UNIDAD 4 CRECIMIENTO MICROBIANO

Crecimiento microbiano

En microbiología el crecimiento se define como el incremento en el número de células.

• La bipartición (fisión binaria) es el proceso por el cual una célula se divide para formar dos células iguales.

• El intervalo que transcurre en la formación de dos células a partir de una célula se llama generación y el tiempo requerido para esto es el tiempo de generación o tiempo de duplicación.

Fisión binaria

Durante la fisión binaria cada célula hija recibe una copia del cromosoma, de los ribosomas, complejos macromoleculares, así como monómeros y iones inorgánicos para existir como una célula independiente.

El ADN se ancla a la membrana y así, cada célula hija se queda con una copia.

Se forma un septo que dará lugar a cada una de las células, las envolturas rodean a cada copia del ADN y finalmente se da la separación de las células.

Durante la división celular intervienen varias proteínas que han sido llamadas: Fts, filamentous temperature sensitive

Se encuentran ampliamente distribuidas en procariotas incluyendo Arqueas

FtsZ tiene una estructura similar a la tubulina (división celular de eucariotas).

Proteínas Fts

Proteínas Fts

Las proteínas Fts (filamentous temperature sensitive) interactúan para formar el aparato de división llamado divisoma. • FtsZ polimeriza y forman una anillo en el centro de la célula. • FtsA es una enzima ATP hidrolasa que provee la energía para ensamblar proteínas en el divisoma. • ZipA ancla a FtsZ a la membrana citoplasmática. • FtsI es una proteína involucrada en la síntesis de péptidoglucano y es también llamada proteína de unión a penicilina (su actividad es bloqueada por el antibiótico).

FtsZ se encuentra en diferentes puntos del citoplasma y desaparece de éste en el momento de la división celular ubicándosele en el centro formando el anillo

Cuando la célula se alarga se sintetiza la nueva pared celular. Este material se añade a la pared preexistente sin que se pierda la integridad celular.

En la zona del anillo FtsZ se forman poros que son creados por autolisinas presentes en el divisoma. El nuevo material se añade a través de estas aberturas.

A medida que progresa la elongación celular las dos copias del cromosoma se separan y cada uno termina en una célula hija. Cuando ocurre la constricción, el anillo FtsZ comienza a despolimerizarse y se dispara la síntesis de pared celular para sellar una región con la otra.

Autolisinas

Pequeñas aberturas son llevadas a cabo por las enzimas autolisinas que tiene una función similar a la lisozima.

Las autolisinas se encuentran presentes en el complejo divisoma.

La síntesis del nuevo peptidoglocano deja en la células Gram positivas una cicatriz.

Las aberturas y la síntesis debe ser coordinada para evitar la autolísis de la célula.

Proteínas Min La replicación del DNA ocurre antes de que se forme el anillo FtsZ, el cese de esta síntesis parece ser la señal para la formación del anillo y esta estructura aparece precisamente en el espacio situado entre los dos nucleoides.

La localización del punto medio real parece ser debida a una serie de proteínas llamadas Min, especialmente MinE

A medida que progresa la elongación celular las dos copias del cromosoma se separan y cada uno termina en una célula hija.

Proteína MreB y la forma de las bacterias

La presencia de la proteína MreB se ha relacionado con la forma de las bacterias no cocoides.

• FtsZ tubulina bacteriana. • MreB actina bacteriana.

Nature Cell Biology  5, 175 - 178 (2003)

Crecimiento exponencial

Cuando un cultivo se duplica de manera regular durante un intervalo de tiempo, se denomina crecimiento exponencial.

Una gráfica aritmética del crecimiento muestra un incremento constante mientras una logarítmica (log10) permite observar con respecto al tiempo cuando el crecimiento es exponencial y puede entonces calcularse el tiempo de generación.

Tiempo de generación

Tiempo de generación es el tiempo requerido para que una célula se divida o una población se duplique.

Si partimos de una célula, al cabo de una generación habrá duplicado su número y así sucesivamente en cada generación.

Como se puede comprobar el crecimiento se produce en progresión geométrica:

1 generación -------------> 2 células

2 generaciones -------------> 4 células 3 generaciones -------------> 8 células

4 generaciones -------------> 16 células 5 generaciones -------------> 32 células

t G = -------- n

G= Tiempo de generación t= tiempo de crecimiento exponencial n= número de generaciones

Tiempo de generación

log N - log No log N - log No n = ___________________ n = ____________________ n = 3.3 (log N - log No)

log 2 0.301

N = No2n

log N = log No + n log 2

To -------------> No 1 generación -------------> 2No = No21 2 generaciones -------------> 4No = No22 3 generaciones -------------> 8No = No23 4 generaciones -------------> 16No = No24 5 generaciones -------------> 32No = No25 n generaciones (T) -------------> N = No2n

t G = ___________________________

3.3 (log N - log No)

