Embed Size (px)
Citation preview
Yoğun Bakım Ünitesinde Nozokomiyal Alt Solunum Yolu İnfeksiyon Etkeni Pseudomonas aeruginosa
Kökenlerinde Antimikrobiyal Direnç Genleri
Yrd.Doç.Dr.Burçin Özer
Mustafa Kemal Üniversitesi, Tıp Fakültesi
Tıbbi Mikrobiyoloji AD.
2
Yoğun Bakım Ünitesinde Nozokomiyal Alt Solunum Yolu İnfeksiyon Etkeni Pseudomonas aeruginosa
Kökenlerinde Antimikrobiyal Direnç Genleri
Burçin Özer*, Nizami Duran*, Yusuf Önlen**, Lütfü Savaş*
* Tıbbi Mikrobiyoloji AD.** Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji AD.
Mustafa Kemal Üniversitesi, Tayfur Ata Sökmen Tıp Fakültesi, Hatay
Mustafa Kemal Üniversitesi Araştırma Fonu (BAP 08 T 1701 nolu proje) tarafından desteklenmiştir
Giriş
YBÜ’deki yüksek infeksiyon hızı
Çok sayıda ve geniş spektrumlu antibiyotik
Antibiyotiklere dirençli mikroorganizmalar
Antibiyotik tedavisinde ciddi problemler
P. aeruginosa nozokomiyal infeksiyonlarda
en önemli bakterilerden biridir
Özellikle yoğun bakım ünitesinde kazanılan
nozokomiyal alt solunum yolu
infeksiyonlarında önemli bir patojendir
3
Direnç Mekanizmaları
Antimikrobiyal ajanlara karşı
bir çok mekanizma ile direnç
geliştirirler
İnaktive eden enzimlerin
üretimi
Hedef enzimlerin
mutasyonları
Çoğul ilaç eflüks
pompaları• Dış memran faktör ailesi (OMF)
• Direnç nodül hücresi üst
ailesi (RND)
• Membran füzyon protein ailesi
(MFP)
Çoğul ilaç eflüks
pompaları
4
Direnç nodül hücresi üst ailesine (RND) ait eflüks sistemleri
mexAB-oprM;• Florokinolonlar
• Tetrasiklinler
• Kloramfenikol
• Beta-laktamlar
(karbenisilin,piperasilin,
seftazidim, sefepim,
aztreonam ve meropenem)
mexCD-oprJ;• Florokinolonlar
• Antipseudomonal beta-
laktamlar (piperasilin, sefepim
ve meropenem)
mexEF-oprN;• Florokinolonlar
• Trimetoprim
• Kloramfenikol
mexXY-oprM;• Florokinolonlar
• Aminoglikozidler
• Bazı beta laktamlar
(piperasilin, sefepim,
seftazidim, meropenem,
veya imipenem)
5
6
AMAÇ
Yoğun bakım ünitesinde kazanılan
nozokomiyal alt solunum yolu
infeksiyonlarında izole edilen
P. aeruginosa kökenlerinin
antimikrobiyal direnç genlerinin
saptanması amaçlandı.
7
Gereç ve Yöntem
Şubat 2007-Nisan 2009 tarihleri arasında
Mustafa Kemal Üniversite Hastanesi yoğun bakım ünitesindeki hastalardan
Nozokomiyal alt solunum yolu infeksiyon etkeni
50 P. aeruginosa kökeni çalışmaya dahil edildi.
8
9
14 27
Tr.asp. Bronş lavajı Balgam
P. aeruginosa kökenleri
50 P.aeruginosa kökeni
9
Disk Difüzyon
Mezlosilin (75 g),
Piperasilin/tazobaktam (100/10 g),
Seftazidim (30 g),
Sefepim (30 g),
İmipenem (10 g),
Meropenem (10 g),
Gentamisin (10 g),
Amikasin (30 g),
Tobramisin (10 g),
Siprofloksasin (5 g),
Norfloksasin (10 g) (Oxoid, İngiltere)
Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü’ne (CLSI, 2010) göre değerlendirildi.
