MAKALAH ANALISA FARMASI KUANTITATIF

SPEKTROFOTOMETRI UV DAN FLOURESENSI

KELOMPOK : V (LIMA)

NAMA KELOMPOK :

1. Nur Afriyani (08121006046)

2. Ario Firana (08121006048)

3. Nur Fitriyana (08121006050)

4. Kamilia Qudsiani (08121006052)

5. Elvarina Permata Sari (08121006056)

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PROGRAM STUDI FARMASI

UNIVERSITAS SRIWIJAYA

2014

1

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, puji syukur kami ucapkan pada Allah SWT dimana kami

telah menyelesaikan tugas membuat makalah dalam mata kuliah Analisa Farmasi

Kuantitatif yang berjudul Spektrofotometri UV dan Flouresensi dengan benar dan

tepat waktu.

Selaku tim penyusun kami tidak lupa mengucapkan terima kasih kepada

ibu Akrimah karena tanpa beliau tugas ini tidak dapat selesai dengan baik, tidak

lupa juga kami mengucapkan terima kasih kepada teman sebaya karena telah

banyak membantu dan menyampaikan beberapa masukan dan kritik dalam tugas

ini.

Akhirnya, tim penyusun mengharapkan agar makalah ini dapat berguna

bagi pembaca dan mengharapkan adanya kritik dan masukan dari pembaca,

khususnya kepada ibu Akrimah selaku pengajar mata kuliah Analisa Farmasi

Kuantitatif dan teman teman sebaya lainnya.

Inderalaya, 19 April 2014

Tim penyusun

2

DAFTAR ISI

Bab I Pendahuluan...................................................................................................3

Latar Belakang.............................................................................................3

Masalah................................................................................................ .......4

Tujuan..........................................................................................................4

Bab II Pembahasan..................................................................................................5

Bab III Penutup......................................................................................................20

Kesimpulan................................................................................................20

Daftar Pustaka…………………………………………………………...21

3

BAB 1

PENDAHULUAN

I. 1. Latar Belakang

Dengan majunya perkembangan zaman ilmu pengetahuan saat ini dan

bertambah kompleksnya masalah yang dihadapi khususnya dalam bidang kimia

farmasi, telah didapat begitu banyak cara untuk mengetahui konsentrasi dari suatu

zat, baik itu padatan maupun cairan. Salah satu metode yang saat ini banyak

digunakan dalam berbagai lembaga penelitian dan universitas adalah metode

spektrofotometri dan Flouresensi. Para kimiawan telah lama menggunakan

bantuan warna sebagai bantuan dalam mengenali zat-zat kimia. Spektrofotometri

dapat dianggap sebagai suatu perluasan pemeriksaan visual yang dengan studi

lebih mendalam dari absorpsi energi radiasi oleh macam-macam zat kimia

memperkenankan dilakukannya pengukuran ciri-ciri serta kuantitatifnya dengan

ketelitian lebih besar

Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang

digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan

kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Sedangkan

peralatan yang digunakan dalam spektrofometri disebut spektrofotometer. Cahaya

yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan

materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron

yang adapada atom ataupun molekul yang bersangkutan.

Pada makalah ini, spektrofotometri UV akan lebih detail dibahas,

Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) itu sendiri adalah pengukuran energi

cahaya oleh suatu sistem kimia pada panjang gelombang tertentu. Sinar ultraviolet

(UV) mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, dan sinar tampak

(visible) mempunyai panjang gelombang 400-750 nm. Pengukuran

spektrofotometri menggunakan alat spektrofotometer yang melibatkan energi

elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga

spektrofotometer UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif

dibandingkan kualitatif. Spektrum UV-Vis sangat berguna untuk pengukuran

secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan

4

mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan

hukum Lambert-Beer

I.2. Rumusan Masalah

1. Jelaskan Faktor-faktor apa yang mempengaruhi serapan dalam

spektrofotmetri UV-VIS?

2. Apa pengaruh pelarut terhadap hasil spektrofotometri UV-VIS

3. Apa perbedaan fluororisensi dengan fosforisensi? Jelaskan dengan contoh

dikehidupan sehari-hari!

4. Bagaimana cara kerja dari metode one point dengan kaliberasi pada spektro

Uv-vis?

5. Apa hubungan analisa kuantitatif dengan sinar ultraviolet yang diserap oleh

senyawa organik aromatik?

6. Bagaimana mennetukan cara Transfeksi DNa kedalam sel beta pancreas dan

sel myoblas manusia menggunakan Florosensi?

7. Bagaimana menetukan aktifitas enzim tirosinase pada tumbuhan solanum

tuberosum dengan Spektoskopi UV-VIS ?