Tiempos de duplicación

Bacteria

Medio Tiempo de duplicación

(minutos) Escherichia coli Glucosa-sales 17

Bacillus  megaterium Sacarosa-sales 25

Streptococcus lactis Leche 26

Staphylococcus aureus Medio de infusión de corazón

27-30

Streptococcus lactis Medio con lactosa 48

Lactobacillus acidophilus Leche 66-87

Rhizobium japonicum Manitol-sales-extracto de levadura

344-461

Mycobacterium tuberculosis Medio definido 762-932

Treponema pallidum Testículos de conejo 1980

Curva de crecimiento

A

B

CD

E

Tiempo

Log

de

l nú

me

ro d

e

mic

roo

rga

nism

os

Curva de crecimiento

• A (Fase Lag). Periodo de latencia o adaptación: no hay aumento significativo de la densidad celular, el crecimiento es asincrónico. • B (Fase Log). Periodo de crecimiento exponencial, el crecimiento es sincrónico y se alcanza la máxima velocidad de crecimiento. • C (Fase pre-estacionaria). Periodo de retardo desaparece el crecimiento exponencial, los microorganismos entran en estrés. • D (Fase estacionaria). Periodo estacionario: no hay cambios significativos de la densidad celular con respecto al tiempo, existe un equilibrio entre los microorganismos vivos y muertos. • E (Fase de muerte). Fase en la que el equilibro desaparece y predominan los microorganismos muertos. No hay nutrientes para el recambio y las condiciones del medio de cultivo son adversas para el crecimiento.

Tipos de cultivo

• Cultivo en lote

• Cultivo en lote alimentado

• Cultivo en contínuo

•  El cultivo cerrado se realiza en sistemas con medio de cultivo en volumen fijo no renovado. Es decir el crecimiento ocurre hasta que el medio de cultivo modificado por los microorganismos ya no permite su desarrollo.

•  En cultivos cerrados la

concentración de nutrientes afecta la velocidad de crecimiento

Cultivo cerrado

¢  Para el cultivo contínuo se utiliza un sistema abierto con volumen constante al que se adiciona medio de cultivo fresco para renovar el que ha sido usado por los microorganismos.

¢  En éste tipo de cultivo se trata de conservar la población en constante crecimiento, es decir en fase logarítmica.

¢  El quimiostato es el aparato que se utiliza para obtener un cultivo contínuo, controla la densidad celular y la velocidad de crecimiento.

Cultivos contínuos: Quimiostato

Ventajas :

• Permite mantener al cultivo en fase exponencial durante días e incluso semanas.

• Pueden aislarse microorganismos.

Cultivos contínuos: Quimiostato

Efectos ambientales sobre el crecimiento bacteriano

Temperatura

(2). Las reacciones enzimáticas aumentan su velocidad. (3). Las reacciones enzimáticas se llevan a cabo a su máxima velocidad. (4). Desnaturalización de proteínas y membrana citoplasmática. Lisis térmica.

Óptimo

Temperatura

Máximo Mínimo

(1)

(2)

(3)

(4)

Velocidad de crecimiento

(1). Gelificación de la membrana; los procesos de transporte se llevan a cabo lentamente y no hay crecimiento.

Temperatura.

Temperatura. Clasificación.

Clasificación de microorganismos de acuerdo a su temperatura óptima de crecimiento

Psicrófilos 0 - 20°C Flavobacterium sp. 13ºC

Mesófilos 20 - 40°C Escherichia coli 37ºC

Termófilos 40 – 60°C Geobacillus stearothermophylus 60ºC (

Hipertermófilos 60 – 80°C Thermococcus celer

Termófilos extremos > 80°C Pyrodictium brockii

Psicotróficos: Microorganismos que crecen a temperatura ambiente pero causan contaminación en condiciones de refrigeración.

Temperatura.

Nature 409, 1092-1101 (22 February 2001)

Cepa 121

¢  Una gran aplicación: ¢  La enzima fundamental para la Reacción en

Cadena de la Polimerasa (PCR), que permite la amplificación de pequeñísimas cantidades de ADN, procede de una bacteria termófila aislada de fuentes termales. Su enzima soporta ciclos repetidos de calor que alcanzan los 80°C. (son condiciones desnaturalizantes para la mayoría de las enzimas)

Half to Dr Kary B. Mullis, La Jolla, California, U.S.A., for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method, and half to Professor Michael Smith, University of British Columbia, Vancouver, Canada, for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies.

1993

Microorganismos patógenos

E. coli

Helicobacter pylori

Candida albicas

Trichomonas vaginalis

pH

Microorganismos pH 1

2

Acidófilos 3

4

5

6

Neutrófilos 7

8

9

10

Alcalófilos 11

12

13

14

pH

pH 8.8–8.3

Nature 409, 1092-1101 (22 February 2001)

pH 3.3–3.5

Temperature and pH requirements for growth distinguish thermophilic bacteria and archaea.

Nature Reviews Microbiology 5, 316-323 (April 2007)

Zona en la que las bacterias están mejor adaptadas.

Zona en la que las arqueas están mejor adaptadas.

Zona en la que ambas están bien adaptadas.

