CHROMOSOME CHROMOSOME WALKINGWALKING
BARDZO TREŚCIWY SKRÓTBARDZO TREŚCIWY SKRÓT
PIĘĆ WYBRANYCH METOD PIĘĆ WYBRANYCH METOD SPACEROWANIA PO CHROMOSOMIESPACEROWANIA PO CHROMOSOMIE
T- LINKER PCRT- LINKER PCR
SITE FINDING PCRSITE FINDING PCR
BD GENOME WALKER PCRBD GENOME WALKER PCR
INVERSE PCRINVERSE PCR
TAIL PCRTAIL PCR
T -T -LINKER LINKER PCRPCR
PRZYKŁAD – NIE MÓJPRZYKŁAD – NIE MÓJ
SITE FINDER SITE FINDER PCRPCR
STRUKTURA PRZYKŁADOWEGO SITE FINDERASTRUKTURA PRZYKŁADOWEGO SITE FINDERA
SITE FINDING PCRSITE FINDING PCR
KNOWN SEQUENCEUNKNOWN SEQUENCE
GSP 3 GSP 1GSP 2
Site finder
NNNNNNNNNCGCGNNNNNNN
GCGC
TTAGAAC
AATCTTG
KNOWN SEQUENCE
GSP 3 GSP 2 GSP 1
KNOWN SEQUENCEUNKNOWN SEQUENCE
GSP 3 GSP 1GSP 2
Site finder
NNNNNNNNNCGCGNNNNNNN
GCGC
TTAGAAC
AATCTTG
KNOWN SEQUENCE
GSP 3 GSP 2 GSP 1
KNOWN SEQUENCEUNKNOWN SEQUENCE
GSP 3 GSP 1GSP 2
Site finder
NNNNNNNNNCGCGNNNNNNN
GCGC
TTAGAAC
AATCTTG
KNOWN SEQUENCE
GSP 3 GSP 2 GSP 1
CZY SITE FINDER JEST WAŻNY ?CZY SITE FINDER JEST WAŻNY ?
BD Genome BD Genome Walker Walker TMTM
STRUKTURA ADAPTORASTRUKTURA ADAPTORA
KONSTRUKCJA BIBLIOTEKIKONSTRUKCJA BIBLIOTEKI
32X
7X
TEMPERATURA [ oC ] CZAS [ s ]
Denaturacja wstępna
98 120
Denaturacja właściwa
98 30
Annealing/polimeryzacja
72 180
DenaturacjaDenaturacja 98 30
AnAnnnealing/ ealing/ AmplifikacjaAmplifikacja
67 180
Wydłużanie Wydłużanie końcowekońcowe
67 300
PauzaPauza 4 ∞
...ACATGGTCGATGCCTTATGGTCCTGAAAA...
CO ZROBIĆ Z OTRZYMANĄ CO ZROBIĆ Z OTRZYMANĄ SEKWENCJĄ ?SEKWENCJĄ ?
BLAST ALIGNMENT
ANALIZY ANALIZY LABORATORYJNELABORATORYJNE
I-PCR ( INVERSE PCR)I-PCR ( INVERSE PCR)
HI – TAIL PCRHI – TAIL PCR
(( High-efficiency thermal asymmetric interlacedHigh-efficiency thermal asymmetric interlaced )
SITE FINDING PCR
Low temp. Annealing
Site finding primer
-
High
90%>
0-4kb
low
PODSUMOWANIEPODSUMOWANIE