DNA ekstraksiyonu Kado ve Liu’nun yöntemi modifiye edilerek yapıldı.
Primerler Dumas ve ark. makalesine göre belirlendi.
Kado & Liu. J Bacteriol 1981
Dumas et al. FEMS Microbiol Lett, 2006
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)
Primerler
12
Multipleks PZR
Ürün boyutunu belirleyebilmek için 100-2000 kb
arasında fragmanlar içeren DNA markeri kullanıldı.
2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500,
400, 300, 200 ve 100 bç.
PZR işlemi Bioder/Thermal Blocks xp cycler (Tokyo
Japan) cihazında gerçekleştirildi.
Dört farklı Multipleks PZR grubu oluşturuldu.
13
Multipleks PZR Grupları
mexE (114 bç)
mexR (150 bç)
mexT (216 bç)
MexA (316 bç)
oprD (156 bç)
oprD (232 bç)
oprJ (305 bç)
mexC (164 bç)
mexC (218 bç)
ampC (344 bç)
Multipleks PZR
nfxB (164 bç)
oprN (235 bç)
mexX (326 bç)
14
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)
Toplam 25 μl’lik hacimde hazırlanan PZR
karışımına
2.5 μl 10X PZR tamponu
Deoksinükleotidlerin her birinden 200 μM (AB Gene,
İngiltere)
2 mM MgCl2
0.4 μM primerler
10 ng kalıp DNA
Distile su
1 U Taq polimeraz (Fermentas, USA) eklendi.
15
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)
94°C’de, 1 dk
57°C’de 45 sn
72°C’de 10 dk
Denatürasyon
Bağlanma
Uzama
Son Uzama
72°C’de 45 sn
(mexA, mexT, mexE, mexR genleri için)
Toplam 35 PZR siklusu
Diğer genler için
Toplam 30 PZR siklusu
16
Oluşan ürünler %2 agaroz jelde yürütülerek etidyum
bromid ile boyandıktan sonra jel görüntüleme sisteminde
(Wealtec, Dolphin-View, USA) görüntülendi.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)
17
Multipleks PZR Grup 1
18
Multipleks PZR Grup 2
19
Multipleks PZR Grup 3
20
Multipleks PZR Grup 4
BULGULAR
22
2524
23
2019
18 18
15
12
98
0
5
10
15
20
25
30
Mezlosilin
Norfloksasin
Siprofloksasin
Meropenem
Gentamisin
Imipenem
Tobram
isin
Seftazidim
Pip/tazo
Sefepim
Amikasin
Mezlosilin
Norfloksasin
Siprofloksasin
Meropenem
Gentamisin
Imipenem
Tobramisin
Seftazidim
Pip/tazo
Sefepim
Amikasin
Antimikrobiyal
Direnç
Direnç Genleri
Yedi kökende (%14) direnç genlerinin hiçbiri
saptanmadı.
43 köken (% 86) bir veya birden fazla direnç
geni içeriyordu.
Sadece dört kökende (% 8) bir direnç geni
bulundu.
23
24
GENLER
32
26 2624
21 21
17
12 119
75
2
0
5
10
15
20
25
30
35
nfxB
(164
bç)
oprN
(235
bç)
mex
E (1
14 b
ç)m
exC
(164
bç)
ampC
(218
bç)
oprD
(232
bç)
mex
R (1
50 b
ç)m
exC
(344
bç)
oprJ
(305
bç)
oprD
(156
bç)
mex
A (3
16 b
ç)m
exT
(216
bç)
mex
X (3
26 b
ç)
nfxB (164 bç)
oprN (235 bç)
mexE (114 bç)
mexC (164 bç)
ampC (218 bç)
oprD (232 bç)
mexR (150 bç)
mexC (344 bç)
oprJ (305 bç)
oprD (156 bç)
mexA (316 bç)
mexT (216 bç)
mexX (326 bç)
25
Beta-Laktamlara Etkili Direnç Genleri
26
27
Beta-Laktamlara Etkili Direnç Genleri
28
Beta-Laktamlara Etkili Direnç Genleri
Kinolonlara Etkili Direnç Genleri
29
Kinolonlara Etkili Direnç Genleri
30
Aminoglikozidlere Etkili Direnç Genleri
31
Sonuçlar
Kökenlerin % 86’sının bir veya birden fazla
direnç geni içerdiği bulundu.
