XXI CICLO DEL DOTTORATO IN MEDICINA MATERNO-INFANTILE, PEDIATRIA DELLO SVILUPPO E DELL’EDUCAZIONE, PERINATOLOGIA

Dottoranda: dr. Erica Valencic

Tutore: dr. Alberto Tommasini

Trieste, 29 settembre 2008

Verificare che cellule staminali mesenchimali (MSC) isolate dalla matrice del cordone ombelicale mostrino le stesse capacità di quelle isolate dal midollo osseo (MO).

PERCHE’MSCs da MO non sono immunogeniche e sono in grado di modulare la risposta immune.

Interesse clinico: ricostituire il microambiente midollare danneggiato dalla chemio-radio terapia, accelerare l’emopoiesi dopo il trapianto e regolare e ridurre la GVHD.

Il cordone ombelicale è facilmente ottenibile e contiene cellule biologicamente più giovani.

IL PROGETTO

COME 1. Cordoni ombelicali (20 cm) da partorienti sane con gravidanza a termine.2. Il cordone viene tagliato in pezzi di circa 3 cm di lunghezza.3. I vasi vengono incannulati e rimossi dal tessuto circostante con un bisturi. 4. Il tessuto rimasto viene ridotto a piccoli frammenti con un bisturi.5. I frammenti vengono trasferiti in piastre con del terreno.6. Dopo 10 gg. le cellule iniziano a migrare dal tessuto e i frammenti vengono tolti dalle piastre.

Cellule piccole

Cellule grandi

QUINDI Utilizzo di terreno DMEM con fattori di crescita diversi:• siero fetale bovino (FBS) al 20%• liquido follicolare (L.F.) al 20% (pool ottenuto da diverse pazienti della PMA) • 10% FBS e 10% L.F.

Nei primi passaggi poche differenze morfologiche tra i diversi fattori di crescita: in presenza di LF le cellule sono un po’ più rotondeggianti mentre con FBS sono più simili ai fibroblasti.

Nei successivi passaggi:Le cellule con FBS o L.F.: rallentano la crescita fino a fermarsi.Cellule con entrambi i fattori FBS/L.F.: elevata capacità di replicarsi (raddoppiamento < 24 ore); stabilità morfologica.

Si è quindi deciso di coltivare le cellule in tre condizioni diverse:•20% di FBS•10% di FBS e 5% di LF•10% di FBS e 10% di LF

CONFRONTO TRA I TRE METODI Test di apoptosiTest di senescenzaImmunofenotipoEspressione della proteina HMGA-1 (marker di staminalità mesenchimale)

Non differenze significative, tranne maggior espressione di HMGA-1 in cellule coltivate con solo FBS.

FUNZIONE REGOLATORIA Le cellule coltivate con 10% FBS-10% LF sono state co-coltivate per 3 giorni con linfo-monociti (PBMC) marcati con CFSE (un colorante fluorescente che permette di analizzare la proliferazione cellulare) e stimolati con PHA. L’esperimento è stato ripetuto per due volte con:- mesenchimali irradiate e non- in piastre che permettono il contatto tra le due popolazioni cellulari e in piastre che non lo permettono (transwell).

=> le MSC riducono la proliferazione dei PBMC in entrambi i replicati;=> con le mesenchimali irradiate i risultati sono variabili; => nessuna soppressione in transwell.

Il dosaggio delle citochine conferma l’azione immunomodulatoria delle cellule mesenchimali: diminuzione dell’IL-2 e dell’IFN-γ, mentre IL-6 aumenta ma anche le mesenchimali da sole ne producono grandi quantità.

Questi risultati suggeriscono che il contatto cellulare sia indispensabile per l’azione immunomodulatrice delle mesenchimali.

Allora qual è il ruolo dell’HLA-G,molecola solubile, descritta in letteratura come la responsabile della soppressione?

CONCLUSIONI

I risultati ottenuti finora suggeriscono che l’aggiunta del liquido follicolare nel terreno di coltura modifichi la morfologia cellulare e renda le cellule più longeve mentre i parametri studiati, ad eccezione dell’espressione dell’HMAG-1, non differiscono significativamente.

La funzione regolatoria è stata studiata solo sulle cellule mesenchimali coltivate con terreno addizionato di 10% FBS e 10% LF e si è osservata una riduzione della proliferazione dei PBMC.

Nei prossimi mesi testeremo la funzione regolatoria delle mesenchimali coltivate con FBS verificando anche la funzione dell’HLA-G con un anticorpo che ne blocchi l’attività.

Infine si sta pensando anche di utilizzare come sostituti dell’FBS il lisato piastrinico e il siero del sangue cordonale.