Uso del microscopio ottico. Preparazione di un vetrino a fresco. Osservazioni al microscopio ottico degli organelli della cellula vegetale

Laboratorio didattico n.1

•IL MICROSCOPIO OTTICO DA BIOLOGIA

•LA CELLULA VEGETALE:

Parete cellulare:

•lamella mediana

•parete primaria

•parete secondaria

Nucleo

Vacuolo

Plastidi:

• cloroplasti

• amiloplasti

• cromoplasti

MICROSCOPIA

Il microscopio (dal greco: μικρόν (micron) piccolo e σκοπεῖν

(skopein) guardare) è uno strumento che consente di risolvere

e ingrandire oggetti di piccole dimensioni per permetterne

l'osservazione diretta o indiretta tramite fotografia e sistemi

elettronici.

Può essere ottico, e quindi basato sull'osservazione nell'ambito

dello spettro elettromagnetico della luce in senso lato,

elettronico basato sull'osservazione tramite fasci di elettroni, o

di altro tipo.

I primi strumenti efficaci vennero prodotti in Olanda alla fine del

XVI secolo, ma l'invenzione vera e propria è tuttora

controversa.

Il Microscopio Ottico

Costituenti: Parte meccanica

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Costituenti: Parte meccanica

La parte meccanica deve essere robusta e relativamente pesante per

consentire la necessaria stabilità al sistema. Lo stativo rappresenta il corpo

principale del microscopio ed ha la funzione di fare da supporto ai

meccanismi di movimento e di messa a fuoco ed alla parte ottica. La parte

meccanica del microscopio alloggia anche il sistema di illuminazione, in

caso di sistemi con illuminazione incorporata.

Il preparato da osservare si pone sul tavolino portaoggetti, dotato di un

carrello traslatore per mezzo del quale il preparato può essere spostato

agevolmente eventualmente con movimenti meccanici micrometrici nelle

direzioni destra-sinistra e avanti-indietro. Al di là del tavolino portaoggetti,

verso l'illuminazione si trova un supporto meccanico che ospita il

condensatore ed il diaframma di apertura. Ancora oltre, prima

dell'illuminatore, si trova il diaframma di campo. Il microscopio deve

essere dotato di un sistema molto accurato di messa a fuoco sia del

preparato che del sistema di illuminazione. Il tavolino portaoggetti viene

spostato verticalmente rispetto all'obiettivo tramite i comandi di messa a

fuoco macrometrici e micrometrici (o alternativamente si può spostare

l'ottica rispetto al tavolino). Il condensatore focalizza correttamente

l'illuminazione sul preparato, il collettore focalizza la sorgente luminosa in

un particolare piano ottico del condensatore.

Costituenti: Parte funzionale

La parte funzionale, in genere chiamata ottica per gli strumenti basati sull'utilizzo della luce, è

formata da tre o quattro sistemi di lenti e dalla sorgente, che, nei sistemi composti a

radiazione trasmessa, partendo dalla base del microscopio, sono:

la sorgente

il collettore della sorgente o condensatore di campo, col diaframma di campo

il condensatore con il diaframma di apertura

l'obiettivo l'oculare.

La porzione di microscopio nella quale vanno

posizionati gli obiettivi multipli, se presente,

che possono essere scelti in base all'ingrandimento

si chiama revolver.

Il microscopio ottico utilizza come sorgente

la luce, intesa in senso generale come

radiazione elettromagnetica dal vicino

infrarosso all'ultravioletto, anche se i

microscopi più diffusi utilizzano proprio la

radiazione visibile, ha risoluzione

tipicamente minore rispetto al microscopio

elettronico, ma è generalmente economico e

fornisce immagini a colori anche di organismi

viventi. Con il microscopio ottico si possono

ad esempio distinguere i batteri.

Braccio

dello

stativo

Basamento

dello stativo

Vite

micrometrica

Vite

macrometrica

Tubo

oculare

Oculari

Obiettivi

Tavolino

portaoggetti

Condensatore

Fonte

luminosa

Viti per la

traslazione

orizzontale

del tavolino

Revolver

portaobiettivi

IL MICROSCOPIO OTTICO DA BIOLOGIA

1. Accendere il microscopio

2. Ruotare il revolver portaobiettivi

mettendo in posizione l’obiettivo a

minore ingrandimento (il più corto)