8. Kenapa larutan-larutan tidak bewarna yang dianalisis menggunakan

spektrofotometer UV tida boleh ada partiel koloid dan suspensi ?

9. Kenapa analisis menggunakan sinar ultraviolet biasanya dilakukan

menggunakan ultraviolet dekat, sedangkan analisis menggunakan ultraviolet

jauh maka instrument yang digunakan harus dalam keadaan vakum ?

I.3. Tujuan

Mahasiswa mampu memahami secara mendalam materi tentang spektrofotometri

UV-VIS dan fluometri

5

BAB II

PEMBAHASAN

A. Faktor-faktor yang mempengaruhi serapan dalam spektrofotmetri UV-

VIS :

1. Jenis Pelarut

Syarat pelarut yang digunakan tidak boleh mengabsorbsi cahaya pada

panjang gelombang saat melakukan pengukuran sampel analisis. Jenis pelarut

juga akan mempengaruhi lebar pita yang tampak pada spectrum. Karena transisi

elektronik dapat terjadi dari sub tingkat dari keadaan dasar ke sub tingkat dari

keadaan eksitasi.Jika pada keadaan transisi tersebut sedikit berbeda( karena

pengaruh pelarut), maka panjang gelombag absorpsi juga akan sedikit berbeda.

Sehingga akan menimbulkan pita lebar pada spectrum. Di bawah ini beberapa

jenis pelarut dan besarnya absorsi cahaya pada gelombang tertentu.

Pelarut Batas serapan (nm) Pelarut Batas serapan (nm)

Asetonitril 190 n-heksan 201

Kloroform 240 Methanol 205

Sikloheksan 195 isooktan 195

1-4 dioksan 210 Air 190

Etanol 95% 205 Aseton 330

Benzen 285 piridin 205

Pelarut yang sering digunakan adalah air, etanol, methanol dan h-heksan karena

pelarut-pelarut tersebut transparan pada daerau UV-VIS seningga tidak

mengganggu dengan tidak mengabsorbi cahaya saat analisis.

2. Kadar larutan

Semakin tinggi konsentrasi larutan akan terjadi polimerasi yang menyebabkan

lamda maksimum berubah. Lamda maksimum berubah secara otomatis akan

mempengaruhi analisis data yang diharapkan sebelumnya dan akan berbeda

dengan larutan baku yang dianalis.

3. Tebal kuvet

6

Tebal kuvet akan memberikan spektrum serapan yg berbeda pula. Sehingga tebal

kuvet harus disesuaikan dengan serapan maksimum yang dibutuhkan

4. Lebar celah

Makin lebar celah maka makin lebar pula serapan, cahaya makin polikromatis,

sehingga resolusi dan puncak-puncak kurva tidak sempurna.

B. Pengaruh Polaritas Pelarut Terhadap Hasil Analisis Spektofotometri

Hal yang perlu diperhatikan adalah polaritas pelarut yag dipakai. Karena

akan sangat mempengaruhi terhadap pergeseran spektrum molekul yang

dianalisis. Spektrofotometri UV-Vis dapat melakukan penentuan terhadap sampel

yang berupa larutan, gas, atau uap. Untuk sampel yang berupa larutan perlu

diperhatikan beberapa persyaratan pelarut yang dipakai, antara lain :

Pelarut yang dipakai tidak boleh mengandung sistem ikatan rangkap

terkonyugasi pada struktur molekulnya dan tidak berwarna.

Tidak terjadi interksi dengan molekul senyawa yang dianalisis.

Kemurniannya harus tinggi atau derajat untuk analisis.

Pada umumnya pelarut yang sering dipakai dalam analisis

spektrofotometri UV-vis adalah air, etanol, sikloheksana dan isopropanol.

Kaidah franks dan Cordon beranggapan bahwa selama elektron dalam

keadaan tereksitasi, molekul tersebut dalam keadaan diam hanya terjadi

pergeseran elektronnya saja. Selanjutnya elektron suatu molekul yang tereksitasi

maupun tidak akan berasosiasi dengan pelarut sehingga terjadi penurunan tingkat

energi ∆E untuk π1 - π 1* < π – π* dan n1 – π1* > n – π* .

Pengaruh polaritas pelarut terhadap eksitasi elektron dalam spektrofotometer

UV-vis.

7

Dari kaidah Franks dan Cordon tersebut dapat ditarik kesimpulan sebagai

berikut :

1. Kenaikan polaritas pelarut untuk elektron yang bertransisi n1 – π1* akan

memberikan pergeseran biru (hipokromik). Hal ini disebabkan ikatan

hidrogen dengan keadaan dasar elektron n yang lebih mantap

dibandingkan dengan keadaan π* yang turun energinya menjadi π1*

(dalam keadaan polar).