FEP ve PTZ direnci ile mexC geni,
MEZ, PTZ, CAZ ve FEP direnci ile AmpC geni,
CIP ve NOR direnci ile oprJ, oprN ve nfxB
genleri arasında anlamlı ilişki bulundu.
32
Sonuçlar
Çok fazla sayıda direnç geni içermesine rağmen
antibiyotiklerin çoğuna duyarlı olan kökenlerde
bulunmaktaydı.
Bu kökenlerin tedavi sırasında direnç geliştirme
olasılığı çok yüksektir.
Bu sebeple fenotipik yöntemlerle
antimikrobiyallere karşı duyarlılık araştırmak
yerine genotipik olarak antimikrobiyal direnç
genlerinin saptanması daha anlamlıdır.
33
Şükranla anıyoruz…
35
Doğal direnç
Pseudomonas’lar yaygın olarak kullanılan
penisilinlere, birinci, ikinci kuşak
sefalosporinlere, tetrasiklinlere,
kloramfenikol ve vankomisine dirençlidir
36
37
CDC’nin nozokomiyal alt solunum yolu inf. tanı kriterleri
Kriter 1
Hastanın FM’de ralinin olması
En az biri
• Pürülan balgam (yeni başlayan) veya balgamın
karakterinde değişme
• Kan kültüründe mo üremesi
• Transtrakeal aspirat broşial fırçalama veya biopsi
ile elde edilen materyalde etiyolojik ajanın
izolasyonu
38
CDC’nin nozokomiyal alt solunum yolu inf. tanı kriterleri
Kriter 2
AC grafisinde yeni ve ilerleyici infiltrat, konsolidasyon,
kavitasyon veya plevral efüzyon görülmesi
En az biri
• Pürülan balgam (yeni başlayan) veya balgamın karakterinde
değişme
• Kan kültüründe mo üremesi
• Transtrakeal aspirat broşial fırçalama veya biopsi ile elde
edilen materyalde etiyolojik ajanın izolasyonu
• Sol. Sekresyonlarında viral Ag’nin saptanması veya virusun
izolasyonu
• Patojen için tek Ab titresi (IgM) veya 4 kat artmış Ab
• Pnömoninin histopatolojik kanıtının olması
39
DNA Ekstraksiyonu
DNA izolasyonu Kado ve Liu’nun yöntemi modifiye edilerek yapıldı.
Bakteri kültürü L-B buyyonda 37 0C’de 18 saat inkübe edildi.
İnkübasyon sonunda bakteriler 4000 devirde 15 dk santrifüj edildi.
Pellet üzerine 100 μl buffer (20 mM tris-asetat ve 2 mM EDTA, pH 7.9) eklendi.
Sonra 400 μl lysing buffer ilave edildi. (%3 SDS and 50 mM tris, pH 12.6, pH 2N NaOH ile ayarlandı).
Kado & Liu. J Bacteriol 1981
DNA Ekstraksiyonu
65 C’de 90 dk lizis işlemi için tutuldu.
Sıvı fazdaki DNA üzerine eşit miktarda izopropanol koyularak nükleik asit presipitasyonu yapıldı.
Sonra pellet üzerine 50 μl TE (10 mM tris, 1 mM EDTA, pH 8) buffer konarak DNA çözüldü.
Kado & Liu. J Bacteriol 1981
42
Antimikrobiyal Direnç Oranları (Disk difüzyon metodu ile)
43
Antimikrobiyal Direnç Genleri
