ESPECTROMETRÍA DE MASAESPECTROMETRÍA DE MASA

Algunas aplicaciones de la Espectrometría de Masa

en biología y biomedicina

IVON LOPEZ

Espectrometría de Masa • La Espectrometría de Masa es una técnica que permite determinar la masa de moléculas por medio de la medida de la relación masa/carga (m/z).

• La medida de masas moleculares involucra la producción, separación y detección de iones moleculares en fase gaseosa.

• Cada molécula puede originar iones moleculares con distinto número de cargas ( y distintas m/z).

• La masa molecular es una propiedad física fundamental e inalterable de la materia……

Bioespectrometría

• Aplicación de la Espectrometría de Masa al estudio de bio-moléculas: identificación, niveles, modificaciones.

• Incluye la combinación de herramientas de la Bioquímica (cromatografía, electroforesis, bioafinidad y digestiones enzimáticas, entre otras) con la Espectrometría de Masa.

Espectrometría de masa y BiologíaEspectrometría de masa y Biología

Las medidas de masa de péptidos y proteínas (...y de otras macromoléculas) eran extremadamente difíciles de realizar hasta fines de los años 80’, cuando aparecieron dos nuevos métodos para producir iones en fase gaseosa:

Espectrometría de masa:

Espectrómetro de masa MALDI-TOF

(Applied Biosystems Voyager DE-PRO)

Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF

(Applied Biosystems 4800 Analizer)

4000 Series MALDI TOF/TOF™ Analyzer Training

© 2007 Applera Corporation and MDS Inc.6

Analizador de masa

L os iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración .

Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masas mayores. La medida del “tiempo de vuelo” de cada uno se puede usar para calcular su masa.

Espectro de masa de péptidos generados por digestión con tripsina “in gel” de una proteína de membrana

Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81

ElementoElemento MasaMasa %%1H 1.0078 99.9852H 2.0141 0.015

12C 12.0000 98.9013C 13.0034 1.1014N 14.0031 99.63415N 15.0001 0.36616O 15.9949 99.76217O 16.9991 0.03818O 17.9992 0.20031P 30.9738 100.0032S 31.9721 95.0233S 32.9715 0.7534S 33.9679 4.2136S 35.9671 0.02

79Br 78.9183 50.6981Br 80.9163 49.31

1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0

Mass (m/z)

0

3222.3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% I

nte

nsi

tyVoyager Spec #1=>BC=>RSM10000=>MC=>MC=>MC[BP = 1672.8, 3222]

1672.917

Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM)

1672.92

1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0

Mass (m/z)

0

1.6E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% I

nte

nsi

ty

Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = 1672.9, 16255]

1672.918

Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM)

Resolución en MALDI-TOF

CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA

• Identificación de proteínas– comparación correlativa en una base de datos de

secuencias• Control de calidad

– proteínas recombinantes, reacciones de modificación• Modificaciones postraduccionales

– fosforilación, glicosilación, metilación, etc.• Niveles de expresión

– métodos cuantitativos

1000 1500 2000

Mass (m/z)

Identificación de proteínas

Selección de la muestraTratamiento con una enzima proteolítica

Separación en gel 2D

Búsqueda en banco de datos

Extracción de péptidos y análisis de masas

m/z

Identificación de proteínas por MALDI-TOF

• Proteína aislada• Proteína identificada por la masa de los péptidos

(PMF), generados por un método específico:

– Enzimático o químico

• Para su identificación, la secuencia de la proteína debe estar en una base de datos

• La identificación es probabilística: según criterios estadísticos

362924

20

14

A

B

Pureza/HPLC/GCSFPureza/SDS-PAGE/ GCSF

Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF

A

B

ESTRATEGIA GENERAL PARA EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA

ProteínaProteína

Alternativamente, secuenciación de

cada péptido

Verificación de secuencia y detección de modificaciones

postraduccionales .…

MS/MS

Espectrómetro de masa

Mezcla de péptidos

Enzima

Masa de los péptidos

Búsqueda en bancos de datos;

Identificación de la proteína

• Modelo: Voyager DE-PRO (Applied Biosystems, USA). • Datos técnicos:

- Laser de nitrógeno (λ 337 nm)- Voltaje de aceleración: hasta ± 25 kV- Tubo de vuelo: 1.3 m (modo lineal); 2.0 m (modo reflector)- Sistema alto vacío: 2 bombas turbo-moleculares (10-8 Torr)- Rango de masa: 500 Da hasta > 400 kDa - Exactitud de masa : hasta 0.002% (20 ppm)- Sensibilidad (péptidos): subpicomolar

• Posibilidades de operación:- Modo lineal - Modo reflector - "Delay extraction" (DE) - "Post Source Decay“ (PSD) - "Collision-Induced Dissociation“ (CID)