Oxígeno

Enzimas Metabolismo Ejemplos

Aerobios Obligados Es necesario para el crecimiento,

contiene SOD y catalasa. Respiración

aerobia Micrococcus luteus

P. aeruginosa

Facultativos Crecen mejor en presencia de oxígeno, presentan SOD y

catalasa.

Respiración aerobia,

anaerobia y fermentación

Enterobacter sp. S. cerevisiae

Microaerofílicos Requieren baja concentración de O2, presentan SOD y catalasa.

Respiración aerobia

Spirillum vollutans

Anaerobios Aerotolerantes No requieren O2, pero crecen en

su presencia. Sólo SOD. Fermentación S. pyogenes

Clostridium sp.

Obligados El O2 es letal, no contiene enzimas destoxificantes

Fermentación o respiración anaerobia

Metanobacterium formicicum

Relación con el O2

Aerobio facultativo

Microaerofílico Anaerobio aerotolerante

Anaerobio obligado

Aerobio obligado

Crecimiento en medio fluido de Tioglicolato.

Cultivo de anaerobios

Jarra de anaerobiosis

NaHCO3 + NaBH4 + O2 → CO2 + H2O + H2

Enzimas destoxificantes

O2 + e- → O2- Superóxido

O2- + e- + 2H+ → H2O2 Peróxido de hidrógeno

H2O2 + e- + H+ → H2O + OH. Radical hidroxilo HO. + e- + H+ → H2O Agua Reacción general: O2 + 4e- + 4H+ → 2H2O

Peroxidasa H2O2

+ NADH + H+ → 2H2O + NAD+

Superóxido dismutasa (SOD) O2

- + O2- + 2H+ → H2O2 + O2

Catalasa H2O2 + H2O2 → 2H2O + O2

Concentración de solutos

Concepto Definición

No Halófilos Crecen en concentraciones de 1-6 % de NaCl

Halófilos moderados Crecen en concentraciones de 6-15% de NaCl

Halófilos extremos Crecen en concentraciones de 15-30% de NaCl

Halotolerantes Toleran disminuciones en el aw pero crecen mejor en ausencia de solutos.

Osmófilos Son capaces de vivir en altas concentraciones de azúcares.

Xerófilos Crecen en condiciones de aw bajo.

Actividad del Agua aw es la relación entre la presión de vapor del aire en equilibrio con una sustancia o solución a la presión de vapor a la misma temperatura del agua pura.

aw Medio de crecimiento

Microorganismos que desarrollan

1.000 Agua pura Caulobacter, Spirillum

0.995 Sangre humana Streptococcus, Escherichia 0.980 Agua salada Pseudomonas, Vibrio

0.950 Pan Muchos cocos G+

0.900 Miel de maple, jamón Cocos G-

0.850 Salami Saccharomyces rouxii

0.850 Pastel de frutas, jalea Saccharomyces bailii, Penicillium

0.800 Lagos salados Halobacterium, Halococcus

0.750 Cereales, dulces, frutas secas

Xeromyces bisporus y otros hongos xerófilos.

¢  En la mayoría de los casos, el citoplasma tiene una conc. de solutos mayor a la del medio, sin embargo, cuando es al revés, existe la tendencia a salir agua de la célula.

¢  El agua de mar tiene aprox 3% de NaCl. Los µoos marinos tienen una alta dependencia del ión Na+: halófilos.

¢  Halófilos discretos: 1-6% NaCl ¢  Halofilos moderados: 6-15% NaCl ¢  Halófilos extremos: 15-30% NaCl

¢  Halotolerantes: Pueden soportar alguna reducción de la aW del medio, pero generalmente crecen mejor en ausencia de solutos añadidos

Solutos compatibles

Son compuestos que forman los microorganismos para compensar la concentración de solutos exterior.

• Aminoácidos: Glicina-betaína y ectoina

• Carbohidratos: Sacarosa y trehalosa • Poli alcoholes: Manitol y glicerol • Otros: KCl y propionato dimetilsulfónico (PDS)

N

CH3

CH3

CH3 CH2 COO-

Glicina-Betaina

CH2

CH3

CH2 N

C C N COO-

Ectoina

Formación de solutos compatibles

Organismo Soluto principal aw máximo Bacterias no fotótrofas Glicina betaína , prolina (G+),

glutamato (G-) 0.97 – 0.90

Cianobacterias de agua dulce Sacarosa, trehalosa 0.98

Cianobacterias marinas Algas marinas

α-glucosilglicerol Manitol, glucósidos, prolina,

PDS

0.92

Cianobacterias de lagos salados Glicina betaína 0.90 – 0.75

Bacterias fototrópicas, anoxigénicas halofílicas

( Ectothiorhodospira)

Glicina betaína. Ectoína, trehalosa

Arqueas halófilas extremas (Halobacterium) y algunas bacterias (Haloanaerobium)

KCl 0.75

Alga verde halofílica (Dunaliella) Glicerol 0.75

Levaduras xerófilas Glicerol 0.83 – 0.62

Hongos filamentosos xerófilos Glicerol 0.72 – 0.61