2. Sebaliknya untuk transisi elektron π1 - π 1* polaritas pelarut akan

menimbulkan pergeseran merah (hatokromik). Hal ini disebabkan pelarut

yang polar akan lebih memantapkan keadaan π* sehingga ∆E untuk π1 - π

1* < π – π*.

Pelarut untuk UV-Vis dan batas minimum transparasi (cut off point)

Pelarut Cut off point (nm)

Air 190

Metanol 210

Sikloheksana 210

Heksana 210

Dietil eter 220

p-dioksan 220

Etanol 220

Kloroform 250

CCl4 265

8

E

Tanpa pelarut Dengan pelarut etanolπ1

π1*

n1π

π*

n

Benzena 280

Toluen 285

Piridina 305

Aseton 330

Karbon disulfida 380

C. Metode Kurva Kalibrasi dan One Point dalam Analisa dengan

Spektofotometri

 Molekul selalu mengabsorbsi radiasi elektromagnetik jika frekuensi

radiasi ini sama dengan frekuensi getaran molekul tersebut. Elektron yang terikat

maupun tidak terikat akan tereksitasi pada suatu daerah frekuensi, yang sesuai

dengan radiasi UV/VIS. Radiasi polikromatis dipancarkan dari sumber radiasi

melewati monokromator sehingga diperoleh radiasi monokromatis. Radiasi

monokromatis diteruskan ke kuvet yang berisi larutan/pelarut yang akan

dianalisis. Radiasi tersebut akan dipantulkan, diabsorbsi dan ditransmisikan.

Jika I0 adalah intensitas radiasi yang dipancarkan; dan I adalah intensitas

radiasi setelah melewati larutan; maka I0-I adalah intensitas radiasi yang

diabsorbsi oleh larutan. Nilai Absorban (A) adalah sebagai berikut:

A = log Io/I,  menurut hukum Lambert-Beer : A = a b C

Dimana:

A = absorban;   a = absorptivitas;  b = lebar medium (cm); C = konsentrasi

senyawa yang menyerap radiasi.

Ada 2 metode yang digunakan dalam analisa kuantitatif suatu senyawa

dengan spektrofotometer :

Metode kurva kalibrasi: yaitu dengan cara mengukur Absorban (A) sampel

pada beberapa konsentrasi (C), kemudian dibuat kurva kalibrasi konsentrasi (C)

terhadap absorban (A). Jika absorptivitas (a) suatu senyawa pada lmax telah

diketahui dari perhitungan atau literatur, maka kadar larutan senyawa yang sama

9

dapat dihitung. Larutan senyawa dengan kadar tidak diketahui dibuat dalam

pelarut yang sama dengan larutan senyawa yang diketahui kadarnya. Kadar

larutan pembanding harus dibuat sesuai dengan kadar dimana hukum Lambert-

Beer masih dipenuhi. Maka kadar larutan uji dapat dihitung: Cu = Au/(b.a)

Spektrum absorpsi yang diperoleh dari hasil analisis dapat memberikan

informasi panjang gelombang dengan absorban maksimum dari senyawa atau

unsur. Panjang gelombang dan absorban yang dihasilkan selama proses analisis

digunakan untuk membuat kurva standar. Konsentrasi suatu senyawa atau unsur

dapat dihitung dari kurva standar yang diukur pada panjang gelombang dengan

absorban maksimum. Dari kurva standar kalibrasi, diperoleh persamaan garis :

Y = ax + b 

Dimana Y merupakan serapan dan x adalah konsentrasi unsur atau

senyawa. Dengan persamaan garis tersebut dapat ditentukan konsentrasi sampel.

Langkah-langkah yang perlu dilakukan dalam penentuan konsentrasi zat

dengan kurva kalibarasi:

1. Maching kuvet : mencari dua buah kuvet yang memiliki absorbansi atau

transmitansi sama atau hampir sama. Dua buah kuvet inilah yang akan

digunakan untuk analisis, satu untuk blanko, satu untuk sampel. Dalam

melakukan analisis Maching kuvet harus dilakukan agar kesalahannya makin

kecil.

2. Membuat larutan standar pada berbagai konsentrasi. Larutan standar yaitu

larutan yang konsentrasinya telah diketahui secara pasti. Konsentrasi larutan

standar dibuat dari yang lebih kecil sampai lebih besar dari konsentrasi analit

yang diperkirakan.