3. Montare il vetrino sul tavolino

portaoggetti

4. Traslare il vetrino con le viti per la

traslazione orizzontale, fino a portare il

preparato nel campo visuale

5. Mettere a fuoco il preparato con la vite

macrometrica

6. Aggiustare il fuoco con la vite micrometrica

7. Mettere in posizione l’obiettivo a maggiore ingrandimento

8. Aggiustare il fuoco con la vite micrometrica

9. Prima di rimuovere il vetrino dal tavolino portaoggetti, ruotare il revolver portaobiettivi

mettendo in posizione l’obiettivo a minore ingrandimento

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COME SI PREPARA UN VETRINO A FRESCO

LA CELLULA VEGETALE

Parete cellulare

Lamella

mediana

Parete

secondaria

Parete

primaria Cellula 1

Cellula 2

LAMELLA MEDIANA (in comune

tra cellule contigue):

Sostanze pectiche

No cellulosa

STRATI DELLA PARETE CELLULARE

Questa immagine della parete cellulare di 2 cellule contigue è stata effettuata al

microscopio elettronico a trasmissione. Osserviamo la lamella mediana a contatto

tra le 2 cellule ed all’interno di ogni cellula la parete primaria e secondaria

PARETE PRIMARIA (si forma

all’interno della lamella mediana):

- FASE FIBRILLARE: cellulosa

- FASE MATRICIALE:

• H2O (70% del peso fresco)

• emicellulose

• sostanze pectiche

• proteine

Lamella

mediana

Parete

secondaria

Parete

primaria Cellula 1

Cellula 2

STRATI DELLA

PARETE CELLULARE

FASE DI MATRICE

(amorfa)

• Emicellulose

• Pectine

• H2O

• Proteine

• Composti fenolici

ARCHITETTURA DELLA

PARETE PRIMARIA

FASE MICROFIBRILLARE

• cellulosa

PARETE SECONDARIA (si forma

all’interno della parete primaria):

• Percentuale di fibrille di cellulosa

assai maggiore rispetto alla matrice

• Può essere formata da più strati

(generalmente 3)

•Spesso impregnata di sostanze

idrofobiche (lignina, suberina)

Lamella

mediana

Parete

secondaria

Parete

primaria Cellula 1

Cellula 2

STRATI DELLA

PARETE CELLULARE

E’ possibile osservare la parete

secondaria lignificata nei tessuti

meccanici e nei vasi xilematici

Ispessimenti lignificati

nella parete secondaria

di vasi legnosi

PER OSSERVARE

LE

CARATTERISTICHE

DI UN TESSUTO

EPIDERMICO AL

MICROCSOPIO

OTTICO

UTILIZZIAMO UNA

SPELLATURA DI

CIPOLLA

1. Prelevare un catafillo (foglia carnosa con funzione di riserva) di cipolla

2. Ottenere una spellatura della parte convessa del catafillo

3. Con l’ausilio della lametta tagliare un frammento della spellatura

4. Porre il frammento in una navicella contenente il Rosso Rutenio

5. Attendere 1 minuto circa e trasferire il frammento un un’altra navicella

contenente acqua

6. Dopo circa 30 secondi montare su vetrino il frammento su una goccia di

acqua, chiudere il preparato con un vetrino coprioggetto, montare il

vetrino sul microscopio

SPELLATURA DI CIPOLLA TRATTATA CON

ROSSO RUTENIO

SPELLATURA DI CIPOLLA TRATTATA CON

ROSSO RUTENIO

Il Rosso Rutenio colora in fucsia le pectine e le

emicellulose

PER OSSERVARE LE SCLEREIDI (CELLULECON PARETE

CELLULARE LIGNIFICATA): UTILIZZAIMO LA POLPA DI PERA

COLORATE CON BLU DI TOLUIDINA

Il Blu di Toluidina colora in azzurro la lignina

LA CELLULA VEGETALE

Vacuolo

VACUOLO IN CELLULE EPIDERMICHE DI CIPOLLA

ROSSA

Ottenere una spellatura di catafillo, come precedentemente descritto per la cipolla bianca

ed osservare direttamente. La maggior parte delle cellule risultano rosso-viola per la

presenza di antociani nel grande vacuolo centrale. Le cellule chiare si sono rotte nella

preparazione ed hanno perso gli antociani. Si può osservare il citoplasma ridotto in un

