cada uno de los microorganismos seleccionados.
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