3. Ambillah salah satu larutan standar, kemudian ukur pada berbagai panjang

gelombang. Hal ini dilakukan untuk mengetahui pada panjang gelombang

berapa, absorbansi yang dihasilkan paling besar. Panjang gelombang yang

menghasilkan absorbansi paling besar atau paling tinggi disebut panjang

gelombang maksimum (lmaks).

4. Ukurlah absorbansi semua larutan standar yang telah dibuat pada panjang

gelombang maksimum.

10

5. Catat absorbansi yang dihasilkan dari semua larutan standar, kemudian

alurkan pada grafik absorbansi vs konsentrasi sehingga diperoleh suatu kurva

yang disebut kurva kalibrasi

6. Ukurlah absorbansi larutan yang belum diketahui konsentrasinya. Setelah

diperoleh absorbansinya, masukan nilai tersebut pada grafik yang diperoleh

pada langkah 5.

Metode “One Point”: digunakan untuk penentuan kadar secara rutin pada

lmax, suhu pelarut, dan instrumen yang sama. Larutan uji dibandingkan terhadap

larutan baku yang telah diketahui kadar dan kemurniannya : Cu = (Au/Ab).Cb

Dalam analisis menggunakan one point method, konsentrasi baku yang digunakan

hanyalah satu tingkat. Karena hanya satu tingkat maka tentu kemungkinan galat

akan lebih besar daripada jika digunakan beberapa tingkat konsentrasi. Untuk

meminimalkan galat, tentu saja gunakanlah nilai A=0,434 yang berdasarkan teori

akan memberikan galat minimum. Putuskan konsentrasi yang akan dibuat sebagai

konsentrasi baku yang akan digunakan, perlu diketahui juga nilai absorptivitas

dari zat tersebut.

Contoh:

Untuk CTM diketahui nilai E1%1cm (265nm) = 210-220

 E1%1cm sama saja dengan A1%

1cm. Untuk nilainya, gunakan nilai tengah saja, 215.

-Maka untuk memperoleh nilai konsentrasi yang dibuat dilakukanlah

perbandingan antara A dan c.

-A yang kita inginkan A1%1cm=  c yang kita inginkan/1 %.

D. Hubungan Analisa Kuantitatif Dengan Sinar Ultraviolet Yang Diserap

Oleh Senyawa Organik Aromatik

Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri UV adalah zat

dalam bentuk larutan dan zat tersebut tidak berwarna. Senyawa-senyawa organik

sebagian besar tidak berwarna sehingga spektrofotometer UV lebih banyak

digunakan dalam analisis senyawa organik khususnya dalam penentuan struktur

senyawa organik. Senyawa organik adalah golongan besar senyawa kimia yang

molekulnya mengandung karbon, kecuali karbida, karbonat, dan oksida karbon.

Banyak di antara senyawaan organik, seperti protein, lemak, dan karbohidrat,

11

merupakan komponen penting dalam biokimia. Di antara beberapa golongan

senyawaan organik adalah senyawa alifatik, rantai karbon yang dapat diubah

gugus fungsinya; hidrokarbon aromatik, senyawaan yang mengandung paling

tidak satu cincin benzena; senyawa heterosiklik yang mencakup atom-atom

nonkarbon dalam struktur cincinnya; dan polimer, molekul rantai panjang gugus

berulang. Pembeda antara kimia organik dan anorganik adalah ada/tidaknya ikatan

karbon-hidrogen. Sehingga, asam karbonat termasuk anorganik, sedangkan asam

format, asam lemak pertama, organik.

Radiasi ultraviolet pada sepktrofotometri UV diabsorpsi oleh molekul

organik aromatik, molekul yang mengandung π terkonjugasi dan atau atom yang

mengandung elektron –n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari

tingkat energi elektron dasar ke tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi.

Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit

yang mengasorpsi sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.

Pengukuran spektrofotometri menggunakan alat spektrofotometer yang

melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis,

sehingga spektrofotometer UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif

dibandingkan kualitatif. Spektrum UV-Vis sangat berguna untuk pengukuran

secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan

mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan

Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan linieritas antara absorban dengan

konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan. Dalam

hukum Lambert-Beer tersebut ada beberapa pembatasan, yaitu : Sinar yang

digunakan dianggap monokromatis, penyerapan terjadi dalam suatu volume yang

mempunyai penampang yang sama, senyawa yang menyerap dalam larutan

tersebut tidak tergantung terhadap yang lain dalam larutan tersebut- Tidak terjadi

fluorensensi atau fosforisensi- Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi

larutan

Hukum Lambert-Beer dinyatakan dalam rumus sebagai berikut :

A = e.b.c

12

dimana :

A = absorban

e = absorptivitas molar

b = tebal kuvet (cm)

c = konsentrasi

E. Sebab pengguanaan larutan tidak Berwarna dalam analisis

Spektrofotometri

Adanya partikel-partikel koloid ataupun suspensi akan memperbesar

absorbansi akibatnya bila dihubungkkan dengan rumus yang diturunkan dari

hukum lambaert-beer konsentrasi zat yang dianalisis makin besar dan apabila

digunaan untuk penentuan struktur suatu senyawa maka pita pada spectrum akan

melebar dari yang sesungguhnya.