sottile strato a ridosso della membrana plasmatica

OSSERVIAMO COSA ACCADE NELLE

CELLULE VEGETALI IN RISPOSTA ALLE

VARIAZIONI DI CONCENTRAZIONE DELLE

SOLUZIONI CON CUI POSSONO VENIRE

IN CONTATTO: FENOMENO CHIAMATO

PLASMOLISI

LA RISPOSTA DELLA CELLULA VEGETALE ALLE

VARIAZIONI DI CONCENTRAZIONE DELLE SOLUZIONI

DELL’AMBIENTE ESTERNO. PER FARE L’ESPERIMENTO

METTIAMO UNA SPELLATURA DI CIPOLLA A CONTATTO

CON UNA SOLUZIONE CONCENTRATA DI ACQUA E

ZUCCHERO O SALE

Concentrazione interna di soluti

LA CELLULA VEGETALE

I PlastidiPER OSSERVARE I PLASTIDI AL

MICROSCOPIO OTTICO POSSIAMO

UTILIZZARE LE ALGHE CHE HANNO I

CLOROPLASTI MOLTO GRANDI

CLOROPLASTO NASTRIFORME DI Spirogyra

(ALGA VERDE: CHLOROPHYTA)

Mettiamo un filamento di alga su un vetrino portaoggetti con una goccia di

acqua. Copriamo con il vetrino copri-oggetti ed osserviamo

Possiamo osservare i cloroplasti al microscopio ottico anche

prendendo una fogliolina (filloide) di muschio

Mettiamo la fogliolina sul vetrino con una goccia di acqua ed osserviamo

immediatamente

AMILOPLASTI DI PATATA COLORATI CON IODO-IODURO

•Porre su vetrino una goccia di Reattivo di Lugol (che colora l’amido in viola scuro)

•Raschiare con lametta una piccola quantità di parenchima amilifero

•Montare sulla goccia la raschiatura

•Chiudere il preparato con vetrino coprioggetto ed osservare

Dopo la colorazione

Prima della colorazione

POSSIAMO OSSERVARE LA CONVERSIONE DEI

CLOROPLASTI IN CROMOPLASTI FACENDO SEZIONI DI

POLPA DI PEPERONI VERDI E ROSSI

Materiale vegetale incluso in gel e tagliato con

microtomo a vibrazione

La DisidratazioneE’ il passaggio che permette la sostituzione dell’acqua contenuta nel tessuto con unsolvente dei mezzi di inclusione (Paraffina o resine)

La disidratazione si effettua mediane passaggi del campione in soluzioni di alcool in una scala crescente di concentrazioni

Alcool 70%

Alcool 90%Alcool 100%

Fissazione 3° con Acetato di Uranile in alcool 70%(T.E.M.)

ChiarificazioneL’ultimo agente deve essere miscibile con i mezzi di inclusione

Xilolo

Acetone assoluto

Ossido di propilene

Paraffina

Resine idrofobiche per T.E.M.

InfiltrazioneDopo aver concluso la disidratazione del campione bisogna sostituire gradualmente lo xilolo o l’acetone con il mezzo di inclusione in forma liquida (Xilolo/acetone:mezzo di inclusione)

3:1 2:1 1.1 1:2 1:3

InclusioneE’ il passaggio che permette di impregnare il campione in un materiale abbastanzaduro ed omogeneo tale da poter essere tagliato in fette molto sottili

PARAFFINA (M.O.)

RESINE(T.E.M.)

• Miscela di idrocarburi saturi

• solida a T ambiente

• punto di fusione a 54-60°

• insolubile in H2O, solubile in xilolo

• Epon, Araldite

• liquida a T ambiente

• polimerizza a 60-70°C

• insolubile in H2O, solubile in acetone

• si preparano a partire da soluzioni dimonomeri, da sostanze plasticizzanti chemigliorano la consistenza finale del polimero e da un acceleratore chimicoper la reazione di polimerizzazione

Il campione viene immerso in paraffinao resina pura per completarne l’infiltrazione

T ambiente4°C

Polimerizzazione

Paraffina (m.o.) Resina (T.E.M)

60-70°C

Blocchetti prontiper esseretagliati insezioni

Il taglio delle sezioni

MICROTOMO

Strumento che permette di sezionarei blocchetti di paraffina contenenti il campione in fette spesse 3-10 uM

La raccolta delle sezioni

La colorazione

I coloranti sono di solito in soluzione acquosa Le sezioni devono essere

sparaffinate in xilolo e reidratate con scala decrescente di alcool (100, 90, 80, 70, 50,H2O)

Metodica ematossilina eosina

Ematossilina 10 min

Lavaggio con H2O corrente

Eosina 1 min

Disidratazione

Montaggio

VetriniXilanizzati