F. Perbedaan Metode Spektrofotometri UV Jarak Dekat Dengan

Spektrofotometri UV Jarak Jauh

Analisis menggunakan sinar ultraviolet biasanya dilakukan menggunakan

ultraviolet dekat, sedangkan analisis menggunakan ultraviolet jauh maka

instrument yang digunakan harus dalam keadaan vakum hal ini disebabkan jika

digunakan ultraviolet jauh maka udara akan ikut menyerap panjang gelombang

yang digunakan. Akibatnya kesalahan yang dilakukan makin fatal ,, karena jika

udara ikut menyerap maka absorbansi yang dihasilkan akan makin besar, jika hal

ini dihubungkan dengan hukum lambert-Beer maka konsentrasi zat yang

dianalisis lebih tinggi dari yang seharusnya.

G. Perbedaan Flurosensi dengan Fosforisensi

Fluoresensi adalah proses pemancaran radiasi cahaya oleh suatu materi

setelah tereksitasi oleh berkas cahaya berenergi tinggi. Emisi cahaya terjadi

karena proses absorbsi cahaya oleh atom yang mengakibatkan keadaan atom

13

tereksitasi. Keadaan atom yang tereksitasi akan kembali keadaan semula dengan

melepaskan energi yang berupa cahaya (de-eksitasi). Fluoresensi merupakan

proses perpindahan tingkat energi dari keadaan atom tereksitasi (S1 atau S2)

menuju ke keadaan stabil (ground states). Proses fluoresensi berlangsung kurang

lebih 1 nano detik sedangkan proses fosforesensi berlangung lebih lama, sekitar 1

sampai dengan 1000 mili detik.

Fosforesensi, pemancaran kembali sinar oleh molekul yang telah

menyerap energi sinar dalam waktu yang relatif lebih lama (10-4 detik). Jika

penyinaran kemudian dihentikan, pemancaran kembali masih dapat berlangsung.

Fosforesensi berasal dari transisi antara tingkat-tingkat energi elektronik triplet ke

singlet dalam suatu molekul.

Fosforesensi dapat menyimpan energi lebih lama, sehingga akan

memancarkan cahaya (berpendar) lebih lama dari pada fluorosens. Pada

fluorosens, setelah energi yang digunakan untuk mengeksitasi elektron

dihilangkan (biasanya berupa sinar UV) maka zat fluorosens tidak akan dapat

menyala dalam gelap. Dengan kata lain zat berfluororesensi hanya dapat terlihat

menyala apabila dikenai dengan sinar ultraviolet di dalam gelap, dan tidak dapat

berpendar ketika sinar ultravioletnya dimatikan. Hal ini berkaitan dengan cepat

dan lambatnya elektron kembali ke orbital energi tingkat dasar, semakin cepat

elektron kembali ke orbital maka semakin cepat pula hilang berpendarnya.

Pada saat elektron tereksitasi, elektron berpindah dari orbital berenergi

lebih rendah ke orbital yang berenergi lebih tinggi, yang merupakan reaksi yang

non-spontan (dibutuhkan sejumlah energi aktivasi untuk menyebabkan sebuah

elektron tereksitasi, misalnya terkenanya gelombang cahaya/elektromagnetik

dengan energi sejumlah x kJ). Tereksitasinya elektron ini menyebabkan keadaan

tidak stabil, sehingga menyebabkan elektron cenderung kembali ke keadaan

orbital dasar elektron tersebut. Pada saat elektron yang tereksitasi kembali ke

orbital asalnya (yang memiliki energi lebih rendah), energi sejumlah x kJ

dilepaskan kembali. Energi yang dilepaskan ini berada dalam bentuk gelombang,

yang panjang gelombangnya berada di range visible/tampak (10 nm – 103 nm),

sehingga terlihat menyala di dalam gelap.

14

Sedangkan penjelasan tentang perbedan tentang fluoresensi dalam

kehidupan sehari-hari fluoresensi dan fosforesensi berhubungan dengan

kemampuan berpendar. Benda yg mengandung atau dilapisi zat fluor atau fosfor

dapat berpendar dengan karakteristik masin-masing.  Benda berfluor akan

berpendar atau memancarkan cahaya (meski lemah) pada saat ia tertimpa cahaya

juga. Contohnya adalah pasta gigi berfluoride. Tujuan pasta gigi ini adl melapisi

gigi kita dg fluor sehingga saat kita tersenyum dan gigi kita terkena cahaya, maka

gigi kita seolah berkilau. Tapi fluor tidak akan berpendar begitu tidak ada cahaya

yang mengenainya. Makanya setelah menutup mulut, gigi kita tidak terus2an

terang. 

Benda berfosfor akan berpendar setelah dikenai cahaya. Artinya baru akan

berpendar jika keadaan sekitarnya gelap. Contohnya pada arloji berfosfor dan

saklar lampu berfosfor. Jika kamu masuk ke ruang bioskop yg gelap setelah

tadinya kamu di tempat terang, maka arloji kamu seolah berpendar. Demikian

juga dg saklar lampu. Setelah lampu dimatikan dan kamar menjadi gelap,

saklarnya tampak akan bercahaya. Tujuan pelapisan fosfor ini adalah agar kita

mudah kembali menyalakan lampu karena tahu letak saklarnya meski dalam

gelap, sebab saklarnya berpendar. Namun, tentu ada kapasitas dari fosfor itu

sendiri. Setelah beberapa saat, pendarannya akan memudar. Dia harus dikenai

cahaya lagi agar bisa berpendar lagi. 

H. Studi Kasus

1. Bagaimana mennetukan cara Transfeksi DNa kedalam sel beta pancreas dan sel

myoblas manusia menggunakan Florosensi?

Aplikasi spektrofoskopi flurosensi ini kami jelaskan dalam sebuah jurnal

kesehatan : yang berjudul TRANSFEKSI DNA KEDALAM MITOKONDRIA

SEL BETA PANKREAS DAN SEL PRIMER MANUSIA : LANGKAH

MENUJU REKAYASA DNA MITOKONDRIA DAN TERAPI GEN.

15

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui apakah system transfeksi

dan pmtGFP yang mulanya dikembangkan dari dan untuk mitokondria sel mencit

tersebut juga dapat diterapkan untuk mitokondria sel tikus dan manusia yang

secara evousi mempunyai jarak divergens yang cukup jauh dengan mencit.

Setelah dilakukan penelitian ini dapat disimpulkan bahwa baik konstruksi

DNA artifisialnya maupun metode transfeksi/pengirimannya ke dalam

mitokondria sel akan dapat dikembangkan lebih lanjut sebagai model untuk

mempelajari dinamika DNA mutan mitokondria maupun untuk pengembangan

terapi gen penyakit mitokondria pada manusia.

Penelitia ini diawali dengan sampel sel beta pancreas mencit dari sel BRIN BD 11

passage 44 sedangkan sel myoblat didapatkan dari manusia individu normal. Pada

sel BRIN kontrol ditansfeksi dengan pmtGFP dan sel BRIN uji ditransfeksi

dengan DQAsome-pmtGFP dan pada sel myoblas kontrol ditransfeksi pmtGFP

dan sel myoblast uji ditransfeksi dengan DQAsome-pmtGFP.

GAMBAR 1

Pada gambar A hasil flurosensi antara sel BRIN dengan pmtGFP yang

menhasilkan warna hijau

Gambar B hasil flurosensi anatara sel Brin dengan DQAsome yang menhasilkan

wrna coklat.

GAMBAR 2

16

Pada gambar A terjadi flurorensi anatara sel myoblas dengan pmtGFP yang

menhasilkan warna hijau. Gambar B terjadi flurosensi antara selmyoblast

dengan DQAsome yang menghasilkan wrna coklat . Gambar C merupakan

hasil tumpukan antara gambar A dan B yang meunjukkan bahwa sinyal

terkolokalisasi. Gambar D tidak menunjukkan warna setelah di trasnfeksi

dengan mAb anti-GFP.

Pada gamabr tersebut terdapat kemiripan anatara sel mitokondri pancreas

mencit(SEL BRIN) dengan sel myoblast pada sel manusian menunjukkan adanya

aktivitas flurosensi pada tranfeksi pmtGFP yang menhasilkan warna hijau dan

menghasilkan fuloresensi coklat pada tranfeksi DQAsome-pmtGFP, gambar juga

terlihat adanya sinyal yang terkolokalisai pada sel myoblast menunjukkan adanya

aktifitas flurosensi. Fluoresensi hijau yang terdeteksi setelah transfeksI

mitokondria pada sel dari spesies yang berbeda, antara lain sel dan sel beta

pankreas tikus dan sel myoblast manusia (studi ini), menunjukkan bahwa pmtGFP

dapat diekspresikan dan fungsional pada berbagai tipe sel mamalia.

Pengembangan genom mitokondria artifisial yang fungsional dan metode

transfeksi DQAsome untuk mengantar konstruk DNA tersebut dari luar ke dalam

mitokondria yang berada di dalam sel utuh manusia, merupakan pendekatan yang

penting dalam rekayasa mitokondria. Modifikasi dan optimasi protokol lebih

lanjut akan dapat menghasilkan pendekatan ataumetode baru untuk manipulasi

mitokondria/genom mitokondria mamalia.

2. Bagaimana menetukan aktifitas enzim tirosinase pada tumbuhan solanum

tuberosun dengan Spektoskopi UV-VIS ?

Seperti yang diketahui bahwa Spektroskopi UV-VIS merupakan salah saru

metode analisis kimia baik secara kuanti maupun kualitatif untuk menentukan

komposisi suatu sampel yang didasarkan pada interaksi anatara materi dan cahaya.

Spektroskpoi UV-vis dapat menyerap radiasi pada daerah UV 200-400nm atau

daerah Nampak 400-800nm.

17

Aplikasi spektroskopi UV-VIS kami jelaskan dalam sebuah jurnal yang

berjudul “PENENTUAN AKTIVITAS SPESIFIK TIROSINASE DARI

KENTANG (SOLANUM TUBEROSUM” . Prinisp dari penelitian ini adalah

penetuna antifitas enzim tirosinase menggunakan spkterometER UV-VIS pada

gelombang tertentu karena terbentuknya warna dari dopakrom.

Pada penelitian ini dilakukan tiga proses : pertama farksinasi tirosinase.

Pada ekperimen ini ekstrak kasar kasar yang disiapkan selumnya difraksinasi

bertingkat dengan amoninum sulfat denga konsentrasi berbeda-beda. Endapan

yang terbentuk pada fraksinasi bertingkat tersebut ditambahkan dengan buffer

fosfat. Analisis dilanjutkan dengan spektrofometer UV-VIS dengan panjang

gelombang 280 nm. Kedua, uji aktifitas tirosinase, pada uji ini enzim tirosi

dilarutkan dalam air,tiap 4ml lrutan tersebut diukur serapannya pada panjang

gelombang 475 nm . Ketiga, Penentuan Kadar Protein, dimulai 0,6 ekstrak kasar

dan hasil dialysis dengan ammonium sulfat ditambah dengan 3 ml lowry C dan

ditambakan 0,3 ml folin dan diukur serapannya pada panjang gelombang 655nm.

Pada eksperimen ini menunjukkan bahwa besarnya nilai aktifitas spesifik untuk

ektrassk kasar sebesar 4,293 U/mg. Untuk dialysis dengan penambahan

ammonium sulfat bertingkat didapatkan aktifitas spesifik sebesar 5,817 U/mg.

Pada penentuan aktifitas spesifik sitentukan unit aktifitas, dan pada penetuan

kadar protein dengan menghitung rasio anatara unit aktifitas dengan kadar protein

merupakan nilai aktitas spesifik.

Pada hukum lambert-beer berbunyi “jumlah radiasi cahaya tampak yang

diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan funsi eksponoen dari

konsentrasi zat dan tebal larutan. Cahaya yang diserap diukur sebagai adsorbansi

(A) sedangkan yang dihamburkan diukur sebagai transmitansi (T).

I. Contoh soal

1. Skala pengukuran pada alat spektronic-20, menunjukan nilai transmitan 0-

100%. Berapa nilai absorbansinya?

2. Diketahui diameter sel kuvet adalah 2 cm, larutan yang diukur memiliki

konsentrasi 2,49. 10-5 mol/L dengan ε 5. 103 L/molcm dengan panjang

gelombang 430 nm, hitung %T!

18

3. Diketahui suatu senyawa X memiliki BM= 118 ditimbang sebanyak 0,274

gram dan diadd 10 mL, kemudian diukur pada panjang gelombang 272 nm

dengan sel kuvet 1 cm sehingga memiliki A=0,450, tentukan absrobtivitas

dan absirbtivitas molarnya!

Jawaban :

1. Diket : %T = 0-100%

T= 0-1

Dit : A...?

Jawab : A = log 1/T

A= log 1/0 = ~ (tak hingga)

A = log 1/T

A = log 1/1 = 1

Jadi absorbansinya ~ - 0

2. Diket : λ = 430 nm

b = 2 cm

ε = 5.103 L/molcm

C = 2,49.10-5 mol/L

Dit : %T..?

Jawab :

A = ε . b. C

A = 5.103 L/molcm . 2 cm . 2,49.10-5 mol/L

A = 0,249

A = log 1/T

0,249 = log 1/T

T = 0,5636

%T = T x 100%

%T = 0,5636 x 100% = 56,36%

19

3. . Diket : λ = 272 nm

b = 1 cm

A = 0,45

BM = 118

Dit : A dan ε..?

Jawab :

A = a . b . c

a = A

b . c

a = 0,450

1 . 0,0274

a = 16,423 L/grcm

konsentrasi lar. Dalam molaritas:

ppm = M x Mr x 1000

27,4 ppm = M x 118 x 1000

M = 2,32 . 10-4 M

A = ε . b . c

0,450 = ε . 1. 2,32. 10-4 mol/L

ε = 1,94. 103 L/molcm

20

BAB III

PENUTUP

III.1 Kesimpulan

1. Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) itu merupakan adalah

pengukuran energi cahaya oleh suatu sistem kimia pada panjang

gelombang tertentu.

2. Faktor-faktor yang mempengaruhi serapan dalam spektrofotmetri UV-

VIS diantaranya Jenis Pelarut, tebal kuvet, kadar larutan dan lebar celah.

3. Polaritas pelarut yag dipakai akan sangat mempengaruhi terhadap

pergeseran spektrum molekul yang dianalisis.

4. Pelarut yang sering dipakai dalam analisis spektrofotometri UV-vis

diantaranya adalah air, etanol, sikloheksana dan isopropanol.

5. Ada 2 metode yang digunakan dalam analisa kuantitatif suatu senyawa

dengan spektrofotometer yaitu metode kurva kalibrasi dan metode one

point.

6. spektrofotometer UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif

dikarenakan pengukuran spektrofotometri menggunakan alat

spektrofotometer yang melibatkan energi elektronik yang cukup besar

pada molekul yang dianalisis.

7. Fluoresensi adalah proses pemancaran radiasi cahaya oleh suatu materi

setelah tereksitasi oleh berkas cahaya berenergi tinggi.

8. Fosforesensi merupakan pemancaran kembali sinar oleh molekul yang

telah menyerap energi sinar dalam waktu yang relatif lebih lama (10-4

detik). Jika penyinaran kemudian dihentikan, pemancaran kembali masih

dapat berlangsung.

9. zat berfluororesensi hanya dapat terlihat menyala apabila dikenai dengan

sinar ultraviolet di dalam gelap, dan tidak dapat berpendar ketika sinar

ultravioletnya dimatikan.

21

DAFTAR PUSTAKA

Anonim.2013. Makalah Spektofotometri UV VIS.

http://andriyanto507.blogspot.com/2013/12/makalah-spektrofotometri-uv-

vis-infra.html. Diakses 19 April 2014 pukul 22.00 WIB

Anonim. 2012. Spektofotometer UV VIS. http://aaknasional.

wordpress.com/2012/ 06/08/spektrofotometer-uv-vis/ Diakses Diakses 19

April 2014 pukul 22.00 WIB

Anonim. 2012. Spektrofotometri. UV http://silvana-

nina.blogspot.com/2012/04/spektrofotometri-uv.html. Diakses 19 April

2014 pukul 22.00

Grace. 2011. Metode One Point Pada Analisis dengan Spektofotometri UV-Vis. (online). ( http://grace107.blogspot.com/2011/02/0434-angka-ajaib-spektrofotometri-uv.html#ixzz2zQRdWSiH , diakses pada 20/4/2014 pukul 15.30).

Lyrawati, Diana. 2004. Jurnal Kedokteran Brawijaya, Vol. XX, No.3,.Dna Transfection Into Cellular Mitochondria Of Murine _-Pancreas And Human Primary Myoblast Cells: Steps Toward Genetic Engineering Of Mtdna And Gene Therapy. Laboratrium Farmasi FK Universitas Brawijaya: Malang.

Neng. 2010. Spektofotometri UV-VIS. (online). (http://storiku.wordpress.com/2010/07/02/spektrofotometri-uv-vis/, diakses pada 19/4/2014 pukul 19:30.

Saptutri, Fatma. 2013. Fluoresensi dan Fosforesensi. (online). (http://fatmasaputrihinata.blogspot.com/ , diakses pada 19/42014 pukul 20:36)

Wuryanti dkk.2000. Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi.Penentuan aktivitas spesifik Tirosinase dari Kentang Solanum Tuberosum. Laboratorium biokimia Universitas Sriwijaya : Semarang